陳弘昊，李作揚(yáng)，陳泉睿，何潔，趙歡，王斌

(1.大連海洋大學(xué) 遼寧省海洋生物資源恢復(fù)與生境修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連 116023；2.大連海洋大學(xué) 海洋科技與環(huán)境學(xué)院，遼寧 大連 116023)

多環(huán)芳烴(Polycyclic Aromatic Hydrocarbons，PAHs)作為石油的主要成分，是最早發(fā)現(xiàn)的強(qiáng)致癌物[1]。由于其高疏水性和化學(xué)穩(wěn)定性，極易在人體內(nèi)富集，致癌、致畸和致突變[2-3]，目前人類生態(tài)環(huán)境受到了多環(huán)芳烴的嚴(yán)重污染，因此，PAHs被美國環(huán)保局列入了129種優(yōu)先控制環(huán)境污染物的黑名單[4]。全世界每年大約有23萬t多環(huán)芳烴污染物進(jìn)入海洋環(huán)境[5]。此外，大氣中的PAHs通過遷移、沉降等作用進(jìn)入水體和土壤，水環(huán)境中的PAHs最終也將以沉積形式存在，而土壤中PAHs會通過擴(kuò)散和滲透作用進(jìn)入地下水或者被植物吸收進(jìn)入食物鏈。因此，土壤是多環(huán)芳烴污染物存在的主要生態(tài)環(huán)境[6]。全球范圍內(nèi)普遍存在土壤和海洋等區(qū)域多環(huán)芳烴污染的問題[7]，陸地和海洋中石油的開采、儲運(yùn)和加工等過程中均可造成PAHs在土壤和海底的沉積，形成鹽漬化石油污染的土壤和沿海灘涂[8]，鹽漬化土壤這類高鹽環(huán)境的污染影響更加惡劣[9]，其修復(fù)難度更大。

近年來，國內(nèi)許多相關(guān)研究人員致力于從高度污染區(qū)域中篩選出高效降解PAHs的菌株，并對其降解性能進(jìn)行初步研究[10]。倪雪等[11]從受到PAHs污染的植物體內(nèi)分離到兩株菲降解菌，鄧軍等[12]從PAHs污染較嚴(yán)重的土壤中分離到一株P(guān)AHs降解菌，田志剛等[13]也從勝利油田附近石油污染區(qū)篩選到一株P(guān)AHs降解菌。此外，也有關(guān)于耐鹽細(xì)菌對常溫和低溫高鹽土壤中PAHs降解情況的報(bào)道[14-17]，而有關(guān)海洋環(huán)境PAHs污染細(xì)菌降解的報(bào)道較少。鑒于目前石油泄漏、工業(yè)排放所造成的海水及沉積質(zhì)PAHs污染的生物修復(fù)需求，本研究中選用分離自遼寧盤錦紅海灘地區(qū)翅堿蓬根系土壤及沿海灘涂土壤中分離出的高效降解石油菌株，處理高鹽水環(huán)境中的4種多環(huán)芳烴(萘、菲、惹烯、苯并[α]芘)，采用氣質(zhì)聯(lián)用(GC-MS)技術(shù)測定處理前后目標(biāo)化合物含量，同時研究試驗(yàn)菌株在不同濃度的共代謝基質(zhì)(葡萄糖)存在下對4種多環(huán)芳烴標(biāo)志物的降解效率，以期為高鹽污水和海洋環(huán)境PAHs污染物的降解和生物修復(fù)篩選功能菌株，為今后實(shí)際應(yīng)用提供借鑒參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)菌種為遼寧省海洋生物資源恢復(fù)與生境修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室從翅堿蓬根系及其土壤中篩選出的對柴油具有高降解性能的微桿菌Microbacteriumsp.(編號S1)、劉志恒菌Zhihengliuellasp.(編號G12)[18]，以及分離自遼寧盤錦沿海灘涂土壤的惡臭假單胞菌Pseudomonputida(編號Y3)[19]，菌種凍存管使用2216E液體培養(yǎng)基活化后使用。

