王杏 王超 邢邯英 劉敏 張哲

【實驗研究】

通心絡(luò)膠囊對糖尿病小鼠視網(wǎng)膜IKKβ/IKBα/NF-κB通路的作用△

王杏 王超 邢邯英 劉敏 張哲

Accepted date：Sep 3，2014Foundation item：Major State Basic Research Development Program of China(973 Program)(No：2012CB 518600)From theDepartmentofGerontology，HebeiGeneralHospital，Shijiazhuang050051，HebeiProvince，China

Responsible author：WANG Chao，E-mail：cwyx163@163.com

通心絡(luò)膠囊；糖尿病視網(wǎng)膜病變；IKKβ/IKBα/NF-κB

目的 觀察通心絡(luò)膠囊對糖尿病小鼠視網(wǎng)膜IKKβ/IKBα/NF-κB通路的影響。方法 40只KK/Upj-Ay小鼠隨機分為模型組、通心絡(luò)低(1 g·kg-1)、中(2 g·kg-1)、高(4 g·kg-1)劑量組，每組各10只，10只C57BL/6小鼠為對照組。通心絡(luò)組按相應(yīng)劑量灌胃給藥，對照組和模型組給予等體積的蒸餾水，每天1次，連續(xù)12周。測定體質(zhì)量、空腹血糖值(fasting blood glucose，F(xiàn)BG)，伊文思藍法(evans blue method，EB)測定血-視網(wǎng)膜屏障的通透性，HE染色法觀察視網(wǎng)膜形態(tài)學變化，Real-time PCR(qPCR)和Western blot 法測定IKKβ、IKBα、NF-κB mRNA和蛋白的表達及P-IKBα和核NF-κB蛋白的表達。結(jié)果 通心絡(luò)高劑量組較中、低劑量組細胞結(jié)構(gòu)更致密，排列更有序。通心絡(luò)低、中、高劑量組EB含量分別(20.82±3.88)ng·mL-1、(16.43±2.60)ng·mL-1、(16.14±2.42)ng·mL-1，較模型組(25.53±3.57)ng·mL-1明顯下降(均為P<0.05)。通心絡(luò)中、高劑量組IKKβ mRNA和蛋白表達量較模型組顯著下降(均為P<0.01)；通心絡(luò)組IKBα mRNA，通心絡(luò)中、高劑量組IKBα蛋白以及P-IKBα蛋白的表達均較模型組顯著下降(均為P<0.01)，通心絡(luò)低、中、高劑量組核NF-κB蛋白表達量為0.52±0.05、0.43±0.05、0.34±0.04，顯著低于模型組(0.61±0.07)(均為P<0.05)。結(jié)論 通心絡(luò)膠囊可明顯改善KK/Upj-Ay小鼠視網(wǎng)膜病變，其機制與抑制IKKβ/IKBα/NF-κB通路相關(guān)。

[眼科新進展，2014，34(11)：1005-1008]

糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy，DR)是糖尿病的嚴重并發(fā)癥之一，近年來隨著生活水平的提高，發(fā)病率和致盲率呈上升趨勢。然而，對于該病的治療卻沒有一種理想的藥物。DR的發(fā)病機制尚不明確，有研究表明核轉(zhuǎn)錄因子(nuclear transcription factor，NF-κB)活化影響著該病的進程。通心絡(luò)膠囊為中藥復(fù)方制劑，主要成分為人參、全蝎、水蛭、蟬蛻、土鱉蟲、赤芍、冰片等，已有研究將通心絡(luò)膠囊用于DR的輔助治療[1]，但其相關(guān)機制尚不清楚。本實驗采用自發(fā)性2型糖尿病 KK/Upj-Ay小鼠模型，觀察通心絡(luò)膠囊低、中、高劑量對DR的治療作用，并從NF-κB的激活角度探討該藥物可能的機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 40只KK/Upj-Ay小鼠，體質(zhì)量30～40 g；10只C57BL/6小鼠，體質(zhì)量25～30 g；均為SPF級，雄性，12周齡，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，生產(chǎn)許可證號：SCXK-(京)2009-0002。

