李徐奇，雷建軍，徐勤鴻，段萬(wàn)星，盛 薇，王 康，魏光兵

(西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院：1．普通外科；2．肝膽外科，陜西西安 710061)

◇基礎(chǔ)研究◇

Gli-1在缺氧誘導(dǎo)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)分化中的重要作用

李徐奇1，雷建軍2，徐勤鴻2，段萬(wàn)星2，盛 薇1，王 康1，魏光兵1

(西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院：1．普通外科；2．肝膽外科，陜西西安 710061)

目的 探討Gli-1在缺氧誘導(dǎo)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)分化(EMT)及侵襲中的重要作用。方法 通過(guò)缺氧培養(yǎng)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞，以常氧培養(yǎng)作為對(duì)照。Transwell小室侵襲試驗(yàn)檢測(cè)各組MDA-MB-231細(xì)胞的侵襲能力；Western blot檢測(cè)HIF-1α、Gli-1、E-Cadherin和vimentin蛋白的表達(dá)水平。通過(guò)shRNA穩(wěn)定轉(zhuǎn)染乳腺癌細(xì)胞，再次通過(guò)Transwell小室侵襲試驗(yàn)檢測(cè)缺氧對(duì)乳腺癌細(xì)胞侵襲能力的影響，Western blot檢測(cè)HIF-1α、Gli-1、E-Cadherin和vimentin蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果 缺氧可明顯誘導(dǎo)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞侵襲，并上調(diào)HIF-1α、Gli-1和vimentin蛋白，下調(diào)E-cadherin蛋白。靶向沉默Gli-1基因后，缺氧失去了對(duì)乳腺癌細(xì)胞侵襲和EMT的誘導(dǎo)作用。結(jié)論 缺氧通過(guò)上調(diào)Gli-1表達(dá)活化Hedgehog通路，誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞侵襲及EMT過(guò)程。

乳腺癌；侵襲；上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)分化；缺氧；Gli-1；Hedgehog通路

腫瘤細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)分化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)是腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的一個(gè)關(guān)鍵過(guò)程[1]，是腫瘤細(xì)胞以上皮表型向狹長(zhǎng)狀成纖維樣表型轉(zhuǎn)化，以獲得間質(zhì)表型的復(fù)雜過(guò)程。EMT是啟動(dòng)惡性腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的重要途徑之一，最終導(dǎo)致細(xì)胞活性和侵襲性增強(qiáng)。在EMT特征獲得過(guò)程中細(xì)胞喪失上皮細(xì)胞-細(xì)胞間連接，細(xì)胞-細(xì)胞接觸的蛋白如E-Cadgerin等的下調(diào)，和獲得間質(zhì)標(biāo)志如vimentin等蛋白的表達(dá)上調(diào)。大量研究表明，在包括結(jié)腸癌、乳腺癌、前列腺癌及肝癌等多種腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程中均可觀察到EMT的發(fā)生，而且發(fā)生EMT的癌細(xì)胞數(shù)量直接與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移程度相關(guān)[2-4]。

缺氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia inducible factor-1α, HIF-1α)作為一種氧應(yīng)答調(diào)控因子，在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程中起著關(guān)鍵的作用[5]。研究顯示，EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子在低氧微環(huán)境中存在過(guò)表達(dá)，這些轉(zhuǎn)錄因子的上調(diào)可能是由HIF-1α所介導(dǎo)的[6]。然而到目前為止，缺氧誘導(dǎo)腫瘤發(fā)生EMT從而促進(jìn)侵襲的具體分子機(jī)制仍不清楚。本研究旨在通過(guò)靶向沉默乳腺癌細(xì)胞的Gli-1基因，探討Gli-1在缺氧誘導(dǎo)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞EMT過(guò)程中的重要作用。

