莫 芹，李騰云，沈 微*，樊 游，陳獻(xiàn)忠，王正祥，石貴陽(yáng)

(1.江南大學(xué)工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無(wú)錫 214122;2.江南大學(xué)中國(guó)高校工業(yè)微生物資源數(shù)據(jù)平臺(tái)，江蘇 無(wú)錫 214122;3.福喜(威海)農(nóng)牧發(fā)展有限公司，山東 乳山 264500)

淀粉酶是催化淀粉分子中α-1，4糖苷鍵或α-1，6糖苷鍵水解的一類水解酶。在常溫條件下，淀粉均以不溶于水的結(jié)晶顆粒形式存在，淀粉酶不能與淀粉分子接觸，因此不能起到水解淀粉的作用。當(dāng)?shù)矸蹜乙杭訜岬捷^高溫度時(shí)，淀粉顆粒吸水膨脹，發(fā)生糊化現(xiàn)象，這時(shí)淀粉水解酶才可以充分接觸淀粉分子從而使淀粉水解。淀粉的糊化溫度一般在60℃以上，因此工業(yè)上使用的淀粉水解酶一般需要具有較高的耐熱性。溫泉是篩選耐熱細(xì)菌的寶庫(kù)，同時(shí)也是獲得耐熱型淀粉水解酶及其基因資源的寶庫(kù)。我國(guó)科學(xué)家對(duì)騰沖溫泉中耐熱細(xì)菌資源的多樣性及組成進(jìn)行了詳細(xì)的研究，并從中篩選出大量有應(yīng)用價(jià)值的耐熱型細(xì)菌［1-6］。云南省騰沖縣是我國(guó)溫泉資源最豐富的地區(qū)之一，擁有大小數(shù)百個(gè)溫泉。本文以騰沖縣臘幸村溫泉群中一個(gè)未經(jīng)開發(fā)的小型溫泉為例，對(duì)其中具有淀粉降解能力的細(xì)菌進(jìn)行分離鑒定，為進(jìn)一步開發(fā)新型耐熱淀粉酶提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源 云南省騰沖縣臘幸村一小型溫泉。

1.1.2 培養(yǎng)基 高溫菌培養(yǎng)基:酵母膏1 g，蛋白胨1 g，硫酸鎂0.1 g，硝酸鉀0.1 g，硝酸鈉0.69 g，磷酸鈉0.1 g，硫酸亞鐵0.002 g，微量元素溶液1 mL，瓊脂粉15 g，定容至1 L并調(diào)整pH至7;微量元素溶液:在2 L燒杯中加入900 mL純凈水，煮沸后冷卻至50℃以下，加入EDTA0.1 g充分溶解，依次加入硫酸錳0.05 g，硫酸銅0.02 g，六水硝酸鈷0.01 g，十水硼酸鈉0.02 g，鉬酸銨0.01 g，硫酸鋅0.096 g;淀粉-臺(tái)盼藍(lán)培養(yǎng)基:可溶性淀粉10 g/L，蛋白胨2 g/L，酵母膏2 g/L，NaCl 5 g/L，Trypan blue 0.1 g/L，pH 7.2～7.4。

1.2 方法

1.2.1 產(chǎn)淀粉酶高溫菌的篩選 稱取樣品懸浮于水中，適當(dāng)稀釋后涂布于高溫菌培養(yǎng)基上，65℃培養(yǎng)24 h。選擇單菌落點(diǎn)種淀粉培養(yǎng)基平板，55℃培養(yǎng)48 h，觀察透明圈。根據(jù)菌落形態(tài)，挑取淀粉平板上不同形態(tài)透明圈的菌落，在淀粉培養(yǎng)基平板上劃線分離，55℃培養(yǎng)48 h，進(jìn)一步觀察菌落周圍是否有透明圈。有透明圈的細(xì)菌初定為產(chǎn)淀粉酶細(xì)菌，斜面保存。

