劉迪文，楊偉偉，吳寶金

(1.浙江大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，杭州 310058;2.杭州師范大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)實(shí)驗(yàn)室，杭州 310036)

豚鼠(Cavia porcellus)又名荷蘭豬或荷蘭鼠。1780年Laviser首次用豚鼠作熱源實(shí)驗(yàn)，此后開始實(shí)驗(yàn)動(dòng)物化并遍布世界。因其特殊的解剖學(xué)及生物學(xué)特征，豚鼠廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)研究中的各個(gè)領(lǐng)域。目前，國(guó)內(nèi)豚鼠主要為封閉群Hartley品系，由于引進(jìn)年代較長(zhǎng)，飼養(yǎng)規(guī)模及繁殖過程中未能實(shí)現(xiàn)完全的隨機(jī)交配，封閉群豚鼠的近交現(xiàn)象比較嚴(yán)重［1］。為了保持豚鼠的基因雜合度及遺傳穩(wěn)定性，對(duì)豚鼠遺傳質(zhì)量實(shí)行監(jiān)測(cè)成為重要的課題，而開發(fā)一套基因組分子標(biāo)記是檢測(cè)的前提［2-3］。此外，在豚鼠飼育過程中，研究人員發(fā)現(xiàn)并分離出多個(gè)豚鼠突變株，如劉迪文等［4-5］篩選培育Zmu-1:DHP豚鼠，具有特殊的生物學(xué)性狀，對(duì)口蹄疫病毒的易感性達(dá)100%，更適于制作該病的感染模型［6］。但是Zmu-1:DHP豚鼠特殊性狀的分子機(jī)制尚不清楚，要解答這一問題，定位鑒定相關(guān)突變基因十分必要，但豚鼠基因組遺傳標(biāo)記的缺乏使得相關(guān)工作無法深入。

微衛(wèi)星作為第二代分子標(biāo)記，以其較高的多態(tài)性及簡(jiǎn)便的操作，能夠滿足一般實(shí)驗(yàn)室對(duì)遺傳研究的要求，而得到較為廣泛的應(yīng)用［7-10］。對(duì)于基因組序列完全未知的物種，磁珠富集法篩選微衛(wèi)星標(biāo)記的報(bào)道很多，是目前微衛(wèi)星標(biāo)記開發(fā)廣泛采用的方法。與此同時(shí)，已有不少物種的基因組序列登錄在GenBank等數(shù)據(jù)庫(kù)中，采用生物信息學(xué)手段為獲取并篩選分子標(biāo)記提供了可能。鑒于以上原因，本實(shí)驗(yàn)先后采用磁珠富集法和數(shù)據(jù)庫(kù)篩選法對(duì)豚鼠基因組微衛(wèi)星位點(diǎn)進(jìn)行篩選及多態(tài)性探索，從而為微衛(wèi)星標(biāo)記在豚鼠遺傳質(zhì)量控制及突變基因定位等方面的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

普通級(jí)豚鼠，雌性，6～8周齡，①DHP系，花色伴腿部黑色;②Zmu-1:DHP遠(yuǎn)交系，純白色;③Zmu-1:DHP近交系，純白色;④DHP系，全黑色;由浙江大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供【SCXK(浙)2012-0052】;⑤卷毛豚鼠購(gòu)于浙江武義縣;共計(jì)5種，2-3只/種。實(shí)驗(yàn)在浙江大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心進(jìn)行【SYXK(浙)2012-0178】，并按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R原則給予人道的關(guān)懷。

1.1.2 主要試劑與儀器

鏈霉親和素磁珠#S1420S(NEB，英國(guó));pGEM-T vector載體(Promega，美國(guó));限制性內(nèi)切酶Bsp143I及MboI(Fermentas，美國(guó))。磁性分離架(S1506S，美國(guó));生化培養(yǎng)箱(SHP-250，中國(guó));凝膠成像系統(tǒng)(Tanon2500，中國(guó));PCR 儀(Bio-Rad T100，美國(guó))等。

