衛(wèi) 強， 徐 飛， 邱 鎮(zhèn)， 紀小影

（安徽新華學院 藥學院，安徽 合肥 230088）

菊葉總黃酮抗腫瘤作用初步研究

衛(wèi) 強， 徐 飛， 邱 鎮(zhèn)， 紀小影

（安徽新華學院 藥學院，安徽 合肥 230088）

本文以MTT法考察菊葉中總黃酮的體外抗腫瘤活性；以小鼠移植瘤模型測定總黃酮對荷瘤小鼠抑瘤率和腹腔巨噬細胞吞噬能力，研究其體內(nèi)抗腫瘤活性和免疫調(diào)節(jié)作用.結(jié)果表明，總黃酮對S180細胞生長有顯著抑制作用.體內(nèi)試驗表明，與生理鹽水組相比，總黃酮對小鼠S180實體瘤有顯著抑制作用（P＜0.01），抑瘤同時可促進體重增長；總黃酮高劑量組可提高荷瘤小鼠的脾指數(shù)和胸腺指數(shù).與環(huán)磷酰胺組和生理鹽水組比較，總黃酮可使荷S180實體瘤小鼠腹腔巨噬細胞吞噬能力升高，表明其對小鼠沒有免疫抑制作用.

菊葉；總黃酮；抗腫瘤

安徽菊花道地藥材有“亳菊”、“滁菊”、“貢菊”三種，具有清熱明目之效[1].菊葉為植物菊花的莖上葉，有治療瘡、癰疽、頭風、目眩的功效[2]，菊葉提取物有抗菌、保護心肌缺血、抗氧化的作用.菊葉中主要含有黃酮類、揮發(fā)油、綠原酸三種成分[3].

國內(nèi)研究表明，黃酮類化合物已成為新的抗腫瘤研究熱點，目前已發(fā)現(xiàn)多種植物提取物中黃酮類成分有抗腫瘤活性，如雞血藤黃酮類成分可抑制乳腺癌細胞生長[4]，木瓜總黃酮對死亡因子（PD）-1與其配體（PD-L1）的結(jié)合有抑制作用，使腫瘤細胞表面PD-L1的表達降低而促進機體對腫瘤的免疫應(yīng)答，達到抑制腫瘤細胞生長的作用[5].萬壽菊莖葉中兩種黃酮類化合物4'-甲氧基-澤蘭素3-O-β-D-葡萄糖苷和山柰酚-3,7-O-α-L-雙鼠李糖苷均可抑制人胃癌細胞SGC7901和人肝癌細胞SMMC7721的增殖，且呈現(xiàn)濃度與時間依賴性[6].黃明玉等[7]研究山茶花總黃酮抑制小鼠H22肝癌移植瘤生長，結(jié)果顯示，總黃酮高、中劑量組可明顯降低瘤體重量，顯著增加小鼠脾和胸腺指數(shù)，顯著提高巨噬細胞吞噬功能和淋巴細胞轉(zhuǎn)化能力.本論文擬對菊葉中總黃酮的抗腫瘤作用進行初步研究，以期為其開發(fā)應(yīng)用奠定一定的理論基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑與藥品

菊葉，來自安徽滁州地區(qū)；瘤株S180，由中國醫(yī)學科學院腫瘤細胞庫提供；MTT（噻唑藍）、環(huán)磷酰胺，購于美國Sigma公司；其它試劑均為分析純.

1.1.2 實驗動物

清潔級雄性小鼠，體質(zhì)量18-22g，由安徽醫(yī)科大學動物實驗中心提供，合格證號:皖醫(yī)實動準字01號.

1.1.3 儀器與設(shè)備

SAFEDA MB-601型全自動酶標儀，北京賽必達科技有限公司；UV-4802S型紫外可見分光光度計，尤尼柯（上海）儀器有限公司；CHP型CO2培養(yǎng)箱，常州普天儀器制造有限公司；Leica XDS-200倒置顯微鏡，上海蔡康光學儀器有限公司.

1.2 方法

1.2.1 菊葉總黃酮的提取[8]

稱取菊葉粗粉20g，加入50%乙醇600ml回流提取時間3次（2h，1h，0.5h），抽濾，提取液濃縮至小體積，加水和石油醚萃取3次，將水液濃縮，備用.

1.2.2 菊葉總黃酮的純化[9]

稱取8g經(jīng)預(yù)處理的X-5型大孔樹脂，用水溶液裝柱（2.5cm×30cm）.量取供試液3mL加入相同量的聚酰胺，水浴蒸干后置于前面樹脂柱中，水洗至無色.再以70%乙醇洗脫至125mL.提取液量（mL）與聚酰胺量（g）比例為1.5:1，樹脂(g)-提取液(mL)為4:3，色譜柱徑高比1:20，洗脫液收集量為2BV，得總黃酮（純度80.1%）.