試驗(yàn)用培養(yǎng)基分別為2216E液體培養(yǎng)基及固體培養(yǎng)基、無機(jī)鹽基礎(chǔ)培養(yǎng)基、PAHs-無機(jī)鹽培養(yǎng)基。無機(jī)鹽基礎(chǔ)培養(yǎng)基包含NaCl(20 g/L)、NH4Cl(0.5 g/L)、KH2PO4(0.5 g/L)、K2HPO4(1 g/L)、KC1(0.01 g/L)、MgSO4·7H2O(0.5 g/L)、CaC12(0.002 g/L)、FeSO4(0.01 g/L)、蒸餾水(pH 7.2)。PAHs-無機(jī)鹽培養(yǎng)基是用丙酮(分析純，生工)充分溶解萘、菲、惹烯和苯并[α]芘4種PAHs，再用微孔濾膜過濾除菌后添加進(jìn)已滅菌的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，過夜使丙酮充分揮發(fā)后制成[20]。本研究中苯并[α]芘的濃度依照中華人民共和國國家海水水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)[21]為基礎(chǔ)進(jìn)行設(shè)置，其他3種目標(biāo)PAHs以苯并[α]芘濃度為基準(zhǔn)，終濃度均為20 mg/L。

1.2 方法

本研究中依照海水水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)GB 3097-1997[21]為基礎(chǔ)，設(shè)置4種PAHs加標(biāo)無機(jī)鹽培養(yǎng)基，預(yù)先通過氣質(zhì)聯(lián)用儀測定并繪制出標(biāo)準(zhǔn)品的濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線，對3株菌作用7 d后，培養(yǎng)基中殘留的PAHs進(jìn)行測定。

1.2.1 色譜條件設(shè)置 采用氣相-質(zhì)譜(GC-MS)分析對萘、菲、惹烯和苯并[α]芘4種PAHs的含量進(jìn)行測定，參考國家石油化工行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)(SH/T 0606—94)[22]及多環(huán)芳烴標(biāo)準(zhǔn)品說明書設(shè)置具體色譜條件，結(jié)果見表1。

表1 萘、菲、惹烯、苯并[α]芘色譜條件Tab.1 Chromatographic conditions of naphthalene,phenanthrene,retene, and benzo [α] pyrene

1.2.2 4種PAHs標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 采用外標(biāo)法對4種多環(huán)芳烴標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行定量檢測。以正己烷作為溶劑，分別準(zhǔn)確配制濃度為2、20、200 mg/L的萘、菲、惹烯、苯并[α]芘標(biāo)準(zhǔn)液。按表1設(shè)置條件進(jìn)樣測定。根據(jù)Agilent 7890B/5977A型GC—MS儀器對不同濃度的4種多環(huán)芳烴標(biāo)準(zhǔn)品測定結(jié)果，使用Agilent MassHunter定量分析軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，使用最小二乘法進(jìn)行線性擬合得到標(biāo)準(zhǔn)曲線(表2)，4種曲線的相關(guān)性系數(shù)R2均大于0.98，擬合度較好，可用于后續(xù)試驗(yàn)中萘、菲、惹烯、苯并[α]芘含量測定。

1.2.3 3株菌在4種PAHs-無機(jī)鹽培養(yǎng)基中生長的測定 取3株菌的2216E液體培養(yǎng)物(1×109CFU/mL)0.1 mL，分別接種于50 mL PAHs-無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基中，每組設(shè)置3個平行，以不接菌的培養(yǎng)基作為對照組，置于30 ℃下避光恒溫培養(yǎng)7 d后，用2216E平板測定其生長情況。同時分別配制葡萄糖濃度為0、0.5、1.0、1.5 g/L的4種PAHs-機(jī)鹽培養(yǎng)基，同法接入3株試驗(yàn)菌并測定其生長情況。

表2萘、菲、惹烯、苯并[α]芘標(biāo)準(zhǔn)曲線及其相關(guān)系數(shù)

Tab.2Formulaofstandardcurvesandcorrelationcoefficientsofnaphthalene,phenanthrene,retene,benzo[α]pyrene

多環(huán)芳烴PAHs標(biāo)準(zhǔn)曲線standard curve相關(guān)系數(shù)R2萘 naphthaleney=0.0025x+4686.10.9990菲 phenanthreney=0.0012x-90360.9933惹烯 reteney=0.297x+3101.40.9997苯并[α]芘 benzo [α] pyreney=0.0715x-4614.90.9989