1.2 方法

1.2.1 磁珠富集法獲取微衛(wèi)星序列

采用酚氯仿法提取豚鼠基因組 DNA，經(jīng)Bsp143I和MboI酶切，回收小DNA片段，與Linker-1(P-5'-GATCGCAGAATTCGCACGAGTACTAC-3')和Linker-2(5'-GTAGTACTCGTGCGAATTCTGC-3')連接，PCR擴(kuò)增，回收產(chǎn)物與生物素標(biāo)記的 (AC)16A和(AG)16A探針進(jìn)行雜交，再將雜交液和預(yù)先平衡的磁珠輕輕混合均勻，25℃孵育30 min，依次清洗，最后取 50 μL 0.1 × TE，95℃變性10 min，放到磁力架上，上清即為捕獲微衛(wèi)星序列，PCR擴(kuò)增回收，與pGEM-T載體連接轉(zhuǎn)化，篩選陽(yáng)性克隆，進(jìn)行PCR檢測(cè)及DNA測(cè)序鑒定。

1.2.2 數(shù)據(jù)庫(kù)篩選法

數(shù)據(jù)庫(kù)篩選的微衛(wèi)星序列來自Genome Browser Home(http://genome.ucsc.edu/)網(wǎng)站。操作步驟如下:1)豚鼠基因組序列的查找:點(diǎn)擊“Genomes”，選擇物種“Mammal”，“Guinea pig”;2)微衛(wèi)星核苷酸重復(fù)單元的查找:點(diǎn)擊“Tools”選擇“Table Browse”，設(shè)置參數(shù)，查找并保存序列及位置信息;3)微衛(wèi)星核苷酸重復(fù)單元兩側(cè)序列的查找:返回到Sequence Retrieval Region Options，在兩側(cè)各設(shè)置200 bp序列，獲得含有兩側(cè)序列的微衛(wèi)星序列并保存。

1.2.3 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)微衛(wèi)星兩側(cè)高度保守的序列，設(shè)計(jì)特異性引物。本實(shí)驗(yàn)選用兩堿基重復(fù)7次及以上，三堿基重復(fù)4次以上的序列，設(shè)計(jì)引物，選擇擴(kuò)增長(zhǎng)度在100～300 bp的序列。送上海生物工程有限公司合成。

1.2.4 初步及多態(tài)性檢測(cè)

首先進(jìn)行常規(guī)PCR初步篩選，其次選擇性地進(jìn)行梯度PCR擴(kuò)增，通過優(yōu)化Mg2+濃度(1～4 mol/L)、退火溫度(45～65℃)等條件，建立最佳PCR反應(yīng)體系。以五種豚鼠基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，8%聚丙烯酰胺凝膠電泳銀染顯色，篩選多態(tài)性微衛(wèi)星。

2 結(jié)果

2.1 磁珠富集法篩選微衛(wèi)星標(biāo)記

2.1.1 微衛(wèi)星序列的獲得及類型統(tǒng)計(jì)

磁珠富集捕獲300～1000 bp目的片段，連接轉(zhuǎn)化，篩選陽(yáng)性克隆，經(jīng)菌液PCR初步檢測(cè)(部分結(jié)果如圖1)，挑選陽(yáng)性克隆312個(gè)，DNA測(cè)序，304個(gè)含有微衛(wèi)星序列，陽(yáng)性率為97.5%。經(jīng)SSHunter軟件統(tǒng)計(jì)分析:304個(gè)序列均為二核苷酸重復(fù)，類型較為單一。AC/CA占62.4%;GT/CA占20.8%;TC/AG占16.8%。