1.1.2 試劑與儀器 通心絡(luò)膠囊(購自石家莊以嶺藥業(yè)股份有限公司)，IKKβ、IKBα、P-IKBα、NF-κB一抗(購自英國Abcam公司)，7300熒光定量PCR儀(購自美國ABI公司)，凝膠成像分析儀(購自美國Biorad公司)。

IKKβ引物：上游：5’-CGTGACGGAGGATGAGAGT-3’，下游：5’-CGTTTGTCTTGCTGTCTGAGA-3’，產(chǎn)物片段 155 bp；IKBα引物：上游：5’-GGTGTTTGAATGTATTGCTGG-3’，下游：5’-AGGCTGTTTGGCTGAGGT-3’，產(chǎn)物片段 155 bp；NF-κB引物：上游：5’-GCGAGAGAAGCACAGATACCA -3’，下游：5’-GGTCAGCCTCATAGTAGCCAT-3’，產(chǎn)物片段168 bp；GAPDH引物：上游：5’-TGCTGAGTATGTCGTGGAGTC-3’，下游：5’-TGCTGAGTATGTCG TGGAGTC-3’，產(chǎn)物片段143 bp(上海生工合成)。

1.2 方法

1.2.1 動物分組與給藥 40只KK/Upj-Ay小鼠按血糖值隨機分為模型組(Model)、通心絡(luò)低(TXL-L，1 g·kg-1)、中(TXL-M，2 g·kg-1)、高(TXL-H，4 g·kg-1)劑量組，C57BL/6小鼠為對照組(NC)。每組各10只，通心絡(luò)高、中、低劑量組按對應(yīng)劑量灌胃給藥，對照組和模型組給予等體積的蒸餾水，均為每天1次，連續(xù)12周。4、8、12周后記錄動物體質(zhì)量。

1.2.2 空腹血糖值測定 實驗結(jié)束后，禁食12 h，眼球取血，血糖儀測定各組小鼠空腹血糖(fasting blood glucose，F(xiàn)BG)值。

1.2.3 血-視網(wǎng)膜屏障的測定 給藥結(jié)束后，每組隨機取6只小鼠，尾靜脈注射伊文思藍(evans blue method，EB)溶液，按照文獻方法，測定EB在視網(wǎng)膜的含量[2]。

1.2.4 形態(tài)學變化 冰上常規(guī)分離視網(wǎng)膜組織，將小鼠視網(wǎng)膜組織置于20倍體積的40 g·L-1多聚甲醛溶液中固定，從低濃度到高濃度梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，連續(xù)切片，切片厚度0.4 μm。依照以下順序脫蠟至水：二甲苯2次、無水乙醇2次、每次10 min；體積分數(shù)95%、90%、80%、70%乙醇，每次5 min，蒸餾水5 min；常規(guī)HE染色。光學顯微鏡下觀察形態(tài)學變化。

1.2.5 IKKβ、IKBα、NF-κB mRNA表達量的測定 分離小鼠眼球視網(wǎng)膜組織，Trizol法提取RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明反轉(zhuǎn)錄為cDNA，-20 ℃保存。Real-Time PCR(qPCR)方法擴增，95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性15 s，58 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，40個循環(huán)。以GAPDH作為內(nèi)參照。最終結(jié)果計為與對照組進行比較后的相對值，對照組設(shè)置為1。

1.2.6 IKKβ、IKBα、P-IKBα、NF-κB、核NF-κB蛋白表達量的測定 取視網(wǎng)膜組織，加入組織裂解液，提取總蛋白或核蛋白。以β-actin作為內(nèi)參照，SDS-聚丙烯凝膠電泳，待溴酚藍距分離膠底部1 cm時，停止電泳。依目的蛋白分子量分離條帶，濾紙、凝膠、PVDF膜、濾紙依次放置于夾板內(nèi)，4 ℃、100 V電泳轉(zhuǎn)膜1 h。4 ℃封閉液振蕩4 h，滴加一抗，振蕩混勻，4 ℃過夜。加入辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫孵育2 h?；瘜W發(fā)光法顯色，對條帶進行吸光度積分掃描。用目的蛋白吸光度值/內(nèi)參照吸光度值的比值進行比較。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠體質(zhì)量及FBG的變化 各時間點各組間比較差異均有統(tǒng)計學意義(均為P=0.00，見表1-表2)，給藥組、模型組體質(zhì)量、FBG明顯高于同期對照組(均為P<0.01)，模型組與給藥組差異無統(tǒng)計學意義(均為P>0.05)。