1.2.4 3株菌對4種多環(huán)芳烴降解性能的測定 將3株菌的2216E液體培養(yǎng)物(1×109CFU/mL)按1%的接種量，分別接種于含不同濃度葡萄糖(0、0.5、1.0、1.5 g/L)的PAHs-無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，每組設(shè)置3個平行，以不接菌的培養(yǎng)基作為對照組，置于25 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)箱中以160 r/min避光培養(yǎng)7 d。利用紫外分光光度法測定菌懸液的OD值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線換算出菌體數(shù)[18]，同時滴加5 mL二氯甲烷(色譜純)至培養(yǎng)液中，混勻后移入分液漏斗，再取5 mL二氯甲烷清洗管壁黏附的多環(huán)芳烴，清洗液移入分液漏斗中，充分震蕩后靜置直至分層，收集分液漏斗下方有機(jī)相，移入1.5 mL色譜瓶中作為萃取液密封備用。將上述所得萃取液上機(jī)檢測，分別進(jìn)行定性、定量分析。其中降解率及平均降解速率計(jì)算公式為

自然降解率=(m0-m1)/m0×100%,

試驗(yàn)菌降解率=(m1-m2)/m0×100%,

降解速率 =(m1-m2)/(n×t)。

其中：m0為培養(yǎng)基中加標(biāo)的PAHs含量(ng)；m1為不接菌對照組7 d后的PAHs含量(ng)；m2為接入3株試驗(yàn)菌培養(yǎng)7 d后的殘余PAHs含量(ng)；n為培養(yǎng)基中活菌數(shù)(CFU/mL)；t為降解時間(d)。

3株菌在作用同樣時間(7 d)后，同法測定其培養(yǎng)基中PAHs殘余含量，采用平板菌落計(jì)數(shù)法，同時測定每個樣品中的活菌數(shù)，用上述降解速率公式，計(jì)算出單位活細(xì)胞對4種PAHs的降解速率。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)結(jié)果使用Agilent MassHunter Qualitalive Analysis、Alient MassHunter 軟件進(jìn)行定量分析，應(yīng)用SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析和Duncan多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄糖對3株菌在PAHs-無機(jī)鹽培養(yǎng)基中生長的影響

從圖1～圖4可見：在無葡萄糖的4種PAHs-無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，3種菌生長情況均較好的是萘-無機(jī)鹽培養(yǎng)基，S1、Y3和G12 菌株的菌量分別為4.12×109、3.12×109、2.00×109CFU/mL，說明3株菌均能較好地利用萘為碳源；無葡萄糖添加的其他3種PAHs-無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，3株菌生長均較差，生長量依次為菲-無機(jī)鹽培養(yǎng)基、苯并[α]芘-無機(jī)鹽培養(yǎng)基和惹烯-無機(jī)鹽培養(yǎng)基。添加葡萄糖后，3株菌生長情況均有明顯提高，除苯并[α]芘-無機(jī)鹽培養(yǎng)基在1.5 g/L葡萄糖時較其他濃度組略有降低外，各葡萄糖濃度組均顯著高于不加糖組(P<0.05)；3株菌在萘、菲和惹烯3種PAHs培養(yǎng)基內(nèi)生長量均與含糖量成正比，3株菌間比較顯示，S1菌株在不同濃度葡萄糖的萘、菲和惹烯培養(yǎng)基中生長量均最大，在0.5、1.0 g/L葡萄糖濃度的3種PAHs-無機(jī)鹽培養(yǎng)基和1.5 g/L葡萄糖濃度的惹烯-無機(jī)鹽培養(yǎng)基中均明顯優(yōu)于Y3和G12菌株，且有顯著性差異(P<0.05)，而Y3菌株和G12菌株生長量則無顯著性差異(P>0.05)；G12菌株在不同濃度葡萄糖的苯并[α]芘-無機(jī)鹽培養(yǎng)基中生長量最大，但僅在1.0 g/L葡萄糖濃度時G12菌株生長量與S1菌株有顯著性差異(P<0.05)，其他濃度下3菌株生長量均無顯著性差異(P>0.05)。

注：標(biāo)有不同大寫字母表示同一菌株不同葡萄糖濃度間生長量有顯著性差異(P<0.05)，標(biāo)有不同小寫字母表示同一葡萄糖濃度不同菌株間有顯著性差異(P<0.05)，標(biāo)有相同字母者表示組間無顯著性差異(P>0.05)，下同Note：The means with different capital letters are significantly different at different glucose concentrations in the same strain at the 0.05 probability level; the means with different letters being significantly different in different strains at the same glucose concentration at the 0.05 probability level, and the means with the same letters are not significant differences, et sequentia圖1 3株菌在不同葡萄糖濃度的萘-無機(jī)鹽培養(yǎng)基中的生長情況Fig.1 Growth of 3 strains in naphthalene-mineral medium containing different concentrations of glucose

