趙婷婷，嚴(yán)磊，魏立雯，韋莉，王會娟，賴國旗，譚毅

(1.重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，重慶 400016;2.瀘州醫(yī)學(xué)院科技處實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，四川 500016;3.重慶市中藥研究院，重慶 400065)

泰澤病原體屬毛狀芽孢桿菌(Bacillus piliformis)，由日本學(xué)者Ernest Tyzzer于1917年首次在華爾茲小鼠群中發(fā)現(xiàn)并命名［1］。其宿主范圍較廣，能感染大鼠、小鼠、豚鼠、地鼠、沙鼠、倉鼠、兔、貓、狗、馬、牛、恒河猴、狐貍、袋鼠、熊貓、鸚鵡等動(dòng)物，甚至可能感染人，特別是實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)人員［2，3］。泰澤病原體主要呈隱形或亞臨床性感染，嚙齒動(dòng)物可成為其長期的攜帶者［4］。當(dāng)動(dòng)物處于應(yīng)激狀態(tài)(環(huán)境條件改變、過度擁擠、長途運(yùn)輸?shù)?、使用高蛋白飼料喂養(yǎng)或?qū)嶒?yàn)中使用免疫抑制劑，均會導(dǎo)致本病的流行，其對實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的健康和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的順利進(jìn)行是一潛在威脅。國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定泰澤病原體是清潔級及以上實(shí)驗(yàn)動(dòng)物必須排除的病原體之一。

目前，可用于泰澤病原體檢測的方法很多，如，組織病理學(xué)診斷、PCR擴(kuò)增、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)和免疫熒光試驗(yàn)(immuno fluorescence assay，IFA)等［5］。其中ELISA法和IFA法是實(shí)驗(yàn)動(dòng)物微生物質(zhì)量檢測國家標(biāo)準(zhǔn)。組織病理學(xué)診斷不夠客觀，PCR法非特異性高，ELISA法和IFA法檢測靈敏度低。因這些檢測方法的局限，使得泰澤病原體的檢測成為了實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量控制中的一個(gè)難題。

本實(shí)驗(yàn)嘗試將反向斑點(diǎn)雜交和PCR擴(kuò)增相結(jié)合，建立一種檢測泰澤病原體的新方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為38只SD大鼠和41只小鼠(品種有C57BL/6、KM、BALB/c)，來自重慶地區(qū)各實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，清潔級;沙門菌(Salmonella sp.)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)由重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心保存;小鼠肝炎病毒A59(mouse hepatitis virus，MHV-A59)購自美國菌種保藏中心(ATCC)。Taq DNA聚合酶、DH5α感受態(tài)細(xì)胞、pMD18-T載體、膠回收試劑盒、RNA提取試劑盒(均為TaKaRa公司，日本)、基因組DNA提取試劑盒、堿性磷酸酶SA-AP(均為Promega公司，美國)、蛋白胨、瓊脂糖等(均為北京鼎國生物試劑公司，中國)、硝酸纖維膜(Millipore公司，美國)、BCIP/NBT堿性磷酸酶顯色試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司，中國)、牛血清白蛋白(BSA)(Spain公司，西班牙)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)試劑盒(江蘇西山，中國)、免疫熒光試驗(yàn)試劑盒(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院，中國)。

1.1.2 儀器

1000-Series Thermal Cyclers PCR儀、GelDocXR+凝膠成像分析系統(tǒng)(BioRad公司，美國)，NANODROP 2000(Thermo公司，美國)，恒溫培養(yǎng)振蕩器(上海智城分析儀器制造有限公司，中國)，雜交槽(北京明威派勝醫(yī)藥科技有限公司，中國)。

1.2 方法

1.2.1 引物和探針的設(shè)計(jì)

根據(jù)泰澤病原體16S rDNA序列設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引物［5-7］和特異性探針(表1)，其中外引物為細(xì)菌16S rDNA通用引物，內(nèi)引物根據(jù)泰澤病原體16S rDNA序列保守區(qū)設(shè)計(jì)，內(nèi)引物的上游引物在5'端標(biāo)記生物素，由Invitrogen公司合成。

