張甲佳等

摘 要：

以花生胚小葉為外植體，觀察花生胚小葉在添加不同濃度卡那霉素的分化培養(yǎng)基上的生長狀況，研究不同花生品種對卡那霉素的敏感性，以確定各品種的卡那霉素臨界濃度。結(jié)果表明，在供試品種中，D16對卡那霉素最敏感，其臨界濃度為100 mg/L；花育22對卡那霉素的耐受性最高，其臨界濃度為200 mg/L；J11及魯花11的卡那霉素臨界濃度均為150 mg/L。

關(guān)鍵詞：花生；胚小葉；卡那霉素；敏感性；臨界值

中圖分類號：S565.203.53 文獻標識號：A 文章編號：1001-4942（2014）04-0036-03

生 （Arachis hypogaea L.）是世界四大油料作物之一，在我國經(jīng)濟發(fā)展中占有重要地位，是我國重要的經(jīng)濟和油料作物[1]。近幾年隨著花生離體培養(yǎng)的快速發(fā)展，花生遺傳轉(zhuǎn)化也飛速發(fā)展著，農(nóng)桿菌介導(dǎo)是花生遺傳轉(zhuǎn)化最常用的方法[2～4]。在轉(zhuǎn)基因植株的初步檢測中，抗生素篩選是最為常用的方法[5～10]，其中卡那霉素最為常用[4，6～16]。卡那霉素（Kanamycin，簡稱Km）能強烈抑制細胞生長，能夠使多種植物綠色器官黃化；低濃度卡那霉素能夠抑制植物細胞分化，高濃度卡那霉素則能夠?qū)е轮参锼劳鯷1，5，6，12，13]。在轉(zhuǎn)基因植物篩選中，常用抗性基因作為標記基因[7，11，17]，NPTⅡ、HPT、CAT、SPT、Gent等是使用最多的抗生素抗性酶基因[18]。NPTⅡ（新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶）基因是目前植物遺傳轉(zhuǎn)化中常用的標記基因，含有該基因的植物能夠?qū)敲顾禺a(chǎn)生抗性，從而存活下來[11，17，21]。

不同花生品種對卡那霉素的敏感程度不同，單世華等[1]對泉花10號和金花1012的帶胚單子葉進行研究，得到的卡那霉素臨界濃度為200 mg/L；莊振宏等[19]研究得到泉花10號花生小葉的臨界卡那霉素濃度為150 mg/L；胡曉君等[20]的試驗結(jié)果則表明，花生離體葉片的卡那霉素篩選濃度為400 mg/L，不同苗齡葉片對卡那霉素的敏感性不同。本試驗研究了4個不同花生品種胚小葉對卡那霉素的敏感性，以期得到各品種的卡那霉素臨界濃度，為其遺傳轉(zhuǎn)化奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

花生品種J11、花育22號、D16、魯花11號，均由山東省花生研究所提供。

1.2 試劑

卡那霉素，購于上海生工；MS基本培養(yǎng)基（添加適量NAA、6-BA）、分化培養(yǎng)基、75%乙醇、0.1%升汞，所用藥品或試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 主要儀器設(shè)備

高溫高壓蒸汽滅菌鍋，江南儀器廠；人工氣候箱，寧波江南儀器廠；微量移液器，Enpendorf，德國；AA-680型原子吸收分光光度計，日本島津；J-20XP高速冷凍離心機，美國BECKMAN公司；PB303-N電子精密天平，梅特勒-托利多公司；79HW-1恒溫磁力攪拌器，江蘇省金壇市榮華儀器廠；PHS-3 pH計，上海精密儀器有限公司；超純水系統(tǒng)，Millipore，美國。

1.4 試驗方法

1.4.1 種子消毒 選取成熟飽滿、活力高的花生種子，用自來水沖洗2～3次；在超凈工作臺上用75%乙醇消毒3次，1 min/次；然后用0.1%升汞浸泡10 min；再用無菌水漂洗3～4次，1 min/次，然后于無菌水中浸泡2～4 h。