1 材料與方法

1.1 材料與分組 人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命研究所。DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基、胰蛋白酶購(gòu)自Hyclone公司；胎牛血清購(gòu)自杭州四季青公司；兔抗人HIF-1α、Gli-1、E-Cadherin和vimentin多克隆抗體均購(gòu)自Bioworld公司；鼠抗人β-actin單克隆抗體，HRP標(biāo)記山羊抗鼠IgG、山羊抗兔IgG二抗均購(gòu)自北京中衫金橋公司；聚偏二氟乙烯膜(PVDF膜)，Transwell小室均購(gòu)自Millipore公司；Gli-1 shRNA和對(duì)照shRNA Control質(zhì)粒購(gòu)自上海吉瑪公司，Gli-1 shRNA的有效序列為5′-GGCUCAGCUUGUGUGUAAUTT-3′；轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000購(gòu)自Invitrogen公司；PCR引物合成于北京鼎國(guó)生物公司；Real-time PCR試劑盒購(gòu)自大連TaKaRa公司。實(shí)驗(yàn)分組：常氧對(duì)照組(Normoxia)，缺氧組(Hypoxia)，常氧+對(duì)照shRNA干擾組(Normoxia+sh-vector)，常氧+Gli-1 shRNA干擾組(Normoxia+sh-Gli-1)，缺氧+對(duì)照shRNA干擾組(Hypoxia+sh-vector)，缺氧+Gli-1 shRNA干擾組(Hypoxia+sh-Gli-1)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231于含100 mL/L胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，37 ℃、50 mL/L CO2培養(yǎng)，2～3 d用2.5 g/L胰酶消化傳代。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。參照Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染48 h后消化細(xì)胞，按1∶6接種于6孔板后加600 μg/mL G418進(jìn)行穩(wěn)定轉(zhuǎn)染篩選，每2～3 d換液1次。14 d后，出現(xiàn)多個(gè)G418抗性的克隆，由于質(zhì)粒帶有綠色熒光蛋白GFP的表達(dá)，在熒光顯微鏡下可看到帶綠色熒光的陽(yáng)性克隆。顯微鏡下挑取帶綠色熒光的單個(gè)克隆移入24孔培養(yǎng)板，繼續(xù)G418維持培養(yǎng)，經(jīng)過(guò)4周可以獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞克隆。

1.3 Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn) 按實(shí)驗(yàn)?zāi)康模瑢⒓?xì)胞在常氧條件(200 mL/L O2)或缺氧條件(10 mL/L O2)下培養(yǎng)24 h。以預(yù)冷的DMEM與Matrigel膠1∶1稀釋后，取100 μL稀釋膠加到Transwell上層小室中，于37 ℃孵育6 h。收集各組細(xì)胞，按5×104個(gè)/mL的細(xì)胞密度100 μL接種于Transwell上層小室。含100 mL/L胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基500 μL加入Transwell下層小室，置于37 ℃、50 mL/L CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。用棉簽沾PBS輕輕地擦去小室上層聚碳酸酯膜上貼壁生長(zhǎng)但未能穿過(guò)膜的細(xì)胞。將膜取出固定10 min，1 g/L的結(jié)晶紫染色30 min后小心洗去。200倍放大倍數(shù)下隨機(jī)觀察并計(jì)10個(gè)視野內(nèi)穿過(guò)聚碳酸酯膜的細(xì)胞數(shù)，照相記錄。重復(fù)3次。

1.4 蛋白印記法(Western blot)檢測(cè)蛋白表達(dá) 選擇生長(zhǎng)良好的細(xì)胞1×107個(gè)，蛋白裂解液裂解細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度。SDS-PAGE凝膠電泳，半干轉(zhuǎn)膜法轉(zhuǎn)至PVDF膜；50 g/L脫脂牛奶室溫封閉1 h；加一抗稀釋液4 ℃孵育過(guò)夜；TBST緩沖液洗膜后加入二抗稀釋液室溫孵育1 h；ECL化學(xué)發(fā)光，暗室顯影。