圖2 3株菌在不同葡萄糖濃度的菲-無機(jī)鹽培養(yǎng)基中的生長情況Fig.2 Growth of 3 strains in phenanthrene-mineral medium containing different concentrations of glucose

圖3 3株菌在不同葡萄糖濃度的惹烯-無機(jī)鹽培養(yǎng)基中的生長情況Fig.3 Growth of 3 strains in retene-mineral medium containing different concentrations of glucose

圖4 3株菌在不同葡萄糖濃度的苯并[α]芘-無機(jī)鹽培養(yǎng)基中的生長情況Fig.4 Growth of 3 strains in benzo [α] pyrene-mineral medium containing different concentrations of glucose

2.2 葡萄糖對3株菌降解速率的影響

2.2.1 試驗(yàn)菌對萘的降解率及單位細(xì)胞的降解速率 經(jīng)計(jì)算得出，萘在含0、0.5、1.0、1.5 g/L葡萄糖的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中7 d后，自然降解率分別為5.49%、8.57%、7.52%、6.84%。從圖5可見：不添加葡萄糖時，S1、Y3和G12菌株對萘的降解率分別為13.40%、19.92%、16.84%，且3株菌間無顯著性差異(P>0.05)；不同濃度葡萄糖可提高3株菌對萘的降解率，3株菌對萘的降解率在添加1.0 g/L葡萄糖時與無糖組和0.5 g/L葡萄糖組有顯著差異(P<0.05)，在1.0 g/L葡萄糖濃度時3株菌對萘的降解率依次為Y3(70.56%)>G12(67.82%)>S1(57.46%)。

圖5 3株菌對標(biāo)準(zhǔn)品萘的降解率Fig.5 Degradation proportion of 3 strains on naphthalene

從圖6可見：通過計(jì)算單個細(xì)胞對萘的降解速率得出，無葡萄糖添加時，S1菌株對萘的降解速率最高，達(dá)到5.606×10-8ng/(CFU·d)，G12菌株和Y3菌株對萘的降解速率依次為2.132×10-8、1.342×10-8ng/(CFU·d)，S1菌株與其他2株菌(Y3、G12菌株)相比有顯著性差異(P<0.05)，但Y3與G12菌株間無顯著性差異(P>0.05)；隨著葡萄糖濃度的增加，3株菌單個細(xì)胞的降解速率皆呈降低趨勢，其中S1菌株較無糖組顯著降低(P<0.05)，最低降至5.257×10-9ng/(CFU·d)，減小了一個數(shù)量級。

圖6 3株菌對標(biāo)準(zhǔn)品萘的降解速率Fig.6 Degradation efficiencies of 3 strains on naphthalene

2.2.2 試驗(yàn)菌對菲的降解率及單位細(xì)胞的降解速率 經(jīng)計(jì)算得出，菲在含0、0.5、1.0、1.5 g/L葡萄糖的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中7 d后，自然降解率分別為1.34%、1.76%、3.94%、3.34%。從圖7可見：無糖組中，G12菌株對菲的降解率最高(22.04%)，其次為Y3(17.33%)和S1菌株(11.24%)，且3株菌間無顯著性差異(P>0.05)；Y3、S1和G12菌株對菲的降解率在添加1.0 g/L葡萄糖時提升最顯著，分別為62.15%、60.51%、59.77%，且與無糖組和0.5 g/L葡萄糖組有顯著性差異(P<0.05)，各葡萄糖濃度下，3株菌間降解率無顯著性差異(P>0.05)。

圖7 3株菌對標(biāo)準(zhǔn)品菲的降解率Fig.7 Degradation proportion of 3 strains on phenanthrene

從圖8可見：Y3菌株在無葡萄糖添加時，具有較高的菲降解速率[1.092×10-7ng/(CFU·d)]，與S1菌株[2.569×10-8ng/(CFU·d)]相比有顯著性差異(P<0.05)，與G12菌株[7.975×10-8ng/(CFU·d)]無顯著性差異(P>0.05)；隨葡萄糖濃度的增加，3株菌對菲的降解速率均呈下降趨勢，且均較無糖組顯著下降(P<0.05)，各葡萄糖濃度下，3株菌對菲的降解速率或同一葡萄糖濃度下不同菌株之間均無顯著性差異(P>0.05)。

