章 麗，戴 夢，鄭桂珍，趙 穎，劉 靜，張 佳，王富強(qiáng)

(華北制藥集團(tuán)新藥研究開發(fā)有限責(zé)任公司微生物藥物國家工程研究中心，河北石家莊 050015)

P450酶是一類血紅素結(jié)合蛋白，能區(qū)域選擇性的羥基化環(huán)孢菌素。經(jīng)人體肝臟內(nèi)的P450酶作用，環(huán)孢菌素 A(CyA)在代謝中可產(chǎn)生［γ-HyMeLeu4］CyA，其4位甲基亮氨酸被羥基化后的環(huán)孢菌素衍生物較之CyA極性更強(qiáng)，失去了免疫抑制活性，抗菌譜窄，保持了抗真菌和促毛發(fā)生長作用［1］，［γ-HyMeLeu4］CyA化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖1。稀有放線菌Nonomuraea dietziae可編碼表達(dá)P450酶，在該菌發(fā)酵過程中添加前體CyA可以一步合成［γ-HyMeLeu4］CyA［2］，較之化學(xué)合成法，生物體內(nèi)轉(zhuǎn)化合成產(chǎn)物單一，便于生產(chǎn)上的分離提取［3］，對環(huán)境污染小更加環(huán)保。生產(chǎn)上，利用本實驗室保存的菌株Nonomuraea dietziae轉(zhuǎn)化合成［γ-HyMeLeu4］CyA，但是該出發(fā)菌株轉(zhuǎn)化能力低，不適應(yīng)大規(guī)模生產(chǎn)需要。為獲得高轉(zhuǎn)化能力的菌株，本研究采用常溫常壓等離子體射流誘變(ARTP)和紫外照射(UV)對該菌進(jìn)行復(fù)合物理誘變，最終獲得了高效且具有穩(wěn)定遺傳性能的菌株。

圖1 CyA化學(xué)結(jié)構(gòu)式(R1-H，R2-H)，［γ-HyMeLeu4］CyA化學(xué)結(jié)構(gòu)式(R1-OH，R2-H)Fig.1 Chemical structures of cyclosprin A(R1-H，R2-H)，Chemical structures of［γ-HyMeLeu4］CyA(R1-OH，R2-H)

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 出發(fā)菌株Nonomuraea dietziae由本實驗室保存;菌株ZL-11由本研究經(jīng)等離子誘變獲得;菌株ZL-21由本研究經(jīng)紫外誘變獲得。

1.1.2 培養(yǎng)基(%) ①分離及斜面培養(yǎng)基:酵母粉0.4，麥芽粉1.0，葡萄糖0.4，瓊脂2，pH 7.0;②種子培養(yǎng)基:淀粉1.0，葡萄糖0.7，麥芽粉0.5，酵母粉0.5，蛋白胨0.5，碳酸鈣0.7，pH 7.0;③發(fā)酵培養(yǎng)基:糊精1.2，葡萄糖3.0，酵母粉0.9，蛋白胨0.5，黃豆餅粉1.5，pH 7.2。

1.1.3 主要儀器 常溫常壓等離子體射流誘變機(jī)由清華大學(xué)電氣與電子工程學(xué)院脈沖功率中心提供。

1.2 方法

1.2.1 等離子體誘變 取出發(fā)菌株單孢子懸液10 μL涂布于直徑0.5 cm的不銹鋼片上，處理時間從2 min開始，依次增加到8 min。等離子器照射條件:距離2 mm;注入氣體為氦氣;氣流量10 L/min;照射功率100 W。用1 mL蒸餾水將照射后不銹鋼片上的孢子洗下，再以10倍梯度稀釋至10－4，涂布于分離培養(yǎng)基上。

1.2.2 紫外誘變 取菌株單孢子懸液25 mL用帶有數(shù)十顆玻璃珠的三角瓶打散，過濾后補(bǔ)水至25 mL，每玻璃平皿取4 mL，紫外照射時間從10 s開始，依次增加到60 s。紫外照射條件:功率15 W，照射距離35 cm。

1.2.3 斜面培養(yǎng) 用竹簽挑選單個菌落轉(zhuǎn)接于斜面培養(yǎng)基，28℃下培養(yǎng)15 d。

1.2.4 搖瓶培養(yǎng) 斜面上的孢子接種于種子培養(yǎng)基中，28℃，220 r/min下培養(yǎng)44～48 h，然后以10%的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，28℃，220 r/min搖床培養(yǎng)48 h后添加前體CyA，補(bǔ)料96 h后放瓶測定單位。

1.2.5 樣品檢測 將4 mL發(fā)酵液倒入刻度離心管中，加入1 mL無水乙醇，3 000 r/min離心10 min后取上清液，HPLC法測發(fā)酵單位(μg/mL)。

2 結(jié)果與分析

2.1 等離子體誘變選育

2.1.1 等離子體誘變條件確定 等離子體誘變是直接在生物分子上沉積能量，破壞單核苷酸的磷酸二酯鍵，依據(jù)核苷酸序列不同將寡核苷酸降解成不同的小片段［4］，從而達(dá)到誘變育種的目的。出發(fā)菌株孢子懸液經(jīng)不同時間照射處理后，稀釋至10－4后涂布分離培養(yǎng)平板上，培養(yǎng)12 d后統(tǒng)計個數(shù)，通過與對照組比較，計算致死率。根據(jù)公式:致死率(%)=100%×(對照組活菌數(shù)(mL)－誘變組活菌數(shù)(mL))/對照組活菌數(shù)(mL)，得到每個誘變時間下的致死率，如圖2所示。由等離子體誘變結(jié)果可以看出，采用該法對出發(fā)菌株進(jìn)行不同時間的照射，隨著誘變時間的延長，致死率逐漸增加。

