秦麗云，郭玉梅，呂國(guó)平，王 莧，劇慧棟

(石家莊市疾病預(yù)防控制中心，河北石家莊 050011)

沙門(mén)菌(Salmonella)為革蘭陰性桿菌，具有周身鞭毛，有動(dòng)力，不產(chǎn)生芽胞，是重要的腸道致病菌。經(jīng)常污染食品、水體和土壤，引起動(dòng)物和人類(lèi)的感染。其血清型超過(guò)2 000個(gè)，我國(guó)已發(fā)現(xiàn)216個(gè)［1］，其引起的食源性疾病位居世界首位［2-3］，據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)由沙門(mén)菌引起的食物中毒也已居首位［4］，造成食物中毒的沙門(mén)菌是傷寒和副傷寒以外的血清型。引起中毒的食品主要是肉類(lèi)，其次是蛋類(lèi)、乳類(lèi)等。另外，隨著分子細(xì)菌學(xué)研究的開(kāi)展，有研究表明，沙門(mén)菌的侵襲蛋白(invasion protein，inv)決定細(xì)菌進(jìn)入宿主上皮細(xì)胞的能力，與沙門(mén)菌的致病性密切相關(guān)，它是由invA、invB、invC、invD和invE等一組基因編碼，其中invA為沙門(mén)菌的主要毒力因子［5］。本研究對(duì)2011至2012年期間發(fā)生在石家莊地區(qū)6起由沙門(mén)菌引起食物中毒的分離株進(jìn)行研究，了解分離株的毒力因子攜帶情況，分析菌株間的血清型和基因型的關(guān)系，為食物中毒診斷、溯源及流行病學(xué)研究提供科學(xué)的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來(lái)源 收集2011至2012年期間發(fā)生在石家莊市的3個(gè)市區(qū)、2個(gè)縣區(qū)、1個(gè)開(kāi)發(fā)區(qū)共6起食物中毒樣品分離的16株沙門(mén)菌。分子量標(biāo)準(zhǔn)菌株為沙門(mén)菌Braenderup血清型全球參考菌株H9812，由中國(guó)疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所提供。

1.1.2 試劑 分離培養(yǎng)基購(gòu)自北京陸橋技術(shù)公司，沙門(mén)菌顯色培養(yǎng)基購(gòu)自鄭州博賽生物技術(shù)公司，API 20E生化鑒定卡購(gòu)自法國(guó)梅里埃公司，沙門(mén)菌屬診斷血清購(gòu)自寧波天潤(rùn)藥業(yè)技術(shù)公司，沙門(mén)菌核酸測(cè)定試劑盒(熒光PCR法)購(gòu)自上海之江科技技術(shù)有限公司，SeaKem Gold Agarose購(gòu)自CAMBREX公司，XbaI核酸內(nèi)切酶、蛋白酶K均購(gòu)自TaKaRa公司。

1.1.3 儀器 ABI7500熒光定量 PCR儀(美國(guó)ABI)、脈沖場(chǎng)凝膠電泳儀(Bio-Rad CHEF Mapper)、旋轉(zhuǎn)式恒溫振蕩器、凝膠成像儀(Bio-Rad Gel XR)。

1.2 方法

1.2.1 食物中毒樣品檢測(cè)和菌株血清型測(cè)定收集發(fā)生在2011至2012年間6起食物中毒樣品32份，分別為剩余食品4份、病人吐瀉物16份、食品12份。參照GB 4789.4-2010［6］標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行致病菌的分離培養(yǎng)，用API 20E生化鑒定卡進(jìn)行生化鑒定，并用沙門(mén)菌分型血清進(jìn)行血清學(xué)分型，以確定沙門(mén)菌血清型。

1.2.2 沙門(mén)菌侵襲蛋白A(invA)基因的檢測(cè)采用沙門(mén)菌核酸測(cè)定試劑盒(熒光PCR法)，按照試劑盒操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行沙門(mén)菌invA基因的檢測(cè)，挑取分純的單個(gè)菌落加入含有1 000 μL無(wú)菌純水的EP管中，經(jīng)100℃金屬浴中煮沸10 min，離心后取上清液4 μL進(jìn)行沙門(mén)菌invA基因的檢測(cè)。