表1 引物及探針Tab.1 The primers and probes used in this study

1.2.2 泰澤病原體DNA提取

根據(jù)基因組DNA提取試劑盒使用說明，提取泰澤病原體陽性小鼠新鮮肝組織基因組DNA。

1.2.3 外引物PCR擴(kuò)增及T載體連接

(1)外引物PCR擴(kuò)增

擴(kuò)增體系為 5 × Primix Taq 25 μL，20 μmol/L的 F1/R1各1μL，模板 DNA 150 ng，ddH2O 補(bǔ)足至50 μL。擴(kuò)增條件為:94℃預(yù)變性5 min;94℃變性2 min，51℃退火 2 min，72℃延伸 2 min，30 個(gè)循環(huán);72℃延伸7 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.2%的瓊脂糖凝膠電泳及NANODROP 2000定量。

(2)pMD18-T-Tyzzer連接并測序

按pMD18-T連接試劑盒使用說明，將F1/R1 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物亞克隆到pMD18-T載體上，方法如下:pMD18-T 載體 1 μL，PCR 產(chǎn)物 124 ng，ddH2O 1 μL，Solution 5 μL。16℃ 連接 2 h，全量加至 50 μL DH5α感受態(tài)細(xì)胞，冰上放置30 min，42℃熱激45 s，冰上放置1 min，加450 μL不含氨芐抗性的LB液體培養(yǎng)基，37℃、250 r/min振蕩培養(yǎng)60 min。9000×g離心后棄上清，均勻涂布于氨芐抗性的L-瓊脂平板培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)16 h，挑取單菌落于含氨芐抗性的LB液體培養(yǎng)基中37℃、250 r/min培養(yǎng)16 h，提取質(zhì)粒DNA，送Invitrogen公司測序。

1.2.4 內(nèi)引物PCR擴(kuò)增

擴(kuò)增體系為 5 × Primix Taq 25 μL，20 μmol/L的 F2/R2 各 1 μL，pMD18-T-Tyzzer DNA 150 ng，ddH2O補(bǔ)足至50 μL。擴(kuò)增條件與外引物PCR擴(kuò)增相同。擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.2%的瓊脂糖凝膠電泳及NANODROP 2000定量。

1.2.5 雜交膜制備

將硝酸纖維素膜先后于ddH2O和2×SSC、0.1%SDS中浸泡10 min，挑選浸泡均勻的膜，120℃烘烤30 min，后裁剪為約4 mm寬、4.5 cm長的試劑條備用。以pMD18-T-Tyzzer為模板，用內(nèi)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(含生物素標(biāo)記)稀釋成3 ng/μL作為陽性對照，將生物素標(biāo)記的內(nèi)引物上游引物配制成0.1 μmol/L作為通用探針，將探針1和探針2(poly-10C、15C、20C)配制成50 μmol/L。按陽性對照、通用探針、探針1和探針2的順序各取1 μL點(diǎn)膜(圖1)，自然晾干后于1500×0.1 mJ/cm2進(jìn)行紫外交聯(lián)，120℃烘烤30 min后室溫干燥保存。

圖1 泰澤病原體檢測試劑條示意圖Fig.1 Diagram of the test strip of Tyzzer's organism

1.2.6 反向斑點(diǎn)雜交條件優(yōu)化

(1)雜交條件優(yōu)化

將制備好的雜交膜浸泡于2 mL雜交液(2×SSC、0.1%SDS)中，加入40 μL PCR 變性產(chǎn)物(F2/R2 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物10 μL和0.4 mol/L NaOH變性液30 μL 于室溫混合作用 15 min)，43℃、45℃或 48℃40 r/min振蕩雜交1 h、1.5 h或2 h。