1.2.3 瘤細胞懸液制備

選擇接種后8d健康的S180種鼠，頸椎脫臼，固定于蠟板上，腹部皮膚消毒后，剪開并剝?nèi)ジ共科つw，用空針穿過腹部肌肉，無菌獲取的腹水，以生理鹽水稀釋成腫瘤細胞懸液（濃度106個/mL）.

1.2.4 抗腫瘤試驗（MTT法）

將1.2.1項下S180細胞懸液接種于96孔板，保持每孔100μL.設(shè)菊葉總黃酮組、空白組、陰性對照組三個組別，每組6個復(fù)孔.接種后，在5%CO2飽和濕度孵箱內(nèi)和37℃下培養(yǎng)，過夜，貼壁或離心后，對照組換液、藥物組加入20、40、100、200、500mg/L的總黃酮培養(yǎng)液各60μL，培養(yǎng)48h后以MTT法檢測細胞活力[10-11].每孔加入MTT液（3g/L）8μL，3h后，吸取培養(yǎng)液，加入120μL二甲基亞砜，在波長490nm處以酶標儀測定吸光度（A），計算細胞生長的抑制率.

1.2.5 對小鼠S180實體瘤生長和免疫器官的影響

選取60只ICR小鼠作為試驗動物，將含106個/mL的S180細胞懸液接種到小鼠右前肢腋窩下，0.3mL/只.24h后，將小鼠隨機分成生理鹽水組、環(huán)磷酰胺組（22mg/kg）、菊葉總黃酮高、中、低三個劑量組（500、300、100mg/kg），共5組，每組12只.次日開始接種，隔日腹腔注射環(huán)磷酰胺，每日連續(xù)灌胃給予總黃酮.每日記錄小鼠體重，觀察并記錄小鼠死亡時間.14d后脫頸椎處死小鼠，根據(jù)瘤塊計算抑瘤率，根據(jù)胸腺和脾臟計算臟器指數(shù)[12].

1.2.6 對小鼠腹腔巨噬細胞吞噬能力的影響

動物分組及給藥方法同“1.2.3”.小鼠處死后腹腔注射RPMI 1640培養(yǎng)液約3mL，收集腹腔液，離心2min（2500r/min），棄去上清液，以培養(yǎng)液調(diào)到每升含2×109個細胞.將巨噬細胞懸液接種于96孔板，保持每孔100μL，置5%CO2培養(yǎng)箱和37℃下培養(yǎng)4h，除去上清液，每孔加入50μL 0.2%中性紅溶液，培養(yǎng)30min.取出培養(yǎng)板，以磷酸鹽緩沖液數(shù)次沖洗，每孔加入100μL細胞裂解液，于570nm處進行可見-紫外分光光度計測定吸收度值[13-14].

1.2.7統(tǒng)計和分析

采用Cochran&Cox近似t檢驗.

2 結(jié)果與分析

圖1 菊葉總黃酮對S180細胞的抑制作用

2.1 體外對腫瘤細胞存活的抑制作用

如圖1所示，菊葉總黃酮質(zhì)量濃度與S180細胞存活的抑制有相關(guān)性，在濃度高于200mg/L時，對S180細胞抑制作用明顯；在600mg/L時最高，抑制率為82.2%.

2.2 對S180荷瘤小鼠的影響

結(jié)果見表1和表2.

表1 菊葉總黃酮對S180荷瘤小鼠體重和抑瘤率的影響（n=12，±SD）

表1 菊葉總黃酮對S180荷瘤小鼠體重和抑瘤率的影響（n=12，±SD）

注：與生理鹽水組相比，aP＜0.05，bP＜0.01；與環(huán)磷酰胺組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01

組別 劑量（mg/kg） 體重增加量（g） 瘤重（g） 抑瘤率生理鹽水組 15.71±2.09 1.99±0.21△△環(huán)磷酰胺組 20 15.01±3.08 0.92±0.26b 53.77總黃酮低劑量組 100 16.92±2.76 1.34±0.25b△△ 32.66總黃酮中劑量組 300 18.22±3.03a△ 1.21±0.36b△ 39.20總黃酮高劑量組 500 18.65±2.71a△ 1.05±0.37b 47.23

表2 菊葉總黃酮對S180荷瘤小鼠免疫器官的影響（n=12，±SD）

表2 菊葉總黃酮對S180荷瘤小鼠免疫器官的影響（n=12，±SD）

注：與生理鹽水組相比，aP＜0.05，bP＜0.01；與環(huán)磷酰胺組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01