圖8 3株菌對標(biāo)準(zhǔn)品菲的降解速率Fig.8 Degradation efficiencies of 3 strains on phenanthrene

2.2.3 試驗(yàn)菌對惹烯的降解率及單位細(xì)胞的降解速率 經(jīng)計(jì)算得出，惹烯在含0、0.5、1.0、1.5 g/L葡萄糖的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中7 d后，自然降解率分別為0%、3.79%、1.20%、1.49%。從圖9可見：無葡萄糖組，S1 、Y3和G12菌株對惹烯的降解率分別為0.05%、 5.18%和10.22%，且3株菌間有顯著性差異(P<0.05)，降解率依次為G12>Y3>S1；添加0.5 g/L葡萄糖濃度時，3株菌降解率均有所提高，降解率依次為G12>Y3>S1，與無葡萄糖添加相比，S1菌株對惹烯的降解率顯著提高(P<0.05)，Y3、G12菌株增加不顯著(P>0.05)；添加1.0 g/L葡萄糖時，3株菌對惹烯的降解率達(dá)到最高，降解率依次為Y3(66.49%)>G12(66.42%)>S1(66.18%)；添加1.5 g/L葡萄糖濃度時，3株菌的降解率與1.0 g/L時的降解率無顯著性差異(P>0.05)，且3株菌間也無顯著性差異(P>0.05)。

圖9 3株菌對標(biāo)準(zhǔn)品惹烯的降解率Fig.9 Degradation proportion of 3 strains on retene

從圖10可見：在無葡萄糖添加情況下，G12、Y3和S1菌株對惹烯的降解速率分別為3.859×10-7、1.012×10-7、6.835×10-8ng/(CFU·d)，G12菌株顯著高于S1和Y3菌株(P<0.05)；在添加不同濃度葡萄糖后，G12菌株對惹烯的降解速率顯著降低(P<0.05)，其他2株菌對惹烯的降解速率也顯著降低(P<0.05)，但幅度不如G12菌株，不同葡萄糖濃度下3株菌對惹烯的降解速率相差不大，同一葡萄糖濃度下不同菌株間也無顯著性差異(P>0.05)。

圖10 3株菌對標(biāo)準(zhǔn)品惹烯的降解速率Fig.10 Degradation efficiencies of 3 strains on retene

2.2.4 試驗(yàn)菌對苯并[α]芘降解率及單位細(xì)胞的降解速率 經(jīng)計(jì)算得出，苯并[α]芘在含0、0.5、1.0、1.5 g/L葡萄糖的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中7 d后，自然降解率分別為0.05%、0.06%、1.75%、1.86%。從圖11可見：無糖添加時，S1、Y3和G12菌株對苯并[α]芘的降解率分別為2.49%、5.46%和5.49%，且3株菌間無顯著性差異(P>0.05)；添加0.5 g/L葡萄糖濃度時，3株菌對苯并[α]芘的降解率顯著提高，降解率依次為S1>Y3>G12，但3株菌間降解率無顯著性差異(P>0.05)；1.0、1.5 g/L濃度組間的降解率和同一濃度下各菌株對苯并[α]芘的降解率均無顯著性差異(P>0.05)，最高分別為S1(71.91%)、Y3(71.25%)和G12菌株(70.50%)。

圖11 3株菌對標(biāo)準(zhǔn)品苯并[α]芘的降解率Fig.11 Degradation proportion of 3 strains on benzo [α] pyrene

從圖12可見：在無糖添加時，G12菌株對苯并[α]芘的降解速率為3株菌中最高，達(dá)到1.943×10-8ng/(CFU·d)，其次為Y3菌株，為1.244×10-8ng/(CFU·d)，S1菌株最低，為9.651×10-9ng/(CFU·d)；3株菌對苯并[α]芘的降解速率均隨葡萄糖添加量的增加呈下降趨勢，3株菌對苯并[α]芘的降解速率在加糖后均顯著低于不加糖組(P<0.05)，G12菌株在0.5 g/L和1.0 g/L葡萄糖時對苯并[α]芘的降解速率顯著高于其他2株菌(P<0.05)，在1.5 g/L葡萄糖時3株菌對苯并[α]芘的降解速率無顯著性差異(P>0.05)。

圖12 3株菌對標(biāo)準(zhǔn)品苯并[α]芘的降解速率Fig.12 Degradation efficiencies of 3 strains on benzo [α] pyrene