1.4.2 外植體獲得 在超凈工作臺上剝?nèi)ハ咎幚砗蟮姆N子種皮，接種于MS基本培養(yǎng)基上，培養(yǎng)4～6 d后，切取花生胚小葉作為外植體。

1.4.3 敏感性試驗 設(shè)卡那霉素濃度梯度：0、50、100、150、200 mg/L，在培養(yǎng)基高溫高壓滅菌并冷至65℃左右時加入。切取生長狀況良好的胚小葉，接種于添加不同濃度卡那霉素的分化培養(yǎng)基上，培養(yǎng)3周后統(tǒng)計各品種外植體的白化率和出愈率。

白化率（%）=白化外植體數(shù)/接種總外植體數(shù)×100

出愈率（%）=產(chǎn)生愈傷組織外植體數(shù)/接種總外植體數(shù)×100

2 結(jié)果與分析

2.1 卡那霉素對不同品種花生出愈率的影響

由圖1可以看出，Km濃度越高，出愈率越低；0、50 mg/L時，4個品種均能夠產(chǎn)生愈傷組織；100 mg/L時，D16的出愈率為零，說明與其他3個品種相比，D16對Km最為敏感；當Km濃度達到150 mg/L時，只有花育22號還有愈傷組織產(chǎn)生，出愈率為10%，說明4個品種中，花育22號對Km最不敏感；但當Km濃度達到200 mg/L時，4個品種均不產(chǎn)生愈傷組織。

圖1 各品種在不同Km濃度下的出愈率

2.2 卡那霉素對不同品種花生白化率的影響

由圖2可以看出，在未添加Km的培養(yǎng)基上，各品種均無白化植株出現(xiàn)；Km濃度為50 mg/L時，花育22號仍無明顯的白化株出現(xiàn)，而其他3個品種的白化率均超過了10%，D16的白化率最高，為33.33%；當Km濃度超過100 mg/L后，4個品種均有不同程度的白化。Km濃度越高，白化率越高，4個品種的白化率由高到低依次為D16>J11>魯花11號>花育22號。

圖2 各品種在Km不同濃度下的白化率

2.3 D16與花育22號在Km不同濃度下的生長狀況比較

上述分析顯示，4個品種中D16對Km最敏感，而花育22號對Km的耐受性最高。由兩者培養(yǎng)3周后的生長狀況（圖3、圖4）可以看出，兩品種間差異明顯，在添加50 mg/L Km的培養(yǎng)基上，花育22號產(chǎn)生愈傷組織的外植體數(shù)明顯多于D16，而D16的白化率也明顯高于花育22號。

圖3 D16在Km不同濃度下的生長狀況

圖4 花育22號在Km不同濃度下的生長狀況

3 討論與結(jié)論endprint

王萍等[5]研究表明，卡那霉素明顯抑制大豆胚尖不定芽的形成，隨濃度的增加而減少。劉方等[6]研究表明高濃度的卡那霉素抑制棉花體細胞胚的形成，而低濃度的作用較弱。任艷等[22]研究表明，抗生素濃度與抑菌效果呈正比，但與組培苗生長狀況呈反比，因此選擇適宜的抗生素濃度是必不可少的。不同基因型植物對卡那霉素的內(nèi)源抗性有差異[7]。本試驗結(jié)果顯示，花育22號對Km的敏感性最弱，胚小葉在添加200 mg/L Km的培養(yǎng)基上出現(xiàn)明顯變化；D16對Km敏感性最強，在添加50 mg/L Km 的培養(yǎng)基上即出現(xiàn)明顯變化。

D16在Km 100 mg/L時不產(chǎn)生愈傷組織，喪失分化能力，且白化率達到45%，因此，確定其Km臨界濃度為100 mg/L；依此確定J11、魯花11號、花育22號的Km臨界值分別為150、150、200 mg/L。但本試驗得出的Km臨界濃度僅為理論值，實際的使用濃度還有待進一步試驗確定。

參 考 文 獻：

[1]

單世華，李春娟，劉思衡，等. 以農(nóng)桿菌為介導(dǎo)花生遺傳轉(zhuǎn)化研究[J]. 中國油料作物學(xué)報，2003，25（1）：9-13.