胸腺指數(shù)（mg/g）生理鹽水組 4.26±0.56 1.32±0.36環(huán)磷酰胺組 20 4.31±0.72 1.44±0.38總黃酮低劑量組 100 5.12±0.83a△ 1.52±0.29總黃酮中劑量組 300 5.46±0.91b△△ 1.61±0.37總黃酮高劑量組 500 5.71±0.68b△△ 1.70±0.42a組別 劑量（mg/kg）脾指數(shù)（mg/g）

由表1可知，與生理鹽水組相比，不同劑量的菊葉總黃酮均可顯著抑制S180實體瘤的生長（P＜0.01），有劑量相關(guān)性；菊葉總黃酮高劑量組抑瘤率達到47.23%，略低于環(huán)磷酰胺對照組.總黃酮低劑量組與環(huán)磷酰胺組抑瘤率比較有顯著性差異（P＜0.01）.總黃酮高、中、低劑量組在促進小鼠體重增長上與生理鹽水組、環(huán)磷酰胺組相比均顯示較顯著性差異（P＜0.05）.由表2可知，環(huán)磷酰胺可明顯抑制S180實體瘤的生長，但對提高小鼠免疫器官的免疫功能能力不顯著.與環(huán)磷酰胺組比較，菊葉總黃酮高劑量組可使小鼠的脾指數(shù)和胸腺指數(shù)較顯著的增加（P＜0.05），表明其在抑瘤與增強荷瘤小鼠免疫功能方面有一定相關(guān)性.

2.3 對小鼠腹腔巨噬細胞吞噬能力的影響結(jié)果見表3.

表3 菊葉總黃酮對小鼠巨噬細胞吞噬能力的影響（n=12，±SD）

表3 菊葉總黃酮對小鼠巨噬細胞吞噬能力的影響（n=12，±SD）

注：與生理鹽水組相比，bP＜0.01；與環(huán)磷酰胺組相比，△△P＜0.01

組別 劑量（mg/kg） 吸光值生理鹽水組 0.438±0.057環(huán)磷酰胺組 20 0.412±0.078總黃酮低劑量組 100 0.546±0.034b△△總黃酮中劑量組 300 0.592±0.059b△△總黃酮高劑量組 500 0.613±0.066b△△

由表3可知，與生理鹽水組相比，環(huán)磷酰胺組可使小鼠腹腔巨噬細胞吞噬能力降低5.94%，表明其對S180實體瘤小鼠免疫功能有明顯抑制作用.與生理鹽水組相比，菊葉總黃酮高、中、低劑量組可使腹腔巨噬細胞吞噬能力顯著升高（P＜0.01），分別增加39.95%、35.16%和24.66%.

3 結(jié)論與討論

菊葉資源蘊藏量豐富，據(jù)統(tǒng)計，貢菊和杭菊每年有5000噸左右[15]的產(chǎn)量.從產(chǎn)量上來說，菊葉比菊花大得多.由于菊葉不能直接作為藥用，菊花被采集時，菊葉被大量廢棄.根據(jù)對滁菊花提取工藝研究結(jié)果，滁菊花中總黃酮的平均含量為6.70%[16]，滁菊葉中總黃酮的平均含量為10.06%[8].可見，菊葉中黃酮成分相對菊花有明顯的含量優(yōu)勢，有較高的開發(fā)利用價值.

本實驗以MTT法證明菊葉總黃酮對S180細胞生長有顯著抑制作用，在質(zhì)量濃度達到600mg/L時最高，抑制率為82.2%.實驗建立了小鼠移植瘤模型，通過測定菊葉總黃酮對荷瘤小鼠抑瘤率和腹腔巨噬細胞吞噬能力，證明了總黃酮對小鼠S180實體瘤有顯著抑制作用，抑制腫瘤生長同時，可明顯提高小鼠體重.菊葉總黃酮高劑量組可提高荷瘤小鼠的脾指數(shù)和胸腺指數(shù)；通過與環(huán)磷酰胺組和生理鹽水組比較，證實菊葉總黃酮可使荷S180實體瘤小鼠腹腔巨噬細胞吞噬能力顯著升高，表明其沒有免疫抑制作用.

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R285；R979.1

A

1673-260X（2014）10-0072-03

安徽省高等學校省級自然科學研究項目（KJ2013B103）;國家大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練項目（201312216028，201312216029）；安徽省大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練項目 （AH 201312216001）；安徽省質(zhì)量工程項目 （2013gxk105）；安徽新華學院質(zhì)量工程項目（2013gxkcx01）