楊清艷，蔡傳濤，劉貴周，文 平

(1.中國科學院西雙版納熱帶植物園，云南 昆明 650223；2.中國科學院大學，北京 100049；3.大方縣九龍?zhí)炻殚_發(fā)有限公司，貴州 大方 551600)

黔西北蜜環(huán)菌的誘變選育與母種培養(yǎng)基篩選*

楊清艷1,2，蔡傳濤1**，劉貴周1，文 平3

(1.中國科學院西雙版納熱帶植物園，云南 昆明 650223；2.中國科學院大學，北京 100049；3.大方縣九龍?zhí)炻殚_發(fā)有限公司，貴州 大方 551600)

為解決黔西北蜜環(huán)菌菌種退化造成的天麻減產(chǎn)問題，首次對其進行誘變選育和母種培養(yǎng)基篩選，結(jié)果表明，接種菌索部位在尖端0～1.0 cm時生長最好；氨水的誘變效果最好，1%氨水誘變2 min獲得穩(wěn)定遺傳的優(yōu)良突變株；最適合優(yōu)良突變株生長的培養(yǎng)基配方為葡萄糖20 g、黃豆粉20 g、馬鈴薯200 g、瓊脂15 g、磷酸二氫鉀2 g，水1 000 mL，pH自然。

蜜環(huán)菌；菌索；誘變選育；培養(yǎng)基篩選

蜜環(huán)菌(Armillariamellea)別名蜜環(huán)蕈、榛蘑、青岡蕈，屬于真菌門、擔子菌亞門、層菌綱、傘菌目、口蘑科、蜜環(huán)菌屬真菌[1，2]。蜜環(huán)菌是一類經(jīng)濟價值較高的大型真菌，分布極廣，包括果園、葡萄園、森林地區(qū)[3，4]和城市地區(qū)[5-7]，對樹木有較強的侵染性[8]，為名貴中藥天麻(GastrodiaelataBl.)和豬苓(Grifolaumbellata)生長繁殖所必需。

天麻沒有根、莖、葉的分化，因此它不能通過根吸收營養(yǎng)，不能進行光合作用，天麻原球莖需要蜜環(huán)菌侵入原球莖提供營養(yǎng)才能發(fā)育成成體球莖。目前野生天麻被大量采挖，資源短缺，進行仿野生種植成為開發(fā)天麻市場、提高天麻產(chǎn)量的重點，然而選育出當?shù)貎?yōu)良的蜜環(huán)菌菌株成為天麻仿野生栽培綜合配套技術(shù)研究的瓶頸。

天麻栽培的蜜環(huán)菌連續(xù)無性繁殖，菌種會發(fā)生嚴重退化，從而導致天麻的產(chǎn)量和天麻素質(zhì)量分數(shù)急劇下降[9]，黔西北天麻栽培所用的蜜環(huán)菌已出現(xiàn)生長速度慢、菌索細、易被雜菌抑制甚至殺死、抗旱能力差等缺陷，這些問題嚴重影響了天麻的產(chǎn)量和品質(zhì)，仿野生栽培中出現(xiàn)菌索過細、“空窩”、菌索過早干枯等狀況。所以，選育出黔西北適合于天麻栽培的蜜環(huán)菌優(yōu)良菌株，已成為提高天麻產(chǎn)量與品質(zhì)的迫切問題。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