(2)洗膜、孵抗和顯色條件優(yōu)化

雜交完畢后，用雜交液室溫漂洗2～3次，3分/次，洗膜液(0.5× SSC、0.1%SDS)45℃或50℃洗脫20 min;TBS室溫漂洗3 min，將雜交膜浸泡于2 mL SA-AP液(TTBS 2 mL+BSA 0.1 g+SA-AP 1∶2000、1∶5000 或 1∶7000)，37℃ 孵育 0.5 h、1 h 或1.5 h;TBS室溫漂洗3 min，生物素緩沖液室溫漂洗3 min，將雜交膜浸入2 mL NBT/BCIP顯色工作液(堿性磷酸酯酶顯色緩沖液2 mL+150×NBT 13 μL+300× BCIP 6 μL避光配制)，避光顯色20 min，最后將雜交膜浸入蒸餾水中終止顯色反應(yīng)，根據(jù)紫色斑點(diǎn)出現(xiàn)的位置直接判斷雜交結(jié)果。

1.2.7 反向斑點(diǎn)雜交靈敏度及特異性檢測

用ddH2O稀釋泰澤病原體PCR產(chǎn)物至18 ng/μL、9 ng/μL、4.5 ng/μL 和 2.25 ng/μL，按優(yōu)化的RDB方法進(jìn)行反向斑點(diǎn)雜交，判斷檢測下限;按參考文獻(xiàn)［8-10］方法分別擴(kuò)增小鼠肝炎病毒、Staphylococcus aureus和Salmonella sp.，并進(jìn)行RDB。

1.2.8 反向斑點(diǎn)雜交的應(yīng)用

用ELISA、IFA和優(yōu)化后的RDB對重慶地區(qū)38只大鼠和41只小鼠進(jìn)行泰澤病原體檢測，并按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R原則給予人道關(guān)懷。

1.2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用軟件SSPS 17.0對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。若P＜0.05，則有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

圖2 泰澤病原體16S rDNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳Fig.2 Agarose gel electrophoresis of the PCR amplification products of Tyzzer's organism 16S rDNA

2 結(jié)果

2.1 內(nèi)外引物PCR擴(kuò)增結(jié)果

泰澤病原體用外引物(F1/R1)PCR擴(kuò)增后目的片段為625 bp(圖2 a);用內(nèi)引物(F2/R2)PCR擴(kuò)增后目的片段為196 bp(圖2 b)，經(jīng)測序后與泰澤病原體16S rDNA序列進(jìn)行同源性比較，匹配率為100%。

2.2 反向斑點(diǎn)雜交條件優(yōu)化

將探針1和探針2在3'端和5'端分別用10C、15C、20C 修飾，并將探針按 20、50、100 μmol/L 濃度稀釋后分別點(diǎn)樣，在42℃、45℃和48℃溫度下分別雜交 1 h、1.5 h、2 h，在 37℃與 1∶2000、1∶5000、1∶7000 濃度的 SA-AP 孵育0.5 h、1 h、1.5 h，結(jié)果發(fā)現(xiàn)探針1和探針2均修飾15C、濃度為50 μmol/L，雜交溫度為 45℃、雜交時(shí)間為 1 h，抗體濃度為1∶2000、孵育時(shí)間為1 h時(shí)，各斑點(diǎn)信號強(qiáng)度較好，并無非特異性染色(圖3)。

圖3 泰澤病原體反向探針斑點(diǎn)雜交條件優(yōu)化Fig.3 Optimization of the conditions of Tyzzer's organism RDB detection

2.3 反向斑點(diǎn)雜交靈敏度和特異性

將PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物用ddH2O梯度稀釋后，進(jìn)行反向斑點(diǎn)雜交檢測，當(dāng)PCR產(chǎn)物濃度最低為4.5 ng/μL時(shí)，可檢測出泰澤病原體(圖4)。將泰澤病原體、小鼠肝炎病毒、Staphylococcus aureus和Salmonella sp.PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分別進(jìn)行反向斑點(diǎn)雜交檢測，僅泰澤病原體檢測結(jié)果為陽性(圖5)。