1.5 PCR檢測(cè)mRNA的轉(zhuǎn)錄 用Trizol-氯仿-異丙醇法提取各組細(xì)胞總RNA。取5 μg按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板PCR擴(kuò)增HIF-1α、Gli-1、E-Cadherin和vimentin，以GAPDH為內(nèi)參照。各基因引物序列如下：HIF-1α：5′-AAGTCTAGGGATGCAGCA-3′，5′-CAAGATCACCAGCATCATG-3′；Gli-1：5′-GGGATGATCCCACATCCTCAGTC-3′，5′-CTGGAGCAGCCCCCCCAGT-3′；E-Cadherin：5′-ATTCTGATTCTGCTGCTCTTG-3′，5′-AGTCCTGGTCCTCTTCTCC-3′；vimentin：5′-AATGACCGCTTCGCCAAC-3′，5′-CCGCATCTCCTCCTCGTAG-3′；GAPDH：5′-GTAAAGACCTCTATGCCATCA-3′，5′-GGACTCATC-GTACTCCTGCT3-3′。PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性94 ℃ 5 s，94 ℃ 30 s → 60 ℃ 30 s → 72 ℃ 30 s共40個(gè)循環(huán)；溶解曲線條件：95 ℃ 15 s → 60 ℃ 30 s → 95 ℃ 15 s?；蛳鄬?duì)表達(dá)水平通過(guò)ΔΔC(T)法計(jì)算。

2 結(jié) 果

2.1 缺氧顯著促進(jìn)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞的侵襲能力 Tanswell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，常氧對(duì)照組與缺氧組MDA-MB-231細(xì)胞穿過(guò)Transwell小室的細(xì)胞數(shù)分別為(45.88±4.99)個(gè)和(108.88±5.67)個(gè)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=8.16，P<0.01，圖1)。結(jié)果提示，缺氧能顯著促進(jìn)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞侵襲能力。

圖1 缺氧顯著促進(jìn)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞的侵襲

Fig.1 Hypoxia significantly promoted the invasion of breast carcinoma cell line MDA-MB-231A：常氧組；B：缺氧組，缺氧顯著促進(jìn)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞的侵襲；C：Transwell小室穿膜細(xì)胞計(jì)數(shù)。與常氧組比較，*P<0.05。

2.2 缺氧促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞侵襲與活化Gli-1并誘導(dǎo)細(xì)胞EMT有關(guān) 在常氧條件和缺氧條件下培養(yǎng)MDA-MB-231細(xì)胞24 h，Western blot檢測(cè)其蛋白表達(dá)。結(jié)果顯示，缺氧組MDA-MB-231細(xì)胞的HIF-1α蛋白水平(0.946±0.070)比常氧對(duì)照組(0.098±0.021)顯著上調(diào)(P<0.01，圖2A)。而Real-time PCR檢測(cè)未能發(fā)現(xiàn)缺氧組MDA-MB-231細(xì)胞的HIF-1α mRNA量與常氧對(duì)照組之間有明顯差異(P>0.05，圖2B)。

缺氧組的MDA-MB-231細(xì)胞Gli-1蛋白水平(0.685±0.053)較常氧對(duì)照組(0.263±0.014)明顯上調(diào)(P<0.05)、缺氧組vimentin蛋白水平(0.402±0.031)較常氧組(0.106±0.010)明顯上調(diào)(P<0.05)；然而，缺氧組E-Cadherin蛋白水平(0.435±0.042)較常氧組(0.982±0.062)顯著下調(diào)(P<0.05)。說(shuō)明缺氧促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞Gli-1表達(dá)并誘導(dǎo)細(xì)胞EMT。

2.3 特異性RNA干擾載體Gli-1 shRNA對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞Gli-1蛋白和mRNA表達(dá)的抑制作用

圖2 缺氧對(duì)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞HIF-1α、Gli-1、E-Cadherin和vimentin表達(dá)的影響

Fig.2 The effects of hypoxia on HIF-1α, Gli-1, E-Cadherin and vimentin expressions in MDA-MB-231 cell

A：缺氧培養(yǎng)的MDA-MB-231細(xì)胞的HIF-1α、Gli-1和vimentin蛋白比常氧培養(yǎng)時(shí)顯著上調(diào)，E-Cadherin顯著下調(diào)；B：缺氧培養(yǎng)的MDA-MB-231細(xì)胞的HIF-1α mRNA無(wú)明顯變化，Gli-1和vimentin mRNA比常氧培養(yǎng)時(shí)顯著上調(diào)，E-Cadherin mRNA顯著下調(diào)。與常氧組比較，*P<0.05。