1.2.2 產(chǎn)淀粉酶細(xì)菌的分子鑒定 細(xì)菌染色體DNA的提取按文獻(xiàn)［7］介紹的方法進(jìn)行。斜面上挑取1環(huán)菌體于50 μL無(wú)菌水中，混勻后加入100 μL裂解液，混勻，85℃保溫15 min即得到染色體DNA粗提液，離心后取1 μL直接用于后續(xù)PCR。細(xì)菌16S rDNA基因擴(kuò)增方法如下:取200 μL PCR管1支，分別加入36.5 μL去離子水，10×Buffer 5 μL，dNTP 5 μL，引物P16sUP和P16sDW，各1 μL，Taq酶0.5 μL，上述染色體DNA粗提液1 μL。PCR程序:95℃ 5 min;95℃ 0.5 min，50℃ 1 min，72℃，1.5 min，30個(gè)循環(huán);72℃ 10 min。PCR反應(yīng)引物序列:P16sUP:5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3';P16sDW:5'-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3'。PCR產(chǎn)物送上海生工生物工程公司測(cè)序。利用美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心的BLAST軟件將測(cè)序結(jié)果與GenBank收錄的序列進(jìn)行同源性搜索比對(duì)。

1.2.3 淀粉酶發(fā)酵搖瓶培養(yǎng)條件 培養(yǎng)基組成:玉米淀粉2%，豆餅粉2%，(NH4)2SO40.2%，CaCl20.01%。接種細(xì)菌斜面培養(yǎng)物1環(huán)于上述液體培養(yǎng)基中，55℃搖瓶培養(yǎng)48 h，檢測(cè)淀粉酶酶活。淀粉酶酶活的測(cè)定參照“中華人民共和國(guó)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)QB1805.1-93:2-淀粉酶活力的試驗(yàn)方法”［8］進(jìn)行。酶活定義:1 h液化1 g可溶性淀粉所需酶量為1個(gè)酶活力單位，以U/mL表示。

1.2.4 酶學(xué)性質(zhì)的測(cè)定 分別配制pH 5～9(間隔0.5)的磷酸氫二鉀-檸檬酸緩沖液，測(cè)定酶在不同pH緩沖液中的酶活力，以最高酶活為100%計(jì)算相對(duì)酶活確定酶的最適作用pH。在pH 8.5的磷酸氫二鉀-檸檬酸緩沖液中，將酶液適當(dāng)稀釋，分別在50～80℃(間隔10℃)條件下檢測(cè)酶活。以最高酶活力為100%計(jì)算相對(duì)酶活確定酶的最適反應(yīng)溫度。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品初篩結(jié)果

所有樣品用生理鹽水適當(dāng)稀釋后直接涂布LB以及pH為7和9的高溫菌培養(yǎng)基，65℃培養(yǎng)24 h。根據(jù)樣品稀釋情況推算每克樣品形成的菌落數(shù)，結(jié)果見表1。

表1 不同培養(yǎng)基樣品微生物菌落數(shù)量統(tǒng)計(jì)Table1 Colony counts of hot spring samples on different culture plates

由表1可見，LB培養(yǎng)基雖然是細(xì)菌通用培養(yǎng)基，但是對(duì)于高溫菌的培養(yǎng)效果不佳。在所研究的樣品中，只有溫泉底部沙土中有3株菌可以在24 h內(nèi)形成菌落。本文所采集的水、沙土及腐殖質(zhì)均為堿性，但在中性高溫菌培養(yǎng)基上形成的菌落數(shù)遠(yuǎn)高于在pH 9的培養(yǎng)基上形成的菌落數(shù)，這說明自然界中嗜中性的細(xì)菌比較多。