2.4 反向斑點(diǎn)雜交反應(yīng)的應(yīng)用

應(yīng)用ELISA、IFA和RDB同時(shí)檢測大、小鼠共79只，結(jié)果見表2。ELISA法和RDB法檢測結(jié)果一樣，均檢測出6個(gè)陽性樣本，陽性率均為7.59%，P＞0.05，差異無顯著性;而IFA法和RDB法檢測結(jié)果差異有顯著性，P＜0.05，差異有顯著性。

表2 大、小鼠泰澤病原體檢測結(jié)果Tab.2 Detection results of the rat and mouse Tyzzer's organism

圖4 泰澤病原體反向斑點(diǎn)雜交靈敏度檢測Fig.4 Sensitivity of the RDB detection of Tyzzer's organism

圖5 泰澤病原體反向斑點(diǎn)雜交特異性檢測Fig.5 Specificity of the RDB detection of Tyzzer's organism

3 討論

泰澤病原體為專性胞內(nèi)寄生菌，有嗜肝細(xì)胞性，對生長環(huán)境要求苛刻，不能在無細(xì)胞的人工培養(yǎng)基上生長，在無活體組織和活細(xì)胞時(shí)極易自溶。泰澤病原體可通過卵黃囊途徑接種雞胚進(jìn)行增殖，但是該方法成功率較低，推廣應(yīng)用困難，嚴(yán)重制約了對泰澤病原體生物學(xué)特性，遺傳致病機(jī)制，檢測方法的研究。

目前，用于檢測泰澤病原體的方法主要是ELISA、IFA、可的松激發(fā)試驗(yàn)和PCR擴(kuò)增。日本實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中央研究所、我國臺灣及內(nèi)陸研究人員均先后發(fā)現(xiàn)并證實(shí):在使用ELISA或IFA檢測泰澤病原體時(shí)，梭菌會和泰澤病原體發(fā)生交叉反應(yīng)而出現(xiàn)假陽性，故不能用于確診實(shí)驗(yàn)動(dòng)物泰澤病原體感染［5］。并且ELISA和IFA等血清學(xué)檢測方法對泰澤病原體的抗原抗體要求較高，病原體分離培養(yǎng)難度大，成本高，有效期短，不適合小樣本篩檢，故血清學(xué)方法的應(yīng)用推廣也變得困難。而可的松激發(fā)試驗(yàn)操作繁瑣，周期長，大規(guī)模檢測時(shí)可實(shí)施性較小，而PCR擴(kuò)增靈敏度高，快速，但特異性較難保證。

反向斑點(diǎn)雜交的原理是將已知的特異性探針固化到硝酸纖維膜上，與5'端修飾有生物素的引物擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物進(jìn)行雜交，通過對生物素顯色，直觀的判斷雜交信號，即得出檢測結(jié)果。該方法因快速、簡便、特異、靈敏等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于病原體檢測、基因突變、基因分型的研究［11-14］。

本實(shí)驗(yàn)合成的兩個(gè)寡核苷酸探針與基因庫進(jìn)行同源性比對，發(fā)現(xiàn)與之互補(bǔ)序列均為泰澤病原體所特異，與其他生物無同源性。結(jié)果判斷:當(dāng)顯色對照和通用探針成立的前提下，兩條探針檢測結(jié)果均為陽性，則結(jié)果判為陽性;兩條探針中有一條為陽性，則結(jié)果判為可疑;兩條探針均為陰性，則結(jié)果判為陰性。此過程保證了該方法檢測結(jié)果的可靠性。使用寡聚多胸腺嘧啶(dC)加尾，并用紫外交聯(lián)、高溫烘烤方式使探針牢固的固定于硝酸纖維膜上，確保了該檢測方法的穩(wěn)定性。經(jīng)過雜交條件優(yōu)化，確定了當(dāng)探針均修飾15C，濃度為50 μmol/L;雜交溫度為45℃，雜交時(shí)間為1 h;抗體的濃度為1∶2000，孵育時(shí)間為1 h時(shí)雜交信號最好，且無非特異性信號出現(xiàn)。通過對79例實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行檢測，并與ELISA、IFA進(jìn)行比較，檢測結(jié)果一致率分別為100%和92.4%，RDB與ELISA陽性檢出率均為7.59%(6/79)，而IFA陽性檢測率為0%(0/79)。