Western blot結(jié)果顯示，常氧組、常氧+對(duì)照shRNA干擾組、常氧+Gli-1 shRNA干擾組的Gli-1蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為(0.529±0.070)、(0.506±0.074)和(0.095±0.010)，組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后Gli-1靶向沉默的細(xì)胞Gli-1蛋白表達(dá)受到了顯著的抑制，抑制率達(dá)81%(圖3A)。Real-time RT-PCR結(jié)果顯示，常氧組、常氧+對(duì)照shRNA干擾組、常氧+Gli-1 shRNA干擾組的Gli-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為(1.049±0.149)、(0.992±0.226)和(0.168±0.056)，組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后Gli-1靶向沉默的細(xì)胞Gli-1表達(dá)受到了顯著的抑制，抑制率為85%(圖3B)。

2.4 Gli-1沉默逆轉(zhuǎn)了缺氧對(duì)乳腺癌細(xì)胞侵襲的促進(jìn)作用 Transwell實(shí)驗(yàn)顯示，常氧+對(duì)照shRNA干擾組與缺氧+對(duì)照shRNA干擾組穿膜細(xì)胞數(shù)分別為35.125±13.611和106.500±19.310，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表明缺氧對(duì)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞有明顯的促進(jìn)侵襲作用；與此同時(shí)，常氧+Gli-1 shRNA干擾組與缺氧+Gli-1 shRNA干擾組穿膜細(xì)胞數(shù)分別為24.875±11.256和35.250±15.691，差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。表明當(dāng)乳腺癌細(xì)胞Gli-1被阻斷后，缺氧失去了對(duì)乳腺癌細(xì)胞的侵襲誘導(dǎo)作用(圖4)。本結(jié)果提示，Gli-1在缺氧促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞侵襲過(guò)程中扮演重要作用。

圖3 Gli-1靶向沉默對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞Gli-1表達(dá)的抑制作用

Fig.3 The inhibitory effect on shRNA targeting for Gli-1 on the expression of Gli-1 in MDA-MB-231 cell

A：Gli-1靶向沉默對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞Gli-1蛋白表達(dá)的抑制作用；B：Gli-1靶向沉默對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞Gli-1 mRNA表達(dá)的抑制作用。

圖4 缺氧促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞侵襲依賴于Gli-1

Fig.4 Hypoxia promoted the invasion of breast carcinoma cell by depending with Gli-1

A、C：常氧組；B、D：缺氧組，Transwell試驗(yàn)顯示，缺氧條件可誘導(dǎo)MDA-MB-231-sh-vector細(xì)胞侵襲，但對(duì)Gli-1靶向沉默后的MDA-MB-231-sh-Gli-1細(xì)胞沒(méi)有作用；E：Tranwell實(shí)驗(yàn)各組穿膜細(xì)胞數(shù)分析。與常氧組比較，*P<0.05。

2.5 缺氧通過(guò)上調(diào)Gli-1后誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞EMT 提取細(xì)胞總蛋白，經(jīng)Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)(圖5)，缺氧+對(duì)照shRNA干擾組與常氧+對(duì)照shRNA干擾組HIF-1α相對(duì)表達(dá)量分別為(0.286±0.043)、(0.981±0.065)、Gli-1的相對(duì)表達(dá)量分別為(0.247±0.023)、(0.633±0.040)、vimentin蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為(0.206±0.021)、(0.616±0.038)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，缺氧+對(duì)照shRNA干擾組與常氧+對(duì)照shRNA干擾組E-Cadherin蛋白水平分別是(0.967±0.071)、(0.293±0.036)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而缺氧+Gli-1 shRNA干擾組與常氧+Gli-1 shRNA干擾組比較，HIF-1α蛋白水平分別是(0.953±0.066)、(0.264±0.035)，盡管缺氧導(dǎo)致HIF-1α蛋白明顯上調(diào)(P<0.05)，但Gli-1蛋白的相對(duì)表達(dá)量分別為(0.106±0.013)、(0.098±0.018)，vimentin蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為(0.114±0.020)、(0.109±0.019)，E-Cadherin蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為(0.896±0.036)、(0.913±0.040)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。本結(jié)果說(shuō)明，Gli-1的激活是缺氧通過(guò)HIF-1α上調(diào)誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞EMT的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