3 討論

3.1 試驗(yàn)菌株對4種PAHs的降解性能

本研究中選用的3株菌中，S1菌株是翅堿蓬根系表面附著細(xì)菌，經(jīng)鑒定為微桿菌屬M(fèi)icrobacteriumsp.，G12菌株是翅堿蓬根系內(nèi)生菌，經(jīng)鑒定為劉志恒菌Zhihengliuellsp.，Y3菌株為惡臭假單胞菌Pseudomonasputida，3株菌均耐鹽生長。3株菌在無糖的4種PAHs-無機(jī)鹽培養(yǎng)基中的生長狀況顯示，在萘-無機(jī)鹽培養(yǎng)基中生長狀況最好，在菲、惹烯、苯并[α]芘-無機(jī)鹽培養(yǎng)基中長勢較弱。分析其原因，可能與萘結(jié)構(gòu)簡單易于分解有關(guān)[23]。添加葡萄糖后，3株菌在4種PAHs-無機(jī)鹽培養(yǎng)基中的生長量均有顯著增加，G12菌株在葡萄糖添加量為1.0 g/L的苯并[α]芘-無機(jī)鹽培養(yǎng)基中的生長量是無糖對照組的4倍，長勢優(yōu)于S1和Y3菌株。S1菌株在無糖的萘和菲-無機(jī)鹽培養(yǎng)基中生長量高于其他2株菌，當(dāng)葡萄糖添加量為1.0 g/L時，S1菌數(shù)與無糖添加時相比，分別增加了兩個數(shù)量級(菲)和一個數(shù)量級(萘)。因此，S1菌株對結(jié)構(gòu)簡單的萘具有較好的利用性，G12菌株對結(jié)構(gòu)復(fù)雜的苯并[α]芘有更好的利用性能，1.0 g/L葡萄糖即可顯著提高3株菌在4種PAHs-無機(jī)鹽培養(yǎng)基中的生長量。

對比4種PAHs的自然降解率和在含糖培養(yǎng)基中的降解率數(shù)據(jù)，萘的自然降解率最高，為5.49%，其他依次為菲、惹烯、苯并[α]芘，說明低分子量芳香烴較易在自然條件下被降解，而高分子量的苯并[α]芘較難以自行降解。培養(yǎng)基中加入不同濃度葡萄糖后，自然降解率有所改變，但差異不顯著。3株試驗(yàn)菌在無糖添加時，均可有效降解4種PAHs，除S1菌株對惹烯的降解性能較差外，其他2株菌對惹烯的降解率與自然降解率比較，差異明顯。添加葡萄糖后可顯著提高3株菌對4種PHAs的降解率，雖然添加1.0、1.5 g/L葡萄糖濃度時3株菌的降解率均較高，但二者無顯著性差異，從經(jīng)濟(jì)角度考慮，認(rèn)為最適添加濃度為1.0 g/L。3株菌單位細(xì)胞降解速率結(jié)果顯示，3株菌在添加不同濃度葡萄糖時，單位細(xì)胞的降解速率出現(xiàn)明顯下降，且與葡萄糖濃度成反比關(guān)系。

目前，有關(guān)微生物降解PAHs的研究主要為土壤環(huán)境分離菌的相關(guān)報(bào)道，徐中陽等[24]、 廉景燕等[25]僅報(bào)道了不同種假單胞菌在3～4 d時對較高濃度加標(biāo)萘的降解性能，而對耐鹽微生物對PAHs的降解性能研究較少。王慧等[14]利用5%鹽度礦物培養(yǎng)基(MSM)從石油污染土壤中富集分離出一株能降解多種PAHs的嗜鹽菌TSL5-2菌株，鑒定為海旋菌Thalassospirasp.，該菌在5%鹽度下25 d內(nèi)，對菲、芘、熒蒽(初始質(zhì)量濃度均為20 mg/L)、苯并蒽(初始質(zhì)量濃度為8 mg/L)具有不同的降解率，但不能降解苯并[α]芘。王春明等[15]從勝利油泥中分離到的微桿菌3-28菌株Microbacteriumsp.3-28在萘、菲-無機(jī)鹽培養(yǎng)基中生長狀況較好，對萘、菲、蒽和芘均有較高的降解能力，單獨(dú)作用112 h后萘與菲完全降解，而蒽和芘28 d時的降解率分別為97.54%、90.2%，3-28菌株也能夠在鹽度為10～30 g/kg的環(huán)境中良好生長。本研究中,PAHs濃度設(shè)置為20 mg/L，無葡萄糖添加時，微桿菌S1對4種PAHs的降解率均較低，在添加葡萄糖后，S1對萘、菲、惹烯、苯并[α]芘的降解率均有大幅提高，這與微桿菌3-28有一定差別。綜上所述，土壤中存在的假單胞菌、微桿菌中的菌株具有降解不同PAHs的能力，同時能夠耐鹽生長。有關(guān)劉志恒菌(G12菌株)對PAHs降解性能的研究尚未見報(bào)道，尤其該菌株為翅堿蓬根系內(nèi)生菌，因此，與翅堿蓬的相關(guān)性及在環(huán)境中的作用今后需要深入研究。另外，G12菌株的生物學(xué)特性目前也較少報(bào)道。本研究結(jié)果表明，該菌在無葡萄糖添加時，除對萘的降解率低于其他2株菌外，對菲、惹烯和苯并[α]芘的降解率明顯高于S1菌株。鑒于這2株菌均分離自翅堿蓬，因此，該菌株作為灘涂耐鹽植物共棲菌，可能在去除沿海沉積質(zhì)中PAHs污染物方面具有潛在應(yīng)用價值。