2.2 降解淀粉細(xì)菌的篩選與鑒定

選擇上述平板上形態(tài)有差異的菌落，點(diǎn)種到淀粉-臺(tái)盼藍(lán)平板上，55℃培養(yǎng)48 h，觀察透明圈。結(jié)果顯示，在所選擇的共計(jì)約300個(gè)菌落中，大約有10%的菌落可以在淀粉-臺(tái)盼藍(lán)平板上形成透明圈。不同樣品獲得的菌落產(chǎn)生透明圈的情況見表2。

表2 樣品產(chǎn)淀粉酶菌落數(shù)量統(tǒng)計(jì)Table2 Colony counts of amylase producing bacteria in hot spring samples

由表2可見，從水樣中獲得的菌落數(shù)量少，且均不具有降解淀粉的能力。從菌落形態(tài)看，來源于水樣的細(xì)菌形成的菌落形態(tài)差異小，很可能來源于同一個(gè)或親緣關(guān)系接近的物種。在溫泉水底泥沙中獲得的菌落大約有8%具有降解淀粉的能力。腐殖質(zhì)中獲得的菌落大約有1/3具有降解淀粉的能力。腐殖質(zhì)中降解淀粉微生物含量高可能是這一環(huán)境中含有較多的淀粉等高分子有機(jī)物，具有這一類高分子分解能力的微生物具有生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)。

2.3 降解淀粉細(xì)菌的分子生物學(xué)鑒定

將上述34株具有淀粉降解能力的細(xì)菌劃線分離，取單菌落進(jìn)行16S rDNA基因序列分析。結(jié)果顯示，從腐殖質(zhì)中獲得的25株菌的16S rDNA序列幾乎完全一致，將這些序列提交美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心利用Blast軟件進(jìn)行序列相似性搜索比對(duì)，結(jié)果顯示，25株菌均與Anoxybacillus flavithermus(NCBI登錄號(hào):CP000922.1)最為接近，序列完全一致或僅有1～2個(gè)堿基差異。從菌落形態(tài)看，腐殖質(zhì)樣品中細(xì)菌含量豐富，但所形成的菌落形態(tài)差異小，分子鑒定的結(jié)果同樣顯示，這個(gè)樣品中降解淀粉的細(xì)菌種類不多。沙土來源的9株菌的鑒定結(jié)果如表3所示。

表3 沙土樣品中降解淀粉細(xì)菌分子鑒定結(jié)果Table3 Molecular identification of bacteria which could degrade starch in heat soil samples

由表3可見，沙土樣品中降解淀粉細(xì)菌的種類比較豐富，篩選獲得的9株菌分別屬于7個(gè)種、3個(gè)屬。從樣品涂布平板后形成的菌落情況看，溫泉底部沙土中細(xì)菌的數(shù)量雖然不大，但是細(xì)菌種類非常豐富，主要表現(xiàn)為2個(gè)特點(diǎn):一是菌落形態(tài)具有多樣性，二是在不同培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的細(xì)菌較多。分子鑒定的結(jié)果與根據(jù)菌落情況推測(cè)的結(jié)果一致。圖1為根據(jù)16S rDNA部分序列繪制的上述9株菌的分類與親緣關(guān)系。

圖1 溫泉沙土中產(chǎn)淀粉酶細(xì)菌的親緣關(guān)系Fig.1 Genetic relationships of amylase producing bacteria in heat soil samples of hot spring