圖5 Gli-1的激活是缺氧通過(guò)HIF-1α上調(diào)誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞EMT的關(guān)鍵環(huán)節(jié)

Fig.5 Activation of Gli-1 was the key to hypoxia’s inducing breast carcinoma cell EMT

3 討 論

乳腺癌是最常見的惡性腫瘤之一[7]，在我國(guó)居女性惡性腫瘤死亡率之首。其侵襲和轉(zhuǎn)移途徑多樣，是造成死亡率居高不下的重要原因[8]。大多數(shù)實(shí)體瘤具有缺氧的微環(huán)境，在腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中一個(gè)關(guān)鍵的步驟是腫瘤細(xì)胞對(duì)缺氧的適應(yīng)。缺氧微環(huán)境可通過(guò)調(diào)控多種基因表達(dá)，從而促進(jìn)惡性腫瘤發(fā)生浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移，其中HIF在這一過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

HIF-1由α和β亞基組成，其中HIF-1α是受氧分子調(diào)節(jié)的主要功能亞基。人體腫瘤組織中HIF-1α高水平表達(dá)，表達(dá)程度與腫瘤的進(jìn)展程度、轉(zhuǎn)移等正相關(guān)。HIF-1在常氧條件下不斷通過(guò)泛素-蛋白酶體途徑水解，在缺氧條件下則降解受阻而在胞質(zhì)內(nèi)聚集，隨后轉(zhuǎn)運(yùn)入核，與缺氧反應(yīng)元件結(jié)合，啟動(dòng)下游靶基因轉(zhuǎn)錄。最新研究表明，HIF-1α高表達(dá)能引起胰腺癌、卵巢癌、前列腺癌、膽囊癌、肝細(xì)胞癌等多種腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT特征的轉(zhuǎn)變，提高其侵襲轉(zhuǎn)移能力[9]。我們的研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞在缺氧條件下其侵襲能力顯著提高；同時(shí)發(fā)現(xiàn)，缺氧的乳腺癌細(xì)胞HIF-1α蛋白水平較正常對(duì)照顯著上調(diào)，但mRNA水平未明顯增高，說(shuō)明缺氧是從轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)細(xì)胞HIF-1α表達(dá)。

KRISHNAMACHARY等[10]發(fā)現(xiàn)，HIF-1α是腫瘤細(xì)胞EMT的一個(gè)重要上游信號(hào)，缺氧誘導(dǎo)的HIF-1α高表達(dá)激活Snail通路上調(diào)，導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生E-Cadherin等上皮標(biāo)志丟失和vimentin等間質(zhì)標(biāo)志獲得的EMT改變。我們檢測(cè)了MDA-MB-231細(xì)胞上皮細(xì)胞標(biāo)志性蛋白分子E-Cadherin和間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志性蛋白分子vimentin表達(dá)水平。通過(guò)Western blot觀察到，隨著缺氧誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞HIF-1α蛋白上調(diào)，隨之發(fā)生丟失E-Cadherin并獲得vimentin事件，即細(xì)胞失去上皮表型，開始向間質(zhì)表型轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致侵襲能力增強(qiáng)。

Hedgehog信號(hào)通路是乳腺癌發(fā)展的重要機(jī)制之一。在乳腺癌患者的組織中，該通路成員SHH、SMO、PTCH、Gli均高表達(dá)[11]，表明此通路的激活與乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)。配體SHH可與受體PTCH結(jié)合，解除PTCH對(duì)SMO的抑制，活化的SMO激活其下游轉(zhuǎn)錄因子Gli-1，Gli-1進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)促進(jìn)其下游基因轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞遷徙浸潤(rùn)[12]。因此，Gli-1不僅是Hedgehog信號(hào)通路的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，其上調(diào)激活也是該通路活化的標(biāo)志。研究發(fā)現(xiàn)[13]，在體內(nèi)外髓母細(xì)胞瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、乳腺癌、前列腺癌、基底細(xì)胞癌等均存在不經(jīng)過(guò)活化SMO，而直接激活Gli-1促進(jìn)腫瘤進(jìn)展的現(xiàn)象。此外，有報(bào)道提示，Hedgehog信號(hào)通路的活化可能與腫瘤細(xì)胞侵襲過(guò)程中的EMT轉(zhuǎn)變有關(guān)[14]。

