孔維國　王俊峰　丁漢鳳

摘 要：農(nóng)作物種質(zhì)資源是國家重要戰(zhàn)略資源之一。我國的農(nóng)作物種質(zhì)資源豐富并有著獨特的地域性，農(nóng)作物種質(zhì)資源的DNA指紋數(shù)據(jù)庫不僅在種子質(zhì)量和專利權(quán)保護(hù)方面發(fā)揮著重要作用，在種質(zhì)品種鑒定、農(nóng)作物育種和農(nóng)作物遺傳作圖等方面也起著積極作用。因此，構(gòu)建我國農(nóng)作物DNA指紋數(shù)據(jù)庫對保護(hù)我國豐富的種質(zhì)和基因資源有著長遠(yuǎn)意義。

關(guān)鍵詞：DNA指紋數(shù)據(jù)庫；農(nóng)作物；種質(zhì)資源；分子標(biāo)記

中圖分類號：S325 文獻(xiàn)標(biāo)識號：A 文章編號：1001-4942（2014）04-0131-05

農(nóng)作物種質(zhì)資源是保障農(nóng)業(yè)生產(chǎn)穩(wěn)定的基礎(chǔ)，也是人類未來生存和發(fā)展的先決條件，其在農(nóng)業(yè)科學(xué)和生命科學(xué)研究領(lǐng)域中占有極為重要的地位[1]。目前，由于分子生物學(xué)特別是轉(zhuǎn)基因技術(shù)在育種方面的應(yīng)用，使種質(zhì)資源展現(xiàn)了親本利用的集中化和核心化趨勢，出現(xiàn)了大量在形態(tài)上相似而只存在個別性狀或基因差異的品種，傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)方法已無法進(jìn)行準(zhǔn)確的品種鑒定和純度分析，加大了種質(zhì)資源收集、整理、鑒定及品種選育的難度[2]。另一方面，目前國內(nèi)種子市場存在部分以劣充優(yōu)、以假亂真的現(xiàn)象，嚴(yán)重影響了優(yōu)良品種的增產(chǎn)效益，給育種者和農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)造成了巨大的損失[3]。因此，尋找一種安全有效、方便快捷、精確穩(wěn)定的技術(shù)以鑒定種質(zhì)資源的真實性和純度顯得尤為重要。近年來，我國政府高度重視作物種質(zhì)資源信息系統(tǒng)的研究，在連續(xù)6個五年計劃中，國家科技攻關(guān)項目均設(shè)立了專題研究，并取得重要進(jìn)展。

1 DNA指紋數(shù)據(jù)庫起源

隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)和電泳技術(shù)的迅猛發(fā)展，一種新的分子標(biāo)記技術(shù)——電泳指紋圖譜技術(shù)在農(nóng)作物種質(zhì)資源的親緣關(guān)系鑒定、品種審定和雜優(yōu)類群劃分等方面發(fā)揮了很大的作用[4]。電泳指紋圖譜技術(shù)分為蛋白質(zhì)指紋圖譜和DNA指紋圖譜，較之前者，后者不受環(huán)境、生物發(fā)育時期、組織器官及基因表達(dá)等影響，遺傳穩(wěn)定、多態(tài)性高，且不影響目標(biāo)性狀的表現(xiàn)，因此更具優(yōu)勢，目前已被廣泛用于農(nóng)作物種質(zhì)資源的鑒定[3]。DNA指紋圖譜多態(tài)性豐富且具有高度的個體特異性和環(huán)境穩(wěn)定性，它提供的是可見的條碼式譜帶圖譜，可通過計算機(jī)進(jìn)行系統(tǒng)管理，而由此構(gòu)建的數(shù)據(jù)庫就被稱為DNA指紋數(shù)據(jù)庫。2005年，國際植物品種權(quán)保護(hù)組織（UPOV）擬定的BMT測試指南草案中規(guī)定，將微衛(wèi)星（Microsatellite），亦稱簡單序列重復(fù)（Simple Sequence Repeats， SSR）和單核苷酸多態(tài)性（Single Nucleotide Polymorphisms， SNP）等分子標(biāo)記技術(shù)確定為構(gòu)建DNA指紋數(shù)據(jù)庫的標(biāo)記方法。