貴州省畢節(jié)市大方縣九龍?zhí)炻殚_發(fā)有限公司采自野生天麻生長地青岡樹根的野生蜜環(huán)菌菌索，已應用于當?shù)靥炻樵耘唷?/p>

1.2 培養(yǎng)基

配方1：麥麩30 g、葡萄糖20 g、磷酸二氫鉀1.5 g、瓊脂18 g，水1 000 mL，pH自然；配方2：玉米粉120 g、黃豆粉20 g、蔗糖20 g、瓊脂15 g，水1 000 mL，pH自然；配方3：麥芽糖20 g、瓊脂20 g，水1 000 mL，pH自然；配方4：馬鈴薯(削皮，下同)200 g、麥麩30 g、瓊脂20 g，水1 000 mL，pH自然；配方5：麥麩50 g、玉米粉100 g、葡萄糖10 g、瓊脂5 g，水1 000 mL，pH自然；配方6：胡蘿卜150 g、葡萄糖20 g、硫酸鎂1 g、瓊脂20 g，水1 000 mL，pH自然；配方7：馬鈴薯100 g、木屑30 g、玉米粉60 g、瓊脂10 g、磷酸二氫鉀1.5 g、硫酸鎂1 g、維生素B1 10 mg，水1 000 mL，pH自然；配方8：麥芽糖10 g、葡萄糖10 g、蛋白胨4 g、磷酸二氫鉀0.46 g、磷酸氫二鉀1 g、硫酸鎂1 g、瓊脂20 g，水1 000 mL，pH自然；配方9：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、芝麻粉20 g、玉米粉10 g、磷酸二氫鉀2 g、硫酸鎂1.5 g，水1 000 mL，pH自然；配方10：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、磷酸二氫鉀1 g、硫酸鎂1.5 g、蛋白胨5 g、瓊脂20 g，水1 000 mL，pH自然；配方11：葡萄糖20 g、黃豆粉20 g、馬鈴薯(削皮)200 g、瓊脂15 g、磷酸二氫鉀2 g、水1 000 mL，pH自然；PDA培養(yǎng)基：葡萄糖20 g、馬鈴薯200 g、瓊脂18 g，水1 000 mL，pH自然。

1.3 蜜環(huán)菌菌索分離

嚴格無菌條件下，用無菌水清洗蜜環(huán)菌5次，用接種剪從尖端開始剪成相同長度，不同部位的0.5 cm(0 cm～0.5 cm，0.5 cm～1.0 cm，1.0 cm～1.5 cm，1.5 cm～2.0 cm)，放入0.1%L汞溶液中浸泡約2 min，取出后再用無菌水沖洗5次，用無菌濾紙吸凈表面水后，置于PDA培養(yǎng)皿上，每皿放置4段，每個取樣部位處理3個重復。25°C暗培養(yǎng)，每天對菌索不同菌索部位接種后菌索顏色、密度、分枝數(shù)和粗細等生長狀況進行觀察記錄。

1.4 蜜環(huán)菌化學試劑誘變選育

將蜜環(huán)菌母種擴繁備用，用氨水、亞硝酸鈉和硫酸二乙酯誘變蜜環(huán)菌菌索，將菌索幼嫩尖端切成2 mm小段，0.1% L汞溶液消毒1 min，置于培養(yǎng)皿中，去掉菌索皮層留下菌髓， 0.1%、0.5%和1%的氨水分別處理0.5 min、1 min和2 min，0.2%、0.4%和0.8%的硫酸二乙酯分別誘變1 min、3 min和5 min，0.02 mol·L-1、0.04 mol·L-1和0.08 mol·L-1的亞硝酸鈉分別誘變1 min、2 min和3 min，硫酸二乙酯誘變后用20%硫代硫酸鈉溶液終止反應，將誘變后的蜜環(huán)菌菌索、菌髓用無菌水沖洗5次，無菌濾紙吸干表面水分，接種到PDA平板。每種誘變劑分別選取未加誘變劑但其他處理一樣的菌索菌髓作對照組，所有處理均設(shè)3個重復，25℃避光培養(yǎng)。

每3天測量每組菌索的生長速率，直至菌索停止生長，最后計算菌索平均生長速率；觀察記錄菌索顏色、密度、粗細、分枝數(shù)等指標。

1.5 蜜環(huán)菌優(yōu)良突變株篩選及遺傳穩(wěn)定性檢測

從蜜環(huán)菌菌索平均生長速率和生長特征2個方向進行綜合考察篩選，選出菌索平均生長速率大、密度大、粗壯、所需萌發(fā)時間短和分枝多的菌株作為優(yōu)良突變株，將其接種到PDA培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)3次，觀察其生長速率、分枝數(shù)、顏色、粗細等性狀能否穩(wěn)定遺傳，若穩(wěn)定，則作為培養(yǎng)基篩選的起始菌株。

1.6 蜜環(huán)菌優(yōu)良突變株培養(yǎng)基篩選

將誘變所得的穩(wěn)定遺傳優(yōu)良突變株在嚴格無菌條件下截取幼嫩菌索按照1.4的消毒接種方法進行擴大培養(yǎng)，培養(yǎng)得到的大量菌索供培養(yǎng)基篩選用。