3.2 試驗(yàn)菌株對PHAs降解的共代謝作用機(jī)理

自然界微生物對很多復(fù)雜有機(jī)物的降解均存在共代謝作用。微生物共代謝(cometabolism)作用機(jī)理包括3種形式：第一種，基本生長基質(zhì)存在時，可為微生物代謝提供充足的碳源和能源，同時誘導(dǎo)微生物產(chǎn)生降解非生長基質(zhì)的某些關(guān)鍵酶[26]；第二種，某些污染物在自然界中難于降解的根本原因在于微生物缺乏某些特定的關(guān)鍵酶或酶的活性不高[27]，如果微生物本身存在對這些物質(zhì)的降解酶類，但酶活性并不高，從而使這種非生長基質(zhì)不能有效利用，微生物生長緩慢，而共代謝物作為生長基質(zhì)提供了基礎(chǔ)碳源和能源，促進(jìn)了微生物的生長，群體的降解性能得到大幅度提升；第三種，在自然環(huán)境中或者混合培養(yǎng)中，微生物之間存在共酶效應(yīng)，使得一種微生物部分分解的非生長基質(zhì)成為其他種類微生物的生長基質(zhì)，從而達(dá)到消除環(huán)境污染物的效果。

共代謝普遍存在于自然界不同環(huán)境中，當(dāng)出現(xiàn)微生物難以直接利用的化合物時，其以不同的形式促進(jìn)了環(huán)境污染物的降解。Chen等[28]運(yùn)用假單胞菌，以菲為共代謝底物，對加標(biāo)濃度為10 mg/L苯并[α]芘培養(yǎng)基作用48 h，苯并[α]芘的去除率為32%。鞏宗強(qiáng)等[29]在研究芘在土壤中的共代謝降解特性時發(fā)現(xiàn)，微生物對芘的自然降解作用較緩慢，一般半衰期為20 d，但加入共代謝底物后25 d時芘的降解率可達(dá)80%。李政等[30]采用假單胞菌等復(fù)合降油菌劑處理多環(huán)芳烴，發(fā)現(xiàn)單一多環(huán)芳烴的生物降解中，結(jié)構(gòu)簡單的芴和菲的降解效果最好，在第7天時基本生成其他產(chǎn)物，而芘的降解效果最差。當(dāng)3種多環(huán)芳烴混合降解時，芴、菲和芘分別在第3、5、8天時得到完全去除，呈現(xiàn)明顯的共代謝作用。近期刁碩等[16]報(bào)道了一株低溫耐鹽芘降解菌DYC-1菌株(紅球菌Rhodococcussp.)在高鹽和低溫狀況下，添加不同共代謝底物后對芘的降解特性結(jié)果顯示，葡萄糖、水楊酸和菲可顯著提高試驗(yàn)菌株對芘的降解率，其中添加0.1 g/L葡萄糖時，降解率可達(dá)30%。