本實(shí)驗(yàn)使用了線性試劑條，可用閱讀卡進(jìn)行判讀，相比于其他斑點(diǎn)雜交實(shí)驗(yàn)，其實(shí)驗(yàn)結(jié)果更為簡潔、清晰［11，12］。并且，建立的 RDB 克服了 ELISA、IFA血清學(xué)檢測方法成本高、不利于各單位小樣本自檢等缺點(diǎn)。將PCR擴(kuò)增與反向斑點(diǎn)雜交相結(jié)合，并設(shè)計(jì)兩條通用探針，彌補(bǔ)了PCR擴(kuò)增的假陽性的不足。檢測結(jié)果簡潔直觀、可靠穩(wěn)定，可用于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物泰澤病原體的檢測。

綜上，本實(shí)驗(yàn)所建立的反向斑點(diǎn)雜交檢測方法用于檢測泰澤病原體，具有簡潔、靈敏、特異、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，便于基層單位推廣應(yīng)用。同時(shí)，為探索實(shí)驗(yàn)動(dòng)物其他病原微生物的RDB方法的建立提供理論依據(jù)。

［1］Fujiwara K.Tyzzer's disease［J］.Jap J Exp Med，1978，48:467-480.

［2］姚菊芳.某實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技機(jī)構(gòu)人員泰澤病原體感染血清學(xué)的調(diào)查［J］.上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)，1999，19(4):218.

［3］Smith KJ，Skelton HG，Hilyard EJ.Bacillus piliformisinfection in a patient infected with HIV-1:confirmation with 16s ribosomal RNA sequence analysis［J］.J Am Acad Dermatol，1996，34:343-348.

［4］Fujiwara K，Takagaki Y，Naiki M，et al.Tyzzer's disease in mice:effects of corticosteroids on the formation of liver lesions and the level of blood transaminases in experimentally infected animals［J］.Jpn J Exp Med，1964，34:559-575.

［5］高正琴，邢進(jìn)，王春玲，等.實(shí)驗(yàn)大鼠泰澤菌檢測方法的比較研究［J］.中國實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)報(bào)，2004.12(3):142-146.

［6］Wilson KH，Blitchinqton RB，Greene RC.Amplification of bacterial 16S ribosomal DNA with polymerase chain reaction ［J］.J Clin Microbiol，1990，28:1942-1946.

［7］Goto K，Itoh T.Detection ofBacillus piliformisby specific amplification of ribosomal sequences［J］.Exp Anim，1994，43(3):389-394.

［8］賴國旗，何明忠，譚毅，等.小鼠肝炎病毒RT-PCR檢測方法的研究［J］.西南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2004，26(6):762-764.

［9］魏立雯，韋莉，張文露，等.反向線性探針雜交在檢測試驗(yàn)動(dòng)物沙門菌中的研究［J］.四川動(dòng)物，2013，32(2):195-198.

［10］韋莉，魏立雯，賴國旗，等.金黃色葡萄球菌反向線性雜交探針檢測方法的建立［J］.中國實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)報(bào)，2012，20(6):85-88.

［11］樊慧珍，于化鵬，黃少杰.反向斑點(diǎn)雜交快速檢測肺炎支原體［J］.實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志，2005，21(21):2349-2351.

［12］賴國旗，張文露，胡源，等.反向線性探針雜交技術(shù)檢測慢性乙型肝炎病毒拉米夫定耐藥研究［J］.西南師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2012，37(3):113-119.

［13］趙麗，張文露，胡源，等.反向斑點(diǎn)雜交法快速檢測HBV基因型反應(yīng)條件的優(yōu)化和建立［J］.中國生物工程雜志，2009，29(12):85-89.

［14］田永強(qiáng)，朱中元，王海波.人乳頭瘤病毒線性雜交分型技術(shù)的建立及評價(jià)［J］.中國實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)，2010，14(3):389-392.