截取幼嫩菌索尖端接種到1.2的12種不同組成的培養(yǎng)基上，每種配方處理3個重復。25°C避光培養(yǎng)，觀察記錄。

2 結(jié)果與分析

2.1 蜜環(huán)菌菌索取樣部位篩選

蜜環(huán)菌菌索不同取樣部位的生長特征見表1。

表1 蜜環(huán)菌菌索不同取樣部位的生長特征

注：分枝數(shù)(個)：+表示0～10個； ++表示11個～20個； +++表示21個～30個。

不同菌索段接種后的生長特征差異比較大，根據(jù)表1可以分析出，接種尖端1.0 cm以內(nèi)的菌索才能保證蜜環(huán)菌菌索的正常生長和后續(xù)試驗的可重復性。

2.2 蜜環(huán)菌化學誘變選育

2.2.1 菌索萌發(fā)率測定

菌株經(jīng)化學試劑誘變后有11組菌索未萌發(fā)，共處理27組，因此萌發(fā)率為59.26%。

2.2.2 不同誘變劑處理后的生長特征

經(jīng)3種誘變劑誘變后，根據(jù)粗細、密度、分枝數(shù)、顏色和平均生長速率等生長特征見表2和表3。

由表2、表3可以初步分析出氨水誘變效果最好，其次是亞硝酸鈉，硫酸二乙酯誘變效果最差。比較表2生長特征，其中0.1%氨水0.5 min、0.1%氨水1 min、0.1%氨水2 min、1%氨水2 min、0.04 mol·L-1亞硝酸鈉2 min、0.08 mol·L-1亞硝酸鈉1 min和0.08 mol·L-1亞硝酸鈉2 min菌索粗細和密度優(yōu)于其他處理組。

2.2.3 不同誘變劑處理后的平均生長速率

方差分析顯示，菌索經(jīng)不同誘變劑處理后平均生長速率的差異顯著(p<0.05)，除了0.1%氨水0.5 min和0.08 mol·L-1亞硝酸鈉3 min，其他處理組與各自對照組的差異均顯著(p<0.05)。

如表3所示，0.08 mol·L-1亞硝酸鈉誘變1 min后菌索生長速率最大，其次是1%氨水2 min、0.1%氨水1 min、0.5%氨水0.5 min、0.5%氨水2 min、0.04 mol·L-1亞硝酸鈉2 min。

從天麻栽培中所需蜜環(huán)菌生長特性角度出發(fā)，首先需要篩選出菌索平均生長速率大的突變株，結(jié)合菌索粗細、密度、分枝數(shù)、萌發(fā)時間和色澤幾個指標，最終篩選出0.08 mol·L-1亞硝酸鈉1 min、0.1%氨水1 min和1%氨水2 min 3種最佳誘變條件，得到3株優(yōu)良突變株。

2.3 優(yōu)良突變株的遺傳穩(wěn)定性試驗

對蜜環(huán)菌誘變后篩得的3株優(yōu)良突變株進行遺傳穩(wěn)定性試驗，繼代培養(yǎng)3次，發(fā)現(xiàn)3個突變株的生長特性均能穩(wěn)定地遺傳，1%氨水2 min的遺傳穩(wěn)定性最高，3次繼代培養(yǎng)中各生長特征無變化。

表2 蜜環(huán)菌菌索經(jīng)不同誘變處理后的生長特征

注：分枝數(shù)(個)： +表示0～10個； ++表示11個～20個； +++表示21個～30個； ++++表示30個～40個。下同。

表3 蜜環(huán)菌菌索經(jīng)不同誘變處理后的平均生長速率

注：與對照組比較，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，ns差異不顯著。下同。

2.4 蜜環(huán)菌優(yōu)良突變株母種培養(yǎng)基篩選

遺傳最為穩(wěn)定的優(yōu)良突變株(1%氨水誘變2 min)，在不同配方上菌株生長特性差異顯著。蜜環(huán)菌生長特征見表4。

由表4可見，配方1、配方2、配方7、配方9和配方11的菌索密度、菌索粗細和菌索分枝數(shù)均大于其他配方，菌索萌發(fā)時間均小于其他培養(yǎng)基配方。方差分析顯示見表5。

由表5可見，除配方2，其他配方與對照組的差異均顯著(p<0.05)，配方7的菌索平均生長速率最大，其次是配方9、配方11和配方6。以菌索平均生長速率為主要篩選指標，結(jié)合菌索密度、粗細、分枝數(shù)和色澤，最終得出配方7、配方9和配方11 3種培養(yǎng)基配方均適合蜜環(huán)菌優(yōu)良突變株生長，其中配方7最佳。