1.2.3 沙門(mén)菌基因型測(cè)定 參照PulseNet China推薦的脈沖場(chǎng)凝膠電泳(PFGE)方法對(duì)沙門(mén)菌進(jìn)行基因型研究。挑取沙門(mén)菌新鮮培養(yǎng)物制成比濁值為 4.0～4.5個(gè)麥?zhǔn)蠁挝?Mc Farland)，取400 μL 加入20 μL 蛋白酶K(20 mg/mL)混勻，37℃孵育5 min。加入400 μL提前預(yù)熱好的1%SeaKem Gold瓊脂糖溶液(含1%十二烷基硫酸鈉SDS溶液)，輕輕吹吸混勻，取200 μL注入模具中，膠塊凝固后，放入5 mL含有25 μL蛋白酶K(20 mg/mL)的細(xì)胞裂解液CLB中，54℃水浴搖床，轉(zhuǎn)速160 r/min孵育2 h。用15 mL提前預(yù)熱至50℃滅菌純水洗膠塊2次，每次10 min，再用15 mL提前預(yù)熱至50℃ TE洗膠塊4次，每次15 min。用刀片將瓊脂模塊切成3 mm左右的膠塊，浸入200 μL酶切反應(yīng)體系中。37℃水浴酶切2 h以上。將酶切后的膠塊粘在梳子上制膠，放入Chef Mapper脈沖場(chǎng)凝膠電泳儀上電泳。電泳條件:初始脈沖時(shí)間2.16 s;最終脈沖時(shí)間63.8 s;電壓6.0 V/cm;電場(chǎng)夾角120°;電泳時(shí)間18 h;溫度14℃。電泳結(jié)束后，將膠塊放入1 μg/mL的溴化乙啶染色30 min，用純水脫色5 h以上，在Bio-Rad Gel XR凝膠成像分析系統(tǒng)中讀膠成像。

1.2.4 菌株圖譜的聚類(lèi)分析 獲得的PFGE圖像應(yīng)用 BioNumerics(Version5.10)數(shù)據(jù)庫(kù)軟件(Appplied Maths BVBA，Belium)處理，識(shí)別圖像條帶。根據(jù)每2個(gè)圖像之間的相似系數(shù)，用非加權(quán)配對(duì)算數(shù)平均法(unweighted pair group average method，UPGMA)進(jìn)行聚類(lèi)，條帶位置差異容許度(position tolerance)選擇0.85%，優(yōu)化值選擇(optimization)1.50%，對(duì)分型圖譜進(jìn)行分析，繪出聚類(lèi)分析圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 食物中毒檢測(cè)結(jié)果及菌株血清分型結(jié)果

6起食物中毒均檢出沙門(mén)菌，共分離出16株沙門(mén)菌，血清凝集共分為5種血清型，分別為都柏林沙門(mén)菌2株(2/16)、鼠傷寒沙門(mén)菌2株(2/16)、腸炎沙門(mén)菌8株(8/16)，圣保羅沙門(mén)菌3株(3/16)、依麥克沙門(mén)菌1株(1/16)。

2.2 沙門(mén)菌侵襲蛋白A(invA)基因的檢測(cè)結(jié)果

經(jīng)熒光定量PCR儀檢測(cè)，16株沙門(mén)菌invA基因均為陽(yáng)性結(jié)果，熒光PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖1。

2.3 16株沙門(mén)菌分離株的PFGE電泳圖譜和基因型分析

電泳圖像錄入BioNumerics軟件，經(jīng)過(guò)統(tǒng)一的分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行歸一化，將條帶數(shù)目和分布相同的菌株歸為同一個(gè)PFGE基因型。聚類(lèi)結(jié)果顯示，16株沙門(mén)菌分為4個(gè)基因簇，8株腸炎沙門(mén)菌和2株鼠傷寒沙門(mén)菌基因型相同，圣保羅沙門(mén)菌、都柏林沙門(mén)菌和依麥克沙門(mén)菌分屬于不同的基因型。其中2起由腸炎沙門(mén)菌和圣保羅沙門(mén)菌引起的食物中毒資料分析顯示，1個(gè)月內(nèi)出現(xiàn)3株以上PFGE帶型相同的腸炎沙門(mén)菌和圣保羅沙門(mén)菌，符合同一起暴發(fā)的一般規(guī)律，應(yīng)當(dāng)引起高度重視。每一起食物中毒的分離株P(guān)FGE帶型分別均相同，聚類(lèi)分析相似度為100%，考慮為同一來(lái)源。見(jiàn)圖2。

圖1 16株沙門(mén)菌熒光PCR試驗(yàn)結(jié)果Fig.1 Fluorescence PCR results 16 strains of Salmonella

圖2 16株沙門(mén)菌食物中毒分離株P(guān)FGE聚類(lèi)圖Fig.2 PFGE clustering results of 16 strains Salmonella isolated from food poisoning