2 我國農(nóng)作物種質(zhì)資源DNA指紋數(shù)據(jù)庫的構(gòu)建

建立DNA指紋數(shù)據(jù)庫一般需要如下幾個關(guān)鍵性因素：標(biāo)記方法和標(biāo)記來源，嚴(yán)格規(guī)范的檢測平臺，核心樣品的選定，核心引物的選定，數(shù)據(jù)的整合和數(shù)據(jù)庫的評估[5，6]。目前國內(nèi)DNA指紋數(shù)據(jù)庫的標(biāo)記方法和來源一般是參照國際上的通用標(biāo)準(zhǔn)——SSR標(biāo)記方法，個別的采用非主流方法和標(biāo)準(zhǔn)[7～9]。檢測平臺則因各個科研單位人員、技術(shù)和資金等因素的限制而有所不同，一般為變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，個別資金充裕的單位采用毛細(xì)管電泳[5]。核心樣品的選用因各地的研究方向不同而各有側(cè)重[10，11]。核心引物的選用比較多樣化，由于核心引物的選擇不同，導(dǎo)致各個數(shù)據(jù)庫在整合方面出現(xiàn)了一定的難度，這可能成為今后工作的重點之一。近年，我國已在小麥、玉米、水稻、大豆、花生、棉花等多個物種開展DNA指紋數(shù)據(jù)庫的構(gòu)建，并取得了重要進(jìn)展。

2.1 小麥DNA指紋數(shù)據(jù)庫構(gòu)建

由于小麥基因組巨大，目前國際上該方面的研究主要停留在通過分子標(biāo)記的方法對小麥的物理圖譜進(jìn)行測定，其大范圍的物理圖譜測定工作已基本完成[12]。我國在該方面的研究也進(jìn)展迅速。1999～2000年，高睦槍等利用53對SSR標(biāo)記對北方冬麥區(qū)及黃淮冬麥區(qū)觀察譜中選出的48個新品種（系）進(jìn)行了遺傳差異研究，發(fā)現(xiàn)利用5個多態(tài)性高的SSR標(biāo)記可以將48個小麥新品種（系）鑒定開[7]。2006年，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所聯(lián)合國際玉米小麥改良中心（CIMMYT）、國際干旱地區(qū)農(nóng)業(yè)研究中心（ICARDA）和法國Agropolis研究所， 建立了包括134個SSR引物、 2 457個普通小麥基因型的指紋數(shù)據(jù)庫[13]。2007年，王立新等采用15個SSR標(biāo)記和20個AFLP-SCAR標(biāo)記分析了來自我國不同麥區(qū)的455個小麥品種，證明用兩種分子標(biāo)記建立小麥DNA指紋可以更加全面地反應(yīng)品種的遺傳多樣性，建立了構(gòu)建DNA指紋的方法模式[8]。2013年，李莉等以山東省41份小麥種質(zhì)資源為材料，使用46對SSR引物，構(gòu)建了DNA指紋數(shù)據(jù)庫[14]。

2.2 玉米DNA指紋數(shù)據(jù)庫構(gòu)建

國際上對玉米DNA指紋數(shù)據(jù)庫的研究已取得了重要進(jìn)展，其物理圖譜已經(jīng)覆蓋了93.5%的玉米基因組[15]。而我國的玉米DNA指紋數(shù)據(jù)庫的平臺業(yè)已基本完成。2006年，北京市農(nóng)林科學(xué)院玉米研究中心聯(lián)合國內(nèi)十多家科研單位開展了中國玉米品種DNA指紋庫構(gòu)建的研究工作，為了保證玉米品種DNA指紋庫構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)化，從建庫標(biāo)記、檢測平臺、試劑、樣品、評估程序、數(shù)據(jù)整合、模式庫、擴(kuò)展庫和隨機(jī)盲測9個方面進(jìn)行了全面的規(guī)范，從而為科研單位合作開展大規(guī)模的DNA指紋庫構(gòu)建研究奠定基礎(chǔ)[5]。2007年，王鳳格等用玉米的10對核心引物對1 360份玉米品種進(jìn)行建庫工作，其中雜交種1 250份，包括本單位自育品種17 份、征集已知品種330份、國家區(qū)試及省區(qū)試品種855份、植物品種權(quán)保護(hù)品種48份[6]。2009年，郭長奎等通過4對核心引物對新疆8個主要玉米雜交種及其親本的ISSR分析， 初步構(gòu)建了新疆玉米DNA特異性指紋圖譜，并建立了數(shù)字化特異性指紋數(shù)據(jù)庫[9]。玉米DNA指紋數(shù)據(jù)庫的構(gòu)建是一個復(fù)雜的系統(tǒng)工程，為了保證數(shù)據(jù)庫的標(biāo)準(zhǔn)化，需要建立起一套原則和規(guī)范。2010年，北京市農(nóng)林科學(xué)院玉米研究中心經(jīng)過3 年的開發(fā)研究，初步構(gòu)建了我國玉米DNA指紋數(shù)據(jù)庫管理系統(tǒng)（http：//www.maizeDNA.com），該系統(tǒng)具有數(shù)據(jù)管理、數(shù)據(jù)瀏覽和數(shù)據(jù)分析3 部分功能，通過將品種的基本信息、形態(tài)數(shù)據(jù)和圖片、DNA指紋數(shù)據(jù)和指紋圖譜等各種信息匯總起來，建立強(qiáng)大的聯(lián)合查詢系統(tǒng)[16]。endprint