為了阻斷乳腺癌細(xì)胞Hedgehog信號(hào)通路的活化，我們選擇了Gli-1基因沉默的方法。通過(guò)對(duì)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Gli-1 shRNA的MDA-MB-231細(xì)胞，利用Western blot和Real-time RT-PCR分別檢測(cè)對(duì)Gli-1蛋白和mRNA的抑制效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，抑制效率約70%～80%，與無(wú)效對(duì)照組和正常細(xì)胞Gli-1的表達(dá)具有明顯的差異性，說(shuō)明shRNA靶向沉默Gli-1基因的效果滿意。隨即Transwell小室實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Gli-1干擾的細(xì)胞和空載體對(duì)照細(xì)胞在缺氧條件下其侵襲行為的變化有著明顯的差異?？蛰d體對(duì)照細(xì)胞的侵襲能力能被缺氧誘導(dǎo)，而Gli-1干擾的乳腺癌細(xì)胞在常氧和缺氧條件下，其侵襲能力沒(méi)有明顯的變化。提示Hedgehog通路的活化是缺氧誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞侵襲中的一個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)。此外，我們又檢測(cè)了EMT相關(guān)分子的表達(dá)變化。我們發(fā)現(xiàn)，在Gli-1干擾的乳腺癌細(xì)胞中，盡管缺氧誘導(dǎo)了HIF-1α蛋白上調(diào)，但因?yàn)镚li-1蛋白上調(diào)被抑制，E-cadherin和vimentin的表達(dá)水平并未發(fā)生相應(yīng)變化。因此，可以認(rèn)為缺氧是通過(guò)活化Hedgehog通路來(lái)誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞發(fā)生EMT和增加其侵襲能力的。

綜上所述，我們運(yùn)用Gli-1沉默技術(shù)抑制乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞Gli-1表達(dá)，抑制Hedgehog通路活性，可以阻斷缺氧誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞EMT過(guò)程及侵襲能力上調(diào)，提示了Hedgehog通路在乳腺癌浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移機(jī)制中的重要作用。該通路的活化與乳腺癌的侵襲轉(zhuǎn)移潛能密切相關(guān)，并為其作為乳腺癌治療靶點(diǎn)的選擇提供了新的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

[1] ALDERTON GK. Metastasis: Epithelial to mesenchymal and back again[J]. Nat Rev Cancer, 2013, 13(1):3.

[2] OCANA OH, CORCOLES R, FABRA A, et al. Metastatic colonization requires the repression of the epithelial-mesenchymal transition inducer prrx1[J]. Cancer Cell, 2012, 22(6):709-724.

[3] LEI J, MA J, MA Q, et al. Hedgehog signaling regulates hypoxia induced epithelial to mesenchymal transition and invasion in pancreatic cancer cells via a ligand-independent manner[J]. Mol Cancer, 2013, 12:66-66.

[4] 李四光，劉凱歌，常遠(yuǎn)鴻. 肝星狀細(xì)胞經(jīng)趨化因子SDF-1/CXCR4軸途徑促進(jìn)肝癌細(xì)胞侵襲的作用及其機(jī)制[J]. 吉林大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版, 2013, 39(4):730-736.

[5] 巴云鵬，張曉，宋瑞彪. 喉鱗狀細(xì)胞癌組織中缺氧誘導(dǎo)因子-1和人表皮生長(zhǎng)因子受體2的表達(dá)[J]. 鄭州大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版, 2013, 48(1):100-102.

[6] TSAI YP, WU KJ. Hypoxia-regulated target genes implicated in tumor metastasis[J]. J Biomed Sci, 2012, 19(1):102-112.

[7] SIEGEL R, NAISHADHAM D, JEMAL A. Cancer Statistics, 2013[J]. CA Cancer J Clin, 2013, 63(1):11-30.

[8] 周燦，王珂，何建軍，等. 不同年齡段女性乳腺癌患者臨床病理特征的回顧性分析[J]. 西安交通大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版, 2013, 34(1):133-137.