2.1.2 引物合成及多態(tài)性篩選

使用DNAStar軟件針對(duì)304個(gè)微衛(wèi)星序列，設(shè)計(jì)引物125條(41.12%);初步檢測(cè)，特異性引物22條;多態(tài)性檢測(cè)，多態(tài)性位點(diǎn)1個(gè)，暫未發(fā)現(xiàn)多態(tài)性的位點(diǎn)17個(gè)(結(jié)果見圖2)，其余4個(gè)均出現(xiàn)雜帶，無法進(jìn)行多態(tài)性判斷。微衛(wèi)星位點(diǎn)信息引物編號(hào)HZ-001;引物序列:CGTGATATGGCCTGGTCGTG ATGAAAAAGATGGGCTGGTT;微衛(wèi)星類型:(AC)17(AC)21;退火溫度:59℃;產(chǎn)物長(zhǎng)度:208 bp;有多態(tài)性。

圖1 菌落PCR鑒定結(jié)果Fig.1 Results of colony PCR amplification

圖2 磁珠富集法篩選微衛(wèi)星位點(diǎn)PAGE電泳結(jié)果Fig.2 PAGE electrophoresis results of microsatellite loci screened using a magnetic bead enrichment protoclol

2.2 數(shù)據(jù)庫(kù)篩選微衛(wèi)星標(biāo)記

2.2.1 基因組數(shù)據(jù)檢索及類型統(tǒng)計(jì)

利用豚鼠基因組數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行部分篩選，獲得微衛(wèi)星序列292個(gè)，以二核苷酸重復(fù)單元為主(共計(jì)216條)占73.97%，其中TC/AG為主(149條)，占二核苷酸重復(fù)單元的68.98%;三核苷酸重復(fù)單元(共計(jì)30條)占10.27%，其中以TCT較多(7條)，占三核苷酸重復(fù)單元的23.33%;四核苷酸重復(fù)單元(共計(jì)39條)占13.36%，其中以TCTT較多(10條)，占四核苷酸重復(fù)單元的25.64%;此外，五核苷酸重復(fù)單元和六核苷酸重復(fù)單元分別為2.06%(5條)和0.34%(1條)。

2.2.2 引物設(shè)計(jì)及多態(tài)性篩選

使用DNAStar軟件針對(duì)292個(gè)序列，設(shè)計(jì)引物178條(60.96%);初步檢測(cè)，特異性引物90條(50.56%);多態(tài)性檢測(cè)，共獲得多態(tài)性位點(diǎn)25個(gè)(27.78%)(如圖3)，暫未發(fā)現(xiàn)多態(tài)性的特異性擴(kuò)增位點(diǎn)28個(gè)(31.11%)，其余37個(gè)均出現(xiàn)雜帶，有待進(jìn)一步優(yōu)化。微衛(wèi)星位點(diǎn)信息(見表1)。

表1 數(shù)據(jù)庫(kù)篩選25個(gè)豚鼠微衛(wèi)星位點(diǎn)相關(guān)信息Tab.1 Characteristics of 25 microsatellite loci screened from the genome database of guinea pig

圖3 數(shù)據(jù)庫(kù)法篩選多態(tài)性微衛(wèi)星標(biāo)記PAGE電泳結(jié)果Fig.3 PAGE electrophoresis results of polymorphic microsatellite loci screened from the genome database of guinea pig

3 討論

3.1 磁珠法和數(shù)據(jù)庫(kù)篩選法篩選微衛(wèi)星標(biāo)記的對(duì)比

微衛(wèi)星標(biāo)記的開發(fā)過程需要耗費(fèi)相當(dāng)?shù)娜肆ω?cái)力，選擇合適的開發(fā)方法會(huì)起到事半功倍的效果。對(duì)于基因組序列完全未知的物種，磁珠富集法篩選微衛(wèi)星標(biāo)記的報(bào)道很多，是目前微衛(wèi)星標(biāo)記開發(fā)廣泛采用的方法。朱亮［11］采用磁珠富集法獲得98個(gè)豚鼠微衛(wèi)星序列，合成引物35對(duì)，多態(tài)性位點(diǎn)17個(gè)。本實(shí)驗(yàn)磁珠富集法獲得微衛(wèi)星序列304個(gè)，合成引物125條(125/304，41.12%)，最終獲得多態(tài)性位點(diǎn)1個(gè)，暫未發(fā)現(xiàn)多態(tài)性的位點(diǎn)17個(gè)。本文采用豚鼠基因組數(shù)據(jù)庫(kù)篩選法進(jìn)行部分搜索，其核苷酸重復(fù)單元類型較多，引物設(shè)計(jì)(178/292，60.96%)及特異性引物篩選(90/178，50.56%)的比例相對(duì)較高，多態(tài)性位點(diǎn)25個(gè)，未發(fā)現(xiàn)多態(tài)性的位點(diǎn)28個(gè)?？傮w來講，磁珠富集法存在操作流程復(fù)雜，費(fèi)用高，獲得理想的微衛(wèi)星序列相對(duì)較少等缺點(diǎn)。相比之下，數(shù)據(jù)庫(kù)法具有極大的篩選利用空間。利用生物學(xué)軟件從 GenBank、EMBL、DDBJ、Genome Browser Home等數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索微衛(wèi)星序列無疑是一個(gè)經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)便，快速有效的方法。