3 討論

沙門(mén)菌屬是人類(lèi)腸道傳染病的重要病原菌之一，是引起食物中毒的重要病原菌，石家莊地區(qū)的6起沙門(mén)菌食物中毒共檢出了5種血清型，其中腸炎、鼠傷寒、都柏林、圣保羅沙門(mén)菌是較常見(jiàn)的引起食物中毒的沙門(mén)菌血清型，而依麥克沙門(mén)菌是比較少見(jiàn)的，說(shuō)明食品中沙門(mén)菌的污染具有多樣性，應(yīng)引起重視。中毒食品的分布情況，主要集中在動(dòng)物性食品，占83.33%(5/6)，而該類(lèi)食品是我國(guó)的主要食品，如果對(duì)其生產(chǎn)加工和儲(chǔ)運(yùn)及銷(xiāo)售各環(huán)節(jié)加強(qiáng)控制，可能會(huì)大大降低沙門(mén)菌引起食物中毒的發(fā)生。

沙門(mén)菌基因組龐大、復(fù)雜，有研究表明，沙門(mén)菌侵襲蛋白A基因?yàn)橹虏⌒陨抽T(mén)菌的主要毒力因子［5］，目前用于實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)的靶基因就是invA基因，本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了16株沙門(mén)菌的分離株，PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，invA的陽(yáng)性率達(dá)到100%，提示在突發(fā)公共衛(wèi)生事件中，可利用invA基因作為沙門(mén)菌快速初篩的特異性基因［7］。沙門(mén)菌invA基因的檢測(cè)可為應(yīng)急處理提供病原學(xué)依據(jù)，在病原菌快速檢測(cè)診斷方面具有較好的應(yīng)用潛力。

本研究結(jié)果顯示，石家莊地區(qū)引起食物中毒的沙門(mén)菌分布較廣，但仍有優(yōu)勢(shì)菌株，以腸炎沙門(mén)菌為主要血清型，這與文獻(xiàn)［8-9］報(bào)道，造成食源性的沙門(mén)菌病發(fā)生的主要血清型之一是腸炎沙門(mén)菌相吻合。腸炎沙門(mén)菌是沙門(mén)菌常見(jiàn)的血清型之一，具有廣泛的寄生譜。在石家莊市的2個(gè)區(qū)，發(fā)生的2起食物中毒均由腸炎沙門(mén)菌引起，采用PFGE分子分型方法得到了條帶一致的電泳圖譜，聚類(lèi)分析相似度為100%，表明引起這2起食物中毒病原菌與剩余食品的來(lái)源菌株，從分子水平具有緊密相關(guān)和高度的同源性，菌株來(lái)源完全一致。在樣品的采集過(guò)程中，專(zhuān)門(mén)到中毒樣品的購(gòu)買(mǎi)地某超市采集了一份相同的涼拌菜，檢出的腸炎沙門(mén)菌(編號(hào)為SJZ2012CA0004)，與該起中毒事件中來(lái)自患者和剩余食品的菌株P(guān)FGE圖譜完全一致，從分子水平揭示了該超市的涼拌菜與中毒事件的關(guān)系，為該起食物中毒流行病學(xué)調(diào)查提供了充分的依據(jù)。該研究案例說(shuō)明，通過(guò)PFGE分子分型不僅可以很好地為食物中毒提供可靠的流行病學(xué)依據(jù)，而且更重要的是PFGE分子分型調(diào)查可以為研究一些散發(fā)的事件，或是不同時(shí)期的細(xì)菌性感染事件之間的關(guān)聯(lián)性提供準(zhǔn)確客觀的證據(jù)。

目前，傳統(tǒng)的細(xì)菌分型方法一般依據(jù)生化反應(yīng)、血清學(xué)分型等表型分型方法，不能用于菌株的相關(guān)性分析，而PFGE分子分型方法是通過(guò)限制性?xún)?nèi)切酶對(duì)細(xì)菌染色體DNA的稀有酶切位點(diǎn)進(jìn)行酶切，經(jīng)PFGE分離，比較染色體限制性?xún)?nèi)切圖譜，對(duì)整個(gè)染色體進(jìn)行分析，以確定菌株的親緣關(guān)系，能夠用于分析菌株之間的相關(guān)性，協(xié)助追蹤污染來(lái)源，在有效控制大面積食源性疾病的發(fā)生方面發(fā)揮重要作用。

致謝:感謝中國(guó)疾病預(yù)防控制中心傳染病所周海健博士對(duì)本試驗(yàn)的指導(dǎo)幫助!

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