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[5] 王萍，張淑珍，李文濱，等. 大豆不同品種基因型胚尖不定芽的誘導(dǎo)及對抗生素的敏感性[J]. 作物雜志，2010（2）：50-53.

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[11]李玲. 楊樹對卡那霉素（Kanamycin）敏感性的測定[J]. 林業(yè)科學(xué)，1992，28（1）：95-96.

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[13]尹智慧，宋麗莉，司亮，等. 大巖桐葉片再生體系的建立及卡那霉素敏感性研究[J]. 北方園藝，2013（10）：100-102.

[14]張寅玲，劉艷軍，張偉玉，等. 番茄基因轉(zhuǎn)化中抗生素篩選壓力的確定辦法[J]. 西南園藝，2005，33（5）：4-6.

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[20]胡曉君，劉風珍，萬勇善，等. 花生組織培養(yǎng)及苗期nptⅡ標記基因篩選劑適宜濃度的研究[J]. 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2007，38（1）：28-34.

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[22]任艷，王輝，石延茂，等. 抗生素在花生組織培養(yǎng)中的抑菌效應(yīng)研究[J]. 山東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011（10）：74-75.endprint

王萍等[5]研究表明，卡那霉素明顯抑制大豆胚尖不定芽的形成，隨濃度的增加而減少。劉方等[6]研究表明高濃度的卡那霉素抑制棉花體細胞胚的形成，而低濃度的作用較弱。任艷等[22]研究表明，抗生素濃度與抑菌效果呈正比，但與組培苗生長狀況呈反比，因此選擇適宜的抗生素濃度是必不可少的。不同基因型植物對卡那霉素的內(nèi)源抗性有差異[7]。本試驗結(jié)果顯示，花育22號對Km的敏感性最弱，胚小葉在添加200 mg/L Km的培養(yǎng)基上出現(xiàn)明顯變化；D16對Km敏感性最強，在添加50 mg/L Km 的培養(yǎng)基上即出現(xiàn)明顯變化。

D16在Km 100 mg/L時不產(chǎn)生愈傷組織，喪失分化能力，且白化率達到45%，因此，確定其Km臨界濃度為100 mg/L；依此確定J11、魯花11號、花育22號的Km臨界值分別為150、150、200 mg/L。但本試驗得出的Km臨界濃度僅為理論值，實際的使用濃度還有待進一步試驗確定。

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王萍等[5]研究表明，卡那霉素明顯抑制大豆胚尖不定芽的形成，隨濃度的增加而減少。劉方等[6]研究表明高濃度的卡那霉素抑制棉花體細胞胚的形成，而低濃度的作用較弱。任艷等[22]研究表明，抗生素濃度與抑菌效果呈正比，但與組培苗生長狀況呈反比，因此選擇適宜的抗生素濃度是必不可少的。不同基因型植物對卡那霉素的內(nèi)源抗性有差異[7]。本試驗結(jié)果顯示，花育22號對Km的敏感性最弱，胚小葉在添加200 mg/L Km的培養(yǎng)基上出現(xiàn)明顯變化；D16對Km敏感性最強，在添加50 mg/L Km 的培養(yǎng)基上即出現(xiàn)明顯變化。

D16在Km 100 mg/L時不產(chǎn)生愈傷組織，喪失分化能力，且白化率達到45%，因此，確定其Km臨界濃度為100 mg/L；依此確定J11、魯花11號、花育22號的Km臨界值分別為150、150、200 mg/L。但本試驗得出的Km臨界濃度僅為理論值，實際的使用濃度還有待進一步試驗確定。

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