本研究結(jié)果顯示，在未添加基礎(chǔ)碳源(葡萄糖)時，3種菌對4種PAHs均具有一定的降解作用，葡萄糖添加后3株菌較無糖時對PAHs的降解率大幅度提升，添加1.0 g/L葡萄糖時，對萘的降解率分別提高了44.06%(S1)、70.56%(Y3)和50.98%(G12)，對菲的降解率分別提高49.66%(S1)、45.87%(Y3)和38.29%(G12)，對惹烯的降解率分別提高66.13%(S1)、61.31%(Y3)和56.20%(G12)，對苯并[α]芘的降解率分別提高69.42%(S1)、65.79%(Y3)和65.01(G12)，單個細(xì)胞降解速率均大幅度降低。據(jù)此認(rèn)為，所采用的3株菌基本符合共代謝的第二個機(jī)理。從加糖后降解率提高的情況分析，結(jié)構(gòu)相對復(fù)雜的惹烯和苯并[α]芘降解率提升幅度較大，因此，不能排除細(xì)胞內(nèi)某種酶的活性發(fā)生改變，或某種酶被誘導(dǎo)產(chǎn)生的可能性，更為深入的分子機(jī)理有待下一步進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)的研究。

3.3 共代謝底物添加量對降解性能的影響

目前，土壤環(huán)境污染物的共代謝作用研究較多，包括多環(huán)芳烴的共代謝降解[31-32]。微生物對難降解有機(jī)物的共代謝基質(zhì)因不同環(huán)境、不同微生物和不同底物而不盡相同。就多環(huán)芳烴而言，某些低分子的多環(huán)芳烴本身也可以作為復(fù)雜多環(huán)芳烴的共代謝基質(zhì)[33-34]，不同共代謝底物使得微生物目標(biāo)化合物的降解率也有所不同。葡萄糖作為最基本的共代謝基質(zhì)對微生物降解復(fù)雜有機(jī)物有較確切的作用[17]。本研究中，葡萄糖的添加量根據(jù)前期研究工作中3株菌對柴油降解時葡萄糖的添加量而設(shè)計(jì)。陳芳艷等[35]在研究外加碳源條件下尖鐮孢菌對蒽的降解中發(fā)現(xiàn)，不同的葡萄糖濃度對蒽的降解情況有不同的影響，當(dāng)葡萄糖濃度為1 mg/L時，蒽的含量變化較??；當(dāng)葡萄糖濃度為5 mg/L時，蒽的去除率達(dá)到了95%；當(dāng)葡萄糖濃度增加到20 mg/L時，蒽的降解率降為84.8%。據(jù)此認(rèn)為，外源物質(zhì)的添加量是調(diào)控底物共代謝性能的主要考察指標(biāo)。在一定范圍內(nèi)，微生物對有機(jī)污染物的降解率隨添加物含量的增加而提高。但超過一定劑量后，添加物的含量過高則抑制微生物的代謝活性乃至改變其生長狀態(tài)。本研究中，葡萄糖的加入量為0.5 g/L時，3株菌對4種PAHs的降解率與無糖對照相比提高不夠顯著，當(dāng)葡萄糖添加到1.0 g/L時，3株菌對4種PAHs均顯著甚至極顯著的提高，但葡萄糖添加1.5 g/L與1.0 g/L時相比差異并不顯著，建議在實(shí)際應(yīng)用中，葡萄糖添加量選用1 g/L或1 g/kg。

共代謝基質(zhì)的添加是今后海洋多環(huán)芳烴污染修復(fù)中一個重要強(qiáng)化措施，本研究中所采用的3株菌中，S1和G12菌株分離自翅堿蓬，與翅堿蓬根系有較好的可接受性，可作為強(qiáng)化定植菌種用于構(gòu)建降油菌-翅堿蓬復(fù)合載體，Y3菌株也可用于根際土壤強(qiáng)化，形成降油細(xì)菌-植物修復(fù)系統(tǒng)，應(yīng)用于海洋灘涂沉積質(zhì)中石油類和多環(huán)芳烴類污染物的去除，同時以科學(xué)的方法添加共代謝底物，達(dá)到高速率的修復(fù)效果。在海洋環(huán)境多環(huán)芳烴的修復(fù)過程中，共代謝基質(zhì)的類型、添加量和添加方式是今后需要深入研究的問題。鑒于海洋環(huán)境多環(huán)芳烴污染的生物修復(fù)目前仍處于起步階段，菌種的選擇、環(huán)境影響因素、共代謝底物類型和降解菌共代謝的分子機(jī)理等均有待于深入的研究，力求能夠較系統(tǒng)地探明有關(guān)科學(xué)問題，有效采用生物修復(fù)技術(shù)解決海洋環(huán)境多環(huán)芳烴污染狀況。