2.4 部分細(xì)菌淀粉酶性質(zhì)初步分析

根據(jù)細(xì)菌在淀粉-臺(tái)盼藍(lán)平板上形成透明圈的情況看，其中201、208、207、209四株菌在平板上形成的透明圈較大。其中207和209分別為嗜熱脂肪土芽胞桿菌和地衣芽胞桿菌，國(guó)內(nèi)外對(duì)這2種細(xì)菌的淀粉酶及其基因已經(jīng)有很多研究。201和208兩株菌分別為熱葡糖苷酶地芽胞桿菌和黃熱厭氧芽胞桿菌。這2株菌的淀粉酶性質(zhì)國(guó)內(nèi)外均未見報(bào)道，因此本研究對(duì)這2株菌進(jìn)行搖瓶發(fā)酵后對(duì)其淀粉酶性質(zhì)進(jìn)行了初步研究。201菌株搖瓶發(fā)酵48 h后發(fā)酵液酶活達(dá)到0.2 U/mL，208菌株酶活為0.3 U/mL。2株菌所產(chǎn)淀粉酶基本性質(zhì)如圖2、圖3所示:201菌株淀粉酶最適溫度為70℃，在70～80℃范圍內(nèi)酶活基本穩(wěn)定，最適pH為8，在pH 8～9范圍內(nèi)酶活穩(wěn)定，是一種有較高耐熱性的堿性淀粉酶;208菌株淀粉酶最適反應(yīng)溫度為60℃，最適pH為7，在pH 7～8范圍內(nèi)酶活基本穩(wěn)定，是一種中性中溫淀粉酶。雖然上述2株菌均來源于pH 9的堿性環(huán)境，但其淀粉酶在pH 10的環(huán)境中酶活大部分喪失。

圖2 溫度對(duì)淀粉酶活力的影響Fig.2 Effects of temperature on the activity of amylase

圖3 pH對(duì)淀粉酶活力的影響Fig.3 Effects of pH on the activity of amylase

3 討論

本研究采用純培養(yǎng)技術(shù)從溫泉中篩選產(chǎn)淀粉酶的耐熱細(xì)菌。從培養(yǎng)結(jié)果看，采用高溫菌培養(yǎng)基培養(yǎng)獲得的細(xì)菌數(shù)量和種類均遠(yuǎn)大于LB培養(yǎng)基，這表明改進(jìn)培養(yǎng)方法對(duì)更好地開發(fā)溫泉細(xì)菌資源具有重要的作用。對(duì)溫泉不同部位微生物研究結(jié)果顯示，溫泉底部腐殖質(zhì)和沙土中微生物種類和數(shù)量較大。李華蘭［3］等利用變性凝膠電泳(DGGE)方法對(duì)騰沖熱海大滾鍋和龍陵縣邦臘掌大沸泉中細(xì)菌進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，其底部細(xì)沙中存在豐富的原核生物多樣性。李沁元等［2］利用DGGE技術(shù)分析騰沖熱海三溫泉中細(xì)菌多樣性，發(fā)現(xiàn)溫泉中菌藻席和底部沉積物中細(xì)菌種類非常豐富。在近期的一項(xiàng)研究中，研究者采用454焦磷酸測(cè)序技術(shù)對(duì)騰沖縣熱海和瑞滇2個(gè)溫泉群的細(xì)菌群落進(jìn)行了詳細(xì)的分析［9］。瑞滇溫泉群與本文采樣區(qū)臘幸溫泉群可能屬于同一溫泉群，該項(xiàng)研究結(jié)果顯示，瑞滇溫泉沉淀物中的細(xì)菌多樣性高于水體。本文采用微生物純培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行研究，結(jié)論與上述研究者利用免培養(yǎng)技術(shù)獲得的結(jié)果相似，即溫泉中泥沙等固體上附著了大量微生物，并且具有豐富的細(xì)菌多樣性。溫泉底部沙土中微生物的數(shù)量比腐殖質(zhì)中的少，但其微生物種類非常豐富，從沙土中篩選獲得的9株降解淀粉的細(xì)菌，分別屬于7個(gè)種，3個(gè)屬，各菌株間16S rDNA序列均有一定的差異。其中201號(hào)和208號(hào)2株菌分別為Geobacillus thermoglucosidasius和Anoxybacillus flavithermus，對(duì)其胞外淀粉酶進(jìn)行初步分析，結(jié)果顯示2株菌所產(chǎn)胞外淀粉酶最適溫度分別為60和70℃，接近或超過淀粉糊化溫度，具有一定的應(yīng)用潛力。

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