2.3 水稻DNA指紋數(shù)據(jù)庫構(gòu)建

目前國際上比較流行的是基于BAC文庫方法對水稻物理圖譜進(jìn)行研究，并在各個文庫間進(jìn)行比對[17]。由于我國擁有比較豐富的水稻種質(zhì)資源，目前正處于對各種種質(zhì)資源進(jìn)行調(diào)查和整理的階段。2009年，陳英華等從500對SSR引物中篩選出10對核心引物， 用于構(gòu)建東北地區(qū)近兩年區(qū)域試驗水稻品種的DNA 指紋圖譜，并在100對多態(tài)性位點上檢測到300個等位基因[10]。2009年，三明市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所的馬紅勃等以福建省三明市農(nóng)科所選育、福建六三種業(yè)有限責(zé)任公司經(jīng)營的24 份雜交稻品種和18份雜交稻親本為材料， 依據(jù)中國水稻研究所推薦的12個SSR標(biāo)記， 建立DNA指紋圖譜[11]。2009年，中國水稻研究所的程本義等，利用前期研究建立的一套水稻品種DNA指紋檢測技術(shù)體系，對2002～2006年浙江省主要的98個水稻品種以及2007～2008年155個浙江省區(qū)試水稻品種（181個次，含26個續(xù)試品種）進(jìn)行了DNA指紋檢測，構(gòu)建了279個次水稻品種×12個微衛(wèi)星標(biāo)記的DNA指紋圖譜數(shù)據(jù)庫[18]。2010年，貴州大學(xué)馬琳等，從145 對SSR引物中篩選出21對引物，對24份貴州地方水稻品種“禾”品種進(jìn)行遺傳多樣性分析， 初步建立其DNA指紋圖譜，并通過聚類分析將所有材料分為5 類， 聚類結(jié)果表明品種間的親緣關(guān)系與地理來源關(guān)系不大[19]。

2.4 大豆和花生DNA指紋數(shù)據(jù)庫構(gòu)建

大豆DNA指紋數(shù)據(jù)庫的構(gòu)建在國際上一直都是熱點，近年來出現(xiàn)了同時應(yīng)用多種分子標(biāo)記手段（SSR、RFLP、AFLP和STS）以完成其遺傳連鎖群測定的現(xiàn)象[20]。國內(nèi)許多研究人員也通過不同分子標(biāo)記手段在該方面取得一定進(jìn)展。2001年，田清震等利用Mse Ⅰ和EcoR Ⅰ酶切篩選適宜大豆AFLP指紋分析的引物組合，并利用17對引物組合建立了我國 92份代表性野生大豆和栽培大豆的AFLP指紋圖譜[21]。2003年，關(guān)榮霞等以遺75-14、中黃14、中品662 和中品661共4個品種為試驗材料， 利用不同連鎖群上的SSR引物隨機(jī)選擇個體進(jìn)行分析， 以確定分析品種純度所需的引物數(shù)， 為大豆品種資源保存及品種指紋圖譜建立提供理論依據(jù)[22]。2007年，王玉民等對大豆屬Glycine亞屬19份多年生野生大豆、Soja亞屬2份野生大豆和2份栽培大豆進(jìn)行了ISSR分析，構(gòu)建了栽培大豆和野生大豆的比較指紋圖譜[23]。

花生屬于豆科類作物，但其遺傳多樣性相對較低，這一特征在一定程度上限制了該物種的育種工作。Holbrook于1993年建立了一個包含831個美國花生地方品種組成的核心種質(zhì)資源庫[24]。而國內(nèi)的研究現(xiàn)階段還處于花生SSR分子標(biāo)記的開發(fā)階段，在DNA指紋圖譜的構(gòu)建上有一定的應(yīng)用。目前已經(jīng)有800多個花生基因組SSR分子標(biāo)記。2006年，仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院的劉冠明等利用20個南方花生品種為材料，從64對SSR引物中篩選出4對構(gòu)建DNA指紋圖譜[25]。2007年，周桂元等選用110對SSR引物對21個花生變異株系進(jìn)行SSR多態(tài)性分析，有5對引物在變異株系與對照品種之間表現(xiàn)出多態(tài)性[26]。2008年，姜慧芳等以中國花生種質(zhì)資源數(shù)據(jù)庫中記錄的6 390份花生資源為材料，以其基本數(shù)據(jù)、特征數(shù)據(jù)和評價數(shù)據(jù)為信息，采用分層分組聚類以及隨機(jī)取樣與必選資源相結(jié)合的方法，構(gòu)建了由298份資源組成的花生小核心種質(zhì)，為進(jìn)一步的DNA指紋數(shù)據(jù)庫的構(gòu)建奠定了基礎(chǔ)[27]。