[9] JIAO M, NAN KJ. Activation of PI3 kinase/Akt/HIF-1alpha pathway contributes to hypoxia-induced epithelial-mesenchymal transition and chemoresistance in hepatocellular carcinoma[J]. Int J Oncol, 2012, 40(2):461-468.

[10] KRISHNAMACHARY B, ZAGZAG D, NAGASAWA H, et al. Hypoxia-inducible factor-1-dependent repression of E-cadherin in von Hippel-Lindau tumor suppressor-null renal cell carcinoma mediated by TCF3, ZFHX1A, and ZFHX1B[J]. Cancer Res, 2006, 66(5):2725-2731.

[11] SIMS-MOURTADA J, YANG D, TWOROWSKA I, et al. Detection of canonical hedgehog signaling in breast cancer by 131-iodine-labeled derivatives of the sonic hedgehog protein[J]. J Biomed Biotechnol, 2012, 2012:639562-639570.

[12] LI X, MA Q, XU Q, et al. SDF-1/CXCR4 signaling induces pancreatic cancer cell invasion and epithelial-mesenchymal transition in vitro through non-canonical activation of Hedgehog pathway[J]. Cancer Lett, 2012, 322(2):169-176.

[13] LI X, MA Q, DUAN W, et al. Paracrine sonic hedgehog signaling derived from tumor epithelial cells: a key regulator in the pancreatic tumor microenvironment[J]. Crit Rev Eukaryot Gene Expr, 2012, 22(2):97-108.

[14] TANG SN, FU J, NALL D, et al. Inhibition of sonic hedgehog pathway and pluripotency maintaining factors regulate human pancreatic cancer stem cell characteristics[J]. Int J Cancer, 2012, 131(1):30-40.

(編輯 卓選鵬)

The important role of Gli-1 in hypoxia-induced epithelial-mesenchymaltransition of breast cancer cell line MDA-MB-231

LI Xu-qi1, LEI Jian-jun2, XU Qin-hong2, DUAN Wan-xing2,SHENG Wei1, WANG Kang1, WEI Guang-bing1

(1. Department of General Surgery; 2. Department of Hepatobiliary Surgery, the FirstAffiliated Hospital, Medical School of Xi’an Jiaotong University, Xi’an 710061, China)

Objective To investigate the important role of Gli-1 in hypoxia-induced epithelial-mesenchymal transition of breast cancer cell line MDA-MB-231. Methods For the present study, breast cancer cell line MDA-MB-231 was cultured under normoxic or hypoxic condition. Then, the shRNA of Gli-1 was stably transfected into MDA-MB-231 cells. Invasion of MDA-MB-231 was detected by the Transwell assay. The expressions of HIF-1α, Gli-1, E-Cadherin and vimentin proteins were determined by Western blot. Results Hypoxia significantly induced the invasion of MDA-MB-231 cells, upregulated the expressions of HIF-1α, Gli-1 and vimentin proteins, and downregulated the expression of E-Cadherin protein. Furthermore, knocking down Gli-1 obviously abrogated hypoxia-induced epithelial-mesenchymal transition and enhanced invasion of MDA-MB-231 cells. Conclusion Hypoxia induces epithelial-mesenchymal transition and enhances invasion of breast carcinoma cells via strengthening Gli-1 expression and activation of Hedgehog pathway.

breast carcinoma; invasion; epithelial-mesenchymal transition; hypoxia; Gli-1; hedgehog pathway

2014-01-24

2014-04-20

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.81201824)，中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金資助項(xiàng)目(No.2013jdhz33) Supported by the National Natural Science Foundation of China (No.81201824) and the Fundamental Research Funds for the Central Universities in Xi’an Jiaotong University (No.2013jdhz33)

魏光兵，主治醫(yī)師. E-mail: weiguangbing1208@163.com

李徐奇(1981-)，男(漢族)，博士，助理研究員. 研究方向：消化系統(tǒng)及乳腺腫瘤的發(fā)病機(jī)制與治療策略. E-mail: lixuqi@163.com

時(shí)間：2014-07-25 17∶58 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20140725.1758.001.html

R737.9

A

10.7652/jdyxb201406014