表1 各組小鼠體質(zhì)量變化情況

Group0week4weeks8weeks12weeksNC25.15±1.0227.58±1.0328.75±2.4530.48±2.75Model34.36±1.96*40.30±1.49*44.89±2.15*46.03±2.17*TXL-L35.04±2.0539.01±2.3943.47±3.2344.44±3.38TXL-M34.83±2.9838.80±2.7643.28±2.1844.30±2.04TXL-H34.92±1.8638.36±2.6042.47±3.6543.45±3.75F43.4646.5455.4548.91P0.000.000.000.00

Note：Compared with NC group，*P<0.01

2.2 EB含量的變化 與對照組比較，模型組EB含量明顯升高(P<0.01)，通心絡(luò)組EB含量較模型組明顯下降(均為P<0.05)。通心絡(luò)中、高劑量組間無統(tǒng)計學差異(P>0.05)，與低劑量組間均有統(tǒng)計學差異(均為P<0.05，見表3)。

表2 各組小鼠FBG變化情況

Table 2 Effects of TXL on FBG of each group

Group0week12weeksNC5.33±0.815.51±0.88Model14.83±2.66*17.54±2.79*TXL-L14.72±2.7816.46±2.44TXL-M14.64±2.6115.84±1.86TXL-H14.86±2.3114.97±2.27F32.4551.60P0.000.00

Note：Compared with NC group，*P<0.01

表3 通心絡(luò)膠囊對各組小鼠EB含量的影響

Table 3 Effects of TXL on EB of each group

GroupEBNC12.62±2.55Model25.53±3.57**TXL-L20.82±3.88*TXL-M16.43±2.60*TXL-H16.14±2.42*F15.67P0.00

Note：Compared with NC group，*P<0.05，**P<0.01

2.3 形態(tài)學觀察 HE染色顯示對照組視網(wǎng)膜各層細胞層次分明，結(jié)構(gòu)清晰；模型組視網(wǎng)膜色素上皮層明顯變薄，細胞排列紊亂；通心絡(luò)各劑量組細胞排列較清晰，劑量高組結(jié)構(gòu)更致密，細胞排列更有序，上皮層細胞較模型組增厚明顯(圖1)。

2.4 視網(wǎng)膜IKKβ、IKBα、NF-κB mRNA和蛋白以及核NF-κB蛋白、P-IKBα蛋白表達的變化 模型組IKKβ、IKBα mRNA和蛋白表達明顯高于對照組(均為P<0.01)，模型組核NF-κB和P-IKBα蛋白表達明顯高于對照組(均為P<0.01)；與模型組比較，通心絡(luò)中、高劑量組IKKβ mRNA和蛋白表達顯著下降(均為P<0.01)，各劑量組間有統(tǒng)計學差異(P<0.01)；通心絡(luò)組IKBα mRNA表達均顯著低于模型組(均為P<0.01)，低劑量組與中、高劑量組間均有統(tǒng)計學差異(均為P<0.01)，中、高劑量組間無統(tǒng)計學差異(P>0.05)；通心絡(luò)中、高劑量組IKBα蛋白、P-IKBα蛋白的表達較模型組顯著下降(均為P<0.01)，通心絡(luò)各劑量組之間有統(tǒng)計學差異(P<0.05)；通心絡(luò)組核NF-κB蛋白表達均低于模型組(均為P<0.05)，各劑量組間有統(tǒng)計學差異(P<0.05)；總NF-κB mRNA和蛋白表達在各組間無統(tǒng)計學差異(均為P>0.05，見表4)。