2.5 棉花DNA指紋數(shù)據(jù)庫構(gòu)建

國外對棉花DNA指紋圖譜的研究也取得一定的突破，部分染色體指紋圖譜構(gòu)建已基本完成[22]。國內(nèi)研究人員以前的工作主要停留在初級階段，利用SSR引物對棉花栽培品種的親本進(jìn)行多態(tài)性分析，以篩選并通過標(biāo)記區(qū)分各個品種或鑒定其純度。2003年，劉勤紅等篩選了217 對異源四倍體棉花的SSR 引物， 獲得了十幾個足以區(qū)分魯棉研15 號父母本及其F1的標(biāo)記位點， 為魯棉研15號雜交種的純度鑒定提供了一個準(zhǔn)確、穩(wěn)定和快捷、實用的方法[28]。隨著研究的深入，研究人員逐漸開始構(gòu)建DNA指紋數(shù)據(jù)庫。2005年，秦利等從10對引物中隨機(jī)挑選出3對引物對當(dāng)前新疆主栽品種進(jìn)行指紋圖譜構(gòu)建和雜交種純度鑒定，3個標(biāo)記可分別將3個雜交種與它們的親本加以區(qū)分[29]。2009年，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所以18份陸地棉和3份海島棉品種為材料， 從78對棉花SSR引物中篩選出55 對具有多態(tài)性的引物， 并確定了33對棉種鑒定用的備選核心引物，構(gòu)建了棉花品種DNA 指紋圖譜[30]。2010年，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所利用25對核心引物對中棉所48及其親本進(jìn)行多態(tài)性檢測，構(gòu)建了中棉所48 的數(shù)字指紋圖譜[31]。

3 討論

DNA指紋圖譜技術(shù)不僅在種質(zhì)品種鑒定、種子質(zhì)量和保護(hù)專利權(quán)上發(fā)揮著重要作用，它也被應(yīng)用到品種的親緣關(guān)系劃分、農(nóng)作物育種和農(nóng)作物遺傳作圖等方面[32，33]。但是，由于我國農(nóng)作物DNA指紋圖譜的研究才剛剛起步，國內(nèi)各個研究機(jī)構(gòu)水平不一，農(nóng)作物的DNA指紋數(shù)據(jù)庫構(gòu)建所采用的技術(shù)、標(biāo)準(zhǔn)和軟件等各不相同，同一農(nóng)作物存在著若干個不同的DNA指紋數(shù)據(jù)庫，且大多數(shù)數(shù)據(jù)庫間存在不能兼容的現(xiàn)狀[28～31]。這些情況的存在不僅不利于各個數(shù)據(jù)庫之間的數(shù)據(jù)交換，造成資源浪費，更為重要的是它使農(nóng)作物DNA指紋數(shù)據(jù)庫間沒有了統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，造成單個數(shù)據(jù)庫容量不足、覆蓋率不足、分辨率不足和不穩(wěn)定等缺點，阻礙農(nóng)作物DNA指紋數(shù)據(jù)庫的構(gòu)建和發(fā)展，影響研究人員對農(nóng)作物分子育種工作的深入研究。目前國內(nèi)僅有少數(shù)農(nóng)作物形成統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，如中國水稻研究所國家水稻數(shù)據(jù)中心（http：//www.ricedata.cn）公布的水稻分子標(biāo)記的信息和技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)、我國玉米DNA 指紋數(shù)據(jù)庫管理系統(tǒng)（http：//www.maizeDNA.com），而大多數(shù)研究仍是采取國際上的權(quán)威數(shù)據(jù)庫。在數(shù)據(jù)庫整合過程中，指紋圖譜識別軟件設(shè)計與開發(fā)滯后也是阻礙農(nóng)作物DNA指紋數(shù)據(jù)庫快速發(fā)展的重要原因之一，造成農(nóng)作物DNA指紋數(shù)據(jù)庫構(gòu)建的半自動化，影響其構(gòu)建速度和效率。由于我國農(nóng)作物種質(zhì)資源的獨特性，同時也是為了保護(hù)我國豐富的種質(zhì)和基因資源，構(gòu)建自己的農(nóng)作物DNA指紋數(shù)據(jù)庫已迫在眉睫。因此，構(gòu)建農(nóng)作物DNA指紋數(shù)據(jù)庫的基本平臺、統(tǒng)一技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)、加快相關(guān)軟件開發(fā)已成為我國近期在該方面工作研究的重點，對于實現(xiàn)農(nóng)作物DNA指紋數(shù)據(jù)庫的標(biāo)準(zhǔn)化、自動化和數(shù)字化有著重要意義。endprint

參 考 文 獻(xiàn)：

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