張國祥

采用SMART技術(shù)克隆HDAC抑制劑抗腫瘤效應(yīng)核心作用靶點的研究

張國祥

目的探討通過自我監(jiān)測、分析及報告技術(shù)(SMART技術(shù))尋找抵抗組蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制劑抗腫瘤的效應(yīng)基因。方法曲古柳菌素(TSA)誘導(dǎo)乳腺癌細胞MCF-7凋亡30例, 收集不同時段凋亡細胞提取信使核糖核酸(mRNA), 構(gòu)建反義互補脫氧核糖核酸(cDNA)文庫, 篩選出陽性轉(zhuǎn)染細胞克隆, 提取Hirt DNA, 轉(zhuǎn)化感受態(tài)細菌測序, 選擇核心靶位基因, 探討作用機制。結(jié)果建立反義cDNA文庫, Annexin V作用丁酸鈉選擇性誘導(dǎo)MCF-7不同時間段凋亡率與HEF比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)論采用SMART技術(shù)克隆HDAC抑制劑抗腫瘤效應(yīng)核心作用強。

SMART技術(shù)；組蛋白去乙?；敢种苿?；抗腫瘤；作用靶點

1 材料與方法

1.1試驗器材與試驗材料 人乳腺癌細胞株MCF-7, 人宮頸癌細胞株HeLa, 正常乳腺上皮細胞MCF-10A均購于美國物種保存中心。

1.2方法

1.2.1AnnexinV誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡特異性檢測 試驗AnnexinV誘導(dǎo)MCF-7、HeLa、HEF細胞凋亡不同時間段的凋亡率, 采用MTT檢測各濃度作用后0、24、48、72 h MCF-7、HeLa、HEF細胞生長曲線及凋亡率的變化。

1.2.2MTT法 胰酶消化處于對數(shù)生長期MCF-7細胞, 后微量加樣器吸取100 μl消化后的MCF-7細胞加入96孔板中。顯微鏡下觀察細胞貼壁生長后, 采用二甲基亞砜(DMSO)以及不同濃度的TrichostatinA 5%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基進行稀釋, 在0、24、48、72 h各個時段將一個孔板中的培養(yǎng)液棄去, 加入100 μl MTT溶液或孔后放置于37℃孵育箱中孵育, 時間持續(xù)為6 h。后將上清液凈化棄去, 微量加樣器將150 μl DMSO加入孔板中, 輕輕振蕩, 后采用Biotek酶標(biāo)儀在波長為570 nm處測定溶液OD值。經(jīng)Tricho0statinA處理過的細胞在0、24、48、72 h時間段分別對細胞進行收集, Annexin-V雙染色, 染色成功后放置于流式細胞儀器中進行細胞凋亡數(shù)量的檢測。

1.2.3Annexin V雙染色法 在經(jīng)處理后的MCF-7、HeLa、HEF細胞培養(yǎng)0、24、48、72 h, 分別用0.25%胰酶消化, 進行PBS洗滌1次, 調(diào)節(jié)細胞密度至106/ml, 取100 μl細胞懸液放置于EP管中, 加入5.0 μl的Annexin V溶液丁酸鈉選擇性后閉光靜置15 min, 加入200 μl banding buffer終止, 后靜置60 min內(nèi)上機進行檢測。

1.2.4反義cDNA文庫的構(gòu)建 主要包括細胞模型的處理和細胞的收集, mRNA提取, cDNA第一鏈和第二鏈的合成, cDNA末端補平和接頭的連接, cDNABamH I/HindIII雙酶切, pCEP4的BamH I/HindIII雙酶切, 點轉(zhuǎn)感受態(tài)細胞的制備, cDNA和pCEP4的連接和轉(zhuǎn)化, 重組克隆的鑒定和庫容分析,文庫DNA提取和純化。

1.2.5HDAC抑制劑作用的核心作用靶點 將測序結(jié)果中檢測出的已知基因結(jié)合生物學(xué)信息學(xué)分析, 選擇出16個進行效應(yīng)的驗證, 主要方法包括16個克隆提取質(zhì)粒, 采用電擊轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)染HeLa細胞, TrichostatinA篩選細胞克隆, 加入不同濃度進行篩選, pCEP4-CAT轉(zhuǎn)染細胞作為TrichostatinA作用的對照細胞, 查找HDAC抑制劑抗腫瘤效應(yīng)核心作用靶點。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示, 采用t檢驗；計數(shù)資料采用χ2檢驗。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

Annexin V作用丁酸鈉選擇性誘導(dǎo)MCF-7、HeLa、HEF細胞不同時間凋亡率比較, 差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。見表1。

表1 Annexin V作用丁酸鈉選擇性誘導(dǎo)MCF-7、HeLa、HEF細胞不同時間凋亡率

表1 Annexin V作用丁酸鈉選擇性誘導(dǎo)MCF-7、HeLa、HEF細胞不同時間凋亡率

注：與HEF比較,aP＜0.05

細胞類型0 h24 h48 h72 h HEF 5.7±1.2 7.7±2.310.3±2.511.5±3.6 HeLa10.6±2.516.4±2.542.1±4.6a89.0±4.4aMCF-712.3±2.428.8±3.4a53.1±2.2a78.2±3.3a

3 小結(jié)

通過建立細胞的反義基因表達文庫并將文庫轉(zhuǎn)入細胞的方法, SMART同目前通用的基因差異表達分析方法不同, 注重從功能角度分離效應(yīng)基因, 無論基因表達變化多么復(fù)雜,均能精確找到關(guān)鍵的效應(yīng)基因。該技術(shù)為克隆HDAC抑制劑的效應(yīng)分子, 提供了一種合理、可靠的技術(shù)手段。

管cDNA噬菌體文庫及芋螺毒素新基因的克隆.中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報, 2012, 28(5):484-488.

［2］ 周劍鋒, 劉文勵.ATM缺失介導(dǎo)的U937細胞凋亡敏感性增強依賴于異常的細胞周期蛋白依賴性激酶.中華血液學(xué)雜志, 2002, 15(1):16.

2014-06-04］

510370 廣州市荔灣區(qū)人民醫(yī)院

［1］ 李寶珠, 高炳淼, 吳勇, 等.利用SMART技術(shù)構(gòu)建疣縞芋螺毒