Figure 1 Changes of retinal morphology.A：NC group；B：Model group；C：TXL-L group；D：TXL-M group；E：TXL-H group 各組視網(wǎng)膜組織的形態(tài)學變化(HE，×200)。A：對照組視網(wǎng)膜；B：模型組視網(wǎng)膜；C：通心絡(luò)低劑量組視網(wǎng)膜；D：通心絡(luò)中劑量組視網(wǎng)膜；E：通心絡(luò)高劑量組視網(wǎng)膜

表4 通心絡(luò)對各組小鼠視網(wǎng)膜IKKβ、IKBα、NF-κB mRNA及蛋白表達的影響

Note：Compared with NC group，*P<0.01；Compared with model group，△P<0.05，#P<0.01

3 討論

本研究采用了自發(fā)性2型糖尿病KK/Upj-Ay小鼠作為研究DR的模型[3]，通心絡(luò)膠囊灌胃12周，各劑量組不同程度地降低了視網(wǎng)膜內(nèi)EB含量，改善其病理損傷，使視網(wǎng)膜各層較模型組排列整齊，從形態(tài)學上證實了通心絡(luò)膠囊可延緩糖尿病小鼠DR的出現(xiàn)，對DR的防治有一定作用。通心絡(luò)各劑量組與模型組相比，通心絡(luò)組體質(zhì)量和FBG無統(tǒng)計學差異(均為P>0.05)，故考慮通心絡(luò)膠囊不是通過降低體質(zhì)量和血糖來改善DR的。各組間比較有統(tǒng)計學差異(均為P=0.00)，說明不同劑量對視網(wǎng)膜的影響是不同的。

目前，DR的發(fā)病機制仍不確切，越來越多的證據(jù)顯示DR是一種炎性反應(yīng)[4]。NF-κB為重要的核轉(zhuǎn)錄因子之一，通常與IKB形成復(fù)合體，以無活性形式存在于細胞質(zhì)中，可被多種因素激活，進入細胞核，與基因上的相應(yīng)序列結(jié)合，調(diào)控炎性因子的表達，如TNF-α、白細胞介素(interleukin，IL)系列、急性期反應(yīng)蛋白等[5]。很多研究表明，NF-κB均積極參與糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)生[6-7]，故本研究圍繞此展開。NF-κB信號通路中3個關(guān)鍵因子依次為IKKβ、IKBα和NF-κB[8]。當高糖、缺氧、氧化應(yīng)激[9]、病毒、細菌等因素刺激細胞時，可激活I(lǐng)KKs，本實驗也觀察到模型組IKKβ較對照組有明顯的上升趨勢，IKKβ催化IKBα的N-末端絲氨酸磷酸化，實驗中顯示磷酸化的P-IKBα增加明顯，導致IKBα泛素化并降解，則NF-κB游離，向細胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移，核內(nèi)的NF-κB增多，啟動了炎癥反應(yīng)和下游通路。IKKs主要包括IKKα、IKKβ和 IKKγ，p50/p65 二聚體可被IKKβ活化，RelB/p52 二聚體可被IKK-α活化，IKKα、IKKβ的活化可被IKKγ調(diào)節(jié)。NF-κB通常指P50/P65(ReLA)的二聚體。因此，本研究對NF-κB信號通路中的IKKβ、IKBα磷酸化和NF-κB的核表達環(huán)節(jié)進行了檢測，顯示模型組IKKβ、IKBα mRNA和蛋白，以及核NF-κB和P-IKBα蛋白表達均升高，給予不同劑量通心絡(luò)膠囊治療后，能不同程度降低以上因子的表達。提示通心絡(luò)膠囊能通過抑制DR小鼠視網(wǎng)膜IKKβ、IKBα的磷酸化和核NF-κB的活化，干預(yù)IKKβ/IKBα/NF-κB信號通路，從而起到改善并防治DR的作用。