3.2 豚鼠基因組分子標(biāo)記技術(shù)的研究現(xiàn)狀

豚鼠作為常用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，具有十分顯著的特征，如血清補(bǔ)體含量最高、體內(nèi)不能合成維生素C，耳蝸大且聽覺靈敏等，但其遺傳學(xué)研究一直遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后于其它物種，而其相關(guān)機(jī)制的研究受制于其遺傳學(xué)的發(fā)展。Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)中豚鼠微衛(wèi)星標(biāo)記僅有6個(gè)［12］，國(guó)內(nèi)除朱亮等［11］成功獲得豚鼠微衛(wèi)星引物17對(duì)外，未見其他報(bào)道。目前，豚鼠基因組分子標(biāo)記的數(shù)量尚不能滿足對(duì)豚鼠遺傳檢測(cè)及突變基因定位的需要。本文篩選的26個(gè)多態(tài)性微衛(wèi)星位點(diǎn)及45個(gè)候選標(biāo)記是對(duì)相關(guān)工作的極好補(bǔ)充，候選標(biāo)記在擴(kuò)大樣本來源及數(shù)量的基礎(chǔ)上進(jìn)行多態(tài)性檢測(cè)，很可能成為多態(tài)性標(biāo)記。研究者可以利用現(xiàn)有的豚鼠基因組序列信息進(jìn)行分子標(biāo)記的篩選(包括微衛(wèi)星及SNP)，待基因組序列組裝后，可依據(jù)微衛(wèi)星序列將其錨定到對(duì)應(yīng)的染色體區(qū)域，故豚鼠分子標(biāo)記的開發(fā)在基因組測(cè)序公布前后均應(yīng)該得到重視，以促進(jìn)豚鼠遺傳學(xué)的發(fā)展。

3.3 關(guān)于豚鼠微衛(wèi)星標(biāo)記的多態(tài)性及群體特征

Burgos-Paz等［13］利用數(shù)據(jù)庫(kù)中6個(gè)豚鼠微衛(wèi)星標(biāo)記，對(duì)哥倫比亞7個(gè)地區(qū)3個(gè)品系(本土種，改良種和寵物種共計(jì)384只)豚鼠的遺傳多樣性及群體結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究，結(jié)果顯示:等位基因豐度在3.0-6.56，觀察雜合度在0.33-0.60，提示種群間的遺傳分化很低。朱亮等［1］利用自主篩選的8個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記對(duì)封閉群豚鼠(1000個(gè)樣本中隨機(jī)選擇72個(gè))的遺傳情況進(jìn)行檢測(cè)，等位基因豐度在2.0-5.0，雜合度在0.2222-0.5833，群體的遺傳多態(tài)性處于中等水平，在繁殖過程中存在一定程度上的近交現(xiàn)象。以上結(jié)果提示封閉群豚鼠的遺傳分化較低，群體結(jié)構(gòu)單一，近交現(xiàn)象比較嚴(yán)重。