從配方成分上分析，葡糖糖和馬鈴薯是較為理想的碳源和氮源，再添加玉米粉、芝麻粉、黃豆粉能使菌索更為粗壯，添加適量的無機鹽可以加快菌索生長。

表4 蜜環(huán)菌優(yōu)良突變株在不同培養(yǎng)基上的生長特征

表5 蜜環(huán)菌優(yōu)良突變株在不同培養(yǎng)基上的菌索平均生長速率

3 討論

目前蜜環(huán)菌的相關(guān)研究主要集中在蜜環(huán)菌多糖等成分研究[10-12]和分離純化方面[13，14]，而在選育方面研究極少，蜜環(huán)菌進行多代天麻栽培后出現(xiàn)明顯的菌種退化與變異，如用已發(fā)生退化的菌種拌栽天麻則導致天麻產(chǎn)量與品質(zhì)急劇下降[15]。同時，趙俊[16]等研究表明，由于全國各個地區(qū)天麻種類不同，跨區(qū)域引進菌種或推廣是極不科學的。本研究加大了對黔西北本地天麻共生蜜環(huán)菌的研究力度，從優(yōu)良菌種選育到培養(yǎng)基篩選等方面進行全面探討。

化學誘變更多的是引起分子水平上的變化，對生物分子的影響通常是個別、局部的，不易引起染色體畸變或損傷， 因此，產(chǎn)生點突變的比例高，突變譜的穩(wěn)定性好[17，18]，化學誘變還有突變頻率高、特異性強等特點[19]。試驗中發(fā)現(xiàn)氨水對蜜環(huán)菌誘變效果較好。亞硝酸鈉有一定的誘變效果，但不如氨水明顯，可能是由于誘變劑濃度和時間不合適。硫酸二乙酯的誘變效果差，致死率接近100%。

本研究對黔西北天麻栽培所用的蜜環(huán)菌進行了分離純化、誘變選育和母種培養(yǎng)基篩選，得到了菌索平均生長速率大、密度大、萌發(fā)時間短、菌索粗壯、分枝數(shù)多、菌索色澤好和遺傳性狀穩(wěn)定的優(yōu)良突變株及其合適的母種培養(yǎng)基配方，關(guān)于黔西北蜜環(huán)菌的抗旱、抗雜菌污染能力等尚需進一步開展研究。

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Mutation Breeding and Medium Screening ofArmillariamelleain Northwestern Guizhou

YANG Qing-yan1,2, CAI Chuan-tao1, LIU Gui-zhou1, WEN Ping3

(1.Xishuangbanna Tropical Botanical Garden, KunmingYunnan650223; 2.University of Chinese Academy of Sciences,Beijing100049; 3.Dafang Gastrodia Elata Development Company, LTD, DafangGuizhou551700)

In order to solve the problem ofGastrodiaelataBlume’s yield drawdown caused by degradation ofArmillariamelleain northwestern Guizhou, mutation breeding and medium screening ofArmillariamelleawere studied for the first time. The results suggested thatArmillariamellea’sgrowth was better when the transferring part was 0～1.0 cm from the top end of rhizomorphs. It was proved that NH3·H2O was the most effective mutagen. The best induced mutation conditions were found: 1%NH3·H2O induced 2 min. The optimal culture medium for high-quality mutants was glucose 20 g, soybean meal 20 g, potato 200 g, agar 15 g, KH2PO42 g, H2O 1 000 mL, natural pH.

Armillariamellea; Rhizomorph; Mutation breeding; Medium optimization

*項目來源：國家科技支撐計劃課題“喀斯特山區(qū)生態(tài)環(huán)境保護與植物類中藥材開發(fā)關(guān)鍵技術(shù)研究與示范”(2007BAD53B04)；貴州省科技廳畢節(jié)市人民政府中科院昆明分院科技合作項目“天麻栽培中替代菌材與野生萌發(fā)菌研究及其成果示范”(省地院合2011-5)。

楊清艷(1988-)，女，在讀碩士研究生，主要從事藥用植物栽培研究。E-mail：lindy7286@126.com

**通信作者： 蔡傳濤，研究員，研究方向：主要從事藥用植物栽培研究。E-mail：caict@xtbg.ac.cn

2014-03-30

S646.9

A

1003-8310(2014)03-0012-04