NF-κB的活化可引起血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、細胞間黏附因子(ICAM-1)等異常增多[10]。目前，VEGF是最強的促進血管生長的因子[11]，正常狀態(tài)下，視網(wǎng)膜色素上皮細胞、Müller 細胞少量分泌VEGF，保持視網(wǎng)膜正常及血管的穩(wěn)定；VEGF異常增多時，將引起內(nèi)皮細胞增殖和遷移，增加血管通透性，參與新生血管形成[12]。ICAM-1的表達增多，破壞血-視網(wǎng)膜屏障[13]，本研究中也觀察到模型組EB含量增多，通心絡(luò)組EB含量隨濃度增長而下降。通心絡(luò)膠囊可能通過降低NF-κB的表達，減少VEGF、ICAM-1的表達，抑制新生血管的形成和血-視網(wǎng)膜屏障的通透性，延緩DR的發(fā)生，具體機制還需進一步研究。

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date：Aug 9，2014

Effects of Tongxinluo capsule on retina through IKKβ/IKBα/NF-κB pathway in diabetic mouse

WANG Xing，WANG Chao，XING Han-Ying，LIU Min，ZHANG Zhe

Tongxinluo capsule；diabetic retinopathy；IKKβ/IKBα/NF-κB

Objective To investigate the effects of Tongxinluo(TXL) capsule on IKKβ / IKBα / NF-κB pathway of retina in diabetic mouse.Methods Forty KK/Upj-Ay mice were randomly divided into model group，TXL low-dose group(TXL-L，1 g·kg-1)，medium group(TXL-M，2 g·kg-1)，high group(TXL-H，4 g·kg-1)，10 cases in each group，and another 10 C57BL/6 mice were selected in the control group.The TXL groups were given drug with corresponding dose by oral administration，meanwhile control group and model group were given distilled water of equal volume，once a day in the ensuing 12 weeks.Body weight and fasting blood glucose were detected，and blood-retinal barrier permeability were determined by evans blue(EB) method.The morphological changes of retinal were observed by HE staining.The expression levels of IKKβ，IKBα，NF-κB mRNA and protein,P-IKBα and nuclear NF-κB protein,in retina were measured by real-time PCR and Western Blot.Results The cells of the retina in TXL-H group were arranged more compact and more orderly than TXL-L and TXL-M groups.The EB content in TXL groups were(20.82±3.88)ng·mL-1，(16.43±2.60)ng·mL-1and(16.14±2.42)ng·mL-1，respectively，which were lower significantly than that in the model group(25.53±3.57)ng·mL-1(allP<0.05).Compared with the model group，the mRNA and protein levels of nucleur IKKβ were reduced obviously in TXL-M and TXL-H group(allP<0.01)，and the protein levels of IKBα and P-IKBα were decreased in the TXL-M and TXL-H group(allP<0.01).The expression levels of NF-κB protein in TXL groups were 0.52±0.05，0.43±0.05，0.34±0.04，respectively，which were lower than the model group(0.61±0.07)(allP<0.05).Conclusion TXL capsule can significantly improve KK / Upj-Ay mice diabetic retinopathy and the mechanism is related with inhibition of IKKβ / IKBα/NF-κB pathway.

王杏，王超，邢邯英，劉敏，張哲.通心絡(luò)膠囊對糖尿病小鼠視網(wǎng)膜IKKβ/IKBα/NF-κB通路的作用[J]. 眼科新進展，2014，34(11)：1005-1008.

10.13389/j.cnki.rao.2014.0279

王杏，女，1986年9月出生，碩士。聯(lián)系電話：0311-85988007；E-mail：wangxingvet@163.com

About WANG Xing：Female，born in September，1986.Master degree.Tel：+86-311-85988007；E-mail：wangxingvet@163.com

2014-08-09

國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃項目(973計劃)(編號：2012CB518600)

050051 河北省石家莊市，河北省人民醫(yī)院老年醫(yī)學重點實驗室

王超，E-mail：cwyx163@163.com

修回日期：2014-09-03

本文編輯：付中靜

[Rec Adv Ophthalmol，2014，34(11)：1005-1008]