本文用26個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記檢測(cè)現(xiàn)有5種來源的豚鼠群體，發(fā)現(xiàn)這些位點(diǎn)復(fù)等位基因數(shù)目遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于朱亮等結(jié)果，分析原因可能是我們5種豚鼠有三個(gè)遠(yuǎn)交系來自浙江大學(xué)，親緣關(guān)系較近，一個(gè)近交系又是由浙江大學(xué)的遠(yuǎn)交系培育而成，產(chǎn)生突變的可能性不大，而外購(gòu)豚鼠的數(shù)量較少，這些問題都可能導(dǎo)致豚鼠群體的近交系數(shù)上升，微衛(wèi)星標(biāo)記的多態(tài)性下降，以至于本研究結(jié)果中多態(tài)性位點(diǎn)的比例較低。作者05年曾用DNA指紋技術(shù)分析Zmu-1:DHP和DHP品系豚鼠，發(fā)現(xiàn)近交系數(shù)位于0.7左右，處于中高度近交水平［14］，與本文研究結(jié)果近似。關(guān)于國(guó)內(nèi)豚鼠的遺傳背景及檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)有待進(jìn)一步研究。

［1］朱亮，蔡月琴，屠玨，等.應(yīng)用微衛(wèi)星標(biāo)記研究Dunkin Hartley豚鼠封閉群的遺傳背景［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)報(bào)，2011，19(1):51-55.

［2］李薇，江其輝，杜小燕，等.封閉群長(zhǎng)爪沙鼠遺傳標(biāo)準(zhǔn)的建立［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)報(bào)，2011，28(2):31-36.

［3］李瑞生，陳振文，李曉娟，等.微衛(wèi)星DNA標(biāo)記在常用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物遺傳檢測(cè)中的分析［J］.中國(guó)比較醫(yī)學(xué)雜志，2010，20(10):75-76.

［4］劉迪文.Zmu-1:DHP豚鼠部分生物學(xué)特性研究［J］.畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2006，37(5):492-495.

［5］劉迪文.Zmu-1:DHP豚鼠免疫學(xué)功能研究［J］.浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2006，18(4):246-249.

［6］劉迪文.2個(gè)品系豚鼠對(duì)口蹄疫疫苗的免疫反應(yīng)［J］.中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2008，28(3):272-275.

［7］陳振文，趙太云，孫賀娟，等.微衛(wèi)星DNA與生化標(biāo)記分析對(duì)長(zhǎng)爪沙鼠群體遺傳分析的比較［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)報(bào)，2006，14(4):276-279.

［8］吳寶金，茅慧華，曾詠梅，等.snthr-1Bao稀毛小鼠突變基因的精確定位及克隆鑒定［J］.動(dòng)物學(xué)研究，2009，30(3):267-275.

［9］施美蓮，徐平，殷筱舒，等.腹側(cè)黃斑小鼠的部分特征及其突變基因的染色體定位［J］.動(dòng)物學(xué)研究，2012，33(3):290-297.

［10］聞旭陽(yáng)，戴廣海.hMLH1基因啟動(dòng)子CpG島甲基化，微衛(wèi)星不穩(wěn)定與胃癌［J］.中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2011，8(7):9-11.

［11］朱亮，蔡月琴，屠玨，等.磁珠富集法篩選實(shí)驗(yàn)豚鼠微衛(wèi)星分子標(biāo)記［J］.中國(guó)比較醫(yī)學(xué)雜志，2010，20(6):29-34.

［12］Asher M，Lippmann T，Epplen J，et al.Large males dominate:ecology，social organization，and mating system of wild cavies，the ancestors of the guinea pig ［J］.Behav Ecol Sociobiol，2008，62:1509-1521.

［13］Burgos-Paz W，Cerón-Mu?oz M，Solarte-Portilla C.Genetic diversity and population structure of the Guinea pig(Cavia porcellus，Rodentia，Caviidae)in Colombia ［J］.Genet Mol Biol.2011，34(4):711-718.

［14］劉迪文，母連志.用DNA指紋技術(shù)研究Zmu-1:DHP豚鼠的群體遺傳結(jié)構(gòu)［J］.中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2005，25(6):661-663.