圖2 等離子體誘變劑量與致死率、正突變率關(guān)系Fig.2 The relationship between death rate and positive mutation rate by ARTP

2.1.2 等離子體誘變菌株選育 從分離培養(yǎng)基上共挑選976株單個菌落傳斜面和搖瓶篩選，HPLC測單位，計算菌株正突變率。根據(jù)公式:正突變率(%)=(每組處理計量發(fā)酵單位高于對照菌株的個數(shù)/每組處理計量挑選的菌落個數(shù))×100%，得到不同處理計量下的正突變率。由圖2可以看出，當(dāng)處理時間為6 min時，菌株的正突變率最大。隨著處理時間的延長，正突變率呈下降趨勢，并不利于工業(yè)生產(chǎn)中篩選高產(chǎn)菌株。因此，選擇6 min作為等離子體誘變該菌種的最佳時間。經(jīng)搖瓶篩選，最終得到的突變菌株ZL-11產(chǎn)量為247 μg/mL，比出發(fā)菌株提高約21%。

2.2 紫外誘變選育

2.2.1 紫外誘變條件確定 對等離子體誘變處理后的菌株ZL-11選取不同時間進(jìn)行紫外誘變。紫外線的主要作用是使DNA雙鏈之間或同一鏈上形成胸腺嘧啶二聚體以改變DNA生物活性，造成微生物變異甚至死亡［5］。由圖3可知，在40 s時，該菌的致死率已達(dá)到96.5%;在60 s時，該菌的致死率高達(dá)99.8%。

2.2.2 紫外誘變菌株選育 紫外線有較強(qiáng)的殺菌能力，相對于其他菌株，該稀有放線菌對紫外照射更為敏感，較高的致死率有利于篩選優(yōu)良菌株，但是如果處理時間太長，一些高活性菌株也可能致死，不利于篩選。由圖3可知，在40 s時，該菌的正突變率最高，為15.3%，因此選取40 s作為誘變處理時間。紫外照射處理后的孢子稀釋涂平板，從分離培養(yǎng)基上共挑取1 373個形態(tài)良好產(chǎn)孢豐富的單菌落。經(jīng)搖瓶篩選，得到突變菌株ZL-21產(chǎn)量達(dá)到269 μg/mL。

圖3 紫外誘變劑量與致死率、正突變率關(guān)系Fig.3 The relationship between death rate and positive mutation rate by UV

2.3 誘變菌株遺傳穩(wěn)定性分析

通過誘變方法篩選出的高產(chǎn)菌株經(jīng)過連續(xù)傳代后往往會產(chǎn)生回復(fù)突變，出現(xiàn)生產(chǎn)性狀“衰退”［6］。因此，為檢測經(jīng)等離子體-紫外復(fù)合誘變得到的高產(chǎn)菌株ZL-21的遺傳穩(wěn)定性，對其進(jìn)行傳代復(fù)試，連續(xù)傳代6次，以考察其遺傳穩(wěn)定性，結(jié)果見表1。由表1可看出，隨著傳代次數(shù)增加，單位呈下降趨勢，但幅度不大，表明該菌株遺傳性狀比較穩(wěn)定。

表1 菌株ZL-21傳代實驗Table1 The experiments of ZL-21 strain passage

3 討論

誘變育種是指用物理、化學(xué)等因素誘導(dǎo)物種的遺傳特性發(fā)生變異，從而培育新品種的育種方法。常用的物理法如X光線照射和化學(xué)法如NTG處理本身對人體也有傷害，操作起來比較困難。本研究采用的等離子體誘變具有射流溫度低、產(chǎn)生的等離子體均勻、無需真空裝置、操作簡易、成本低下等優(yōu)點(diǎn)，可以快速有效地突變細(xì)菌、微藻、真菌、酵母等微生物。該方法運(yùn)用于Streptomyces avermitilis的選育中，在該菌的誘變中其正突變率達(dá)到21%，組分B1a所占比例從38%提高到61%［7］，取得了顯著的效果。本研究首次在Nonomuraea dietziae上運(yùn)用了等離子體誘變這種技術(shù)，試驗結(jié)果證明等離子體誘變技術(shù)在該菌育種中切實可行。

關(guān)于［γ-HyMeLeu4］CyA轉(zhuǎn)化菌，特別是具有工業(yè)應(yīng)用前景的高產(chǎn)菌株還未見報道，本研究采用等離子體-紫外復(fù)合誘變篩選具有高轉(zhuǎn)化率的菌株，有效避免了使用單一誘變劑產(chǎn)生的誘變飽和效應(yīng)，選育出的高產(chǎn)菌株搖瓶單位比出發(fā)菌株提高了32%左右，并且從獲得誘變菌株的傳代試驗得出，誘變菌株具有良好的遺傳穩(wěn)定性。當(dāng)然，菌種的選育只是提高轉(zhuǎn)化率的途徑之一，若要全面提高菌株的轉(zhuǎn)化能力，還可以從培養(yǎng)基配方和發(fā)酵工藝的優(yōu)化方面著手，使之適應(yīng)工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)。

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