魏琦琦，林 青，賈寶光，吳 煉，李承想，張 琳

（中南林業(yè)科技大學(xué) a. 經(jīng)濟(jì)林培育與保護(hù)省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；b. 林學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙 410004）

棗轉(zhuǎn)錄組序列的微衛(wèi)星特征分析

魏琦琦a,b，林 青a,b，賈寶光a,b，吳 煉b，李承想a,b，張 琳a,b

（中南林業(yè)科技大學(xué) a. 經(jīng)濟(jì)林培育與保護(hù)省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；b. 林學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙 410004）

運(yùn)用Illumina測(cè)序平臺(tái)的RNA-seq技術(shù)對(duì)中秋酥脆棗的花、果實(shí)和棗吊進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，并對(duì)測(cè)序獲得的Unigene進(jìn)行微衛(wèi)星特征分析。經(jīng)序列組裝和拼接，共獲得34 587個(gè)Unigene，運(yùn)用Misa軟件分析發(fā)現(xiàn)12 624個(gè)微衛(wèi)星。在所得轉(zhuǎn)錄組序列的單堿基至五堿基微衛(wèi)星中，以單堿基微衛(wèi)星最多（6 314個(gè)，50.02%），并以A/T（6 217個(gè)，98.46%）為主要重復(fù)單元；二堿基微衛(wèi)星（3 335個(gè)，26.42%）次之，其中以AG/CT（2 532個(gè)，75.92%）類型最多；再次是三堿基微衛(wèi)星（2 871個(gè)，22.74%）；最后是四堿基和五堿基微衛(wèi)星，二者僅占所有微衛(wèi)星信息的0.82%。單堿基微衛(wèi)星所占比例最多，為棗最優(yōu)勢(shì)微衛(wèi)星，而且其重復(fù)單元次數(shù)的變化明顯高于其他重復(fù)類型，表明單堿基在整個(gè)棗轉(zhuǎn)錄組中變異最為活躍。

棗；轉(zhuǎn)錄組測(cè)序；RNA測(cè)序；微衛(wèi)星特征

棗Ziziphus jujubaMill.是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)林樹(shù)種之一，迄今已有7 000多年的栽培利用歷史，具有重要的經(jīng)濟(jì)和生態(tài)價(jià)值[1]。棗果實(shí)營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，亦可藥用，棗產(chǎn)業(yè)在我國(guó)經(jīng)濟(jì)林果產(chǎn)業(yè)中發(fā)揮著重要作用。我國(guó)棗資源豐富，品種繁多，近年來(lái)國(guó)內(nèi)外學(xué)者利用SSR、RAPD、AFLP等分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)棗的品種分類、鑒別以及遺傳多樣性方面開(kāi)展了研究[2-4]。

SSR即為微衛(wèi)星標(biāo)記，是均勻分布于真核生物基因組中的簡(jiǎn)單重復(fù)序列[5]，由1～6個(gè)核苷酸的串聯(lián)重復(fù)片段構(gòu)成，由于重復(fù)單位的重復(fù)次數(shù)在個(gè)體間呈高度變異性并且數(shù)量豐富，因此微衛(wèi)星標(biāo)記的應(yīng)用非常廣泛。微衛(wèi)星標(biāo)記可鑒別雜合體和純合子，對(duì)隱性性狀的選擇十分有利。與其他分子標(biāo)記相比較，SSR具有以下優(yōu)點(diǎn)：（1）共顯性，能夠提供比顯性標(biāo)記更多的信息；（2）位點(diǎn)豐富且隨機(jī)均勻地分布在整個(gè)基因組中；（3）以PCR為基礎(chǔ)，技術(shù)簡(jiǎn)便，易于操作，重復(fù)性及穩(wěn)定性好[6]。SSR具有影響轉(zhuǎn)錄、基因調(diào)節(jié)、蛋白質(zhì)功能以及基因組構(gòu)建等功能[7-8]。它具有比其它分子標(biāo)記更多的可檢測(cè)等位基因，被公認(rèn)為目前遺傳學(xué)研究中最令人信賴的分子標(biāo)記之一。目前，在棗中開(kāi)發(fā)了一些SSR標(biāo)記，如馬秋月等[9]利用454高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)棗（‘金絲小棗’）基因組進(jìn)行了部分測(cè)序，在基因組水平上分析了棗微衛(wèi)星的特點(diǎn)。

為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)微衛(wèi)星標(biāo)記資源，本研究利用Illumina測(cè)序平臺(tái)的Hiseq 2000高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)棗花、棗果實(shí)和棗吊進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，并對(duì)獲得的Unigene序列進(jìn)行微衛(wèi)星特征分析，以期為我國(guó)棗品種鑒別以及遺傳研究提供標(biāo)記和序列資源。

1 材料與方法

1.1 植物材料

采集中秋酥脆棗的花、果實(shí)和棗吊作為實(shí)驗(yàn)材料，迅速于液氮中冷凍后，在-80 ℃中保存。

1.2 文庫(kù)構(gòu)建及轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

采用Ambion試劑盒結(jié)合CTAB法提取各棗材料的總RNA，RNA等量混合后，構(gòu)建cDNA文庫(kù)，而后用Illumina平臺(tái)的Hiseq 2000 RNASeq技術(shù)對(duì)棗的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測(cè)序，再對(duì)其測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行處理與分析，采用Trinity軟件對(duì)clean reads進(jìn)行組裝，通過(guò)序列之間的overlap信息組裝得到contig，再根據(jù)序列的paired-end信息和contig之間的相似性對(duì)contig進(jìn)行聚類，然后在局部進(jìn)行組裝得到轉(zhuǎn)錄本，最后從局部中挑選最長(zhǎng)的轉(zhuǎn)錄本作為unigene。對(duì)于多樣品的組裝，由于后續(xù)的表達(dá)豐度、差異基因分析等內(nèi)容均建立在同一套參考基因的基礎(chǔ)上，對(duì)樣品間得到的基因序列作進(jìn)一步的聚類，整合得到對(duì)應(yīng)這個(gè)物種的unigene數(shù)據(jù)庫(kù)。

1.3 轉(zhuǎn)錄組序列中微衛(wèi)星的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

采用MISA軟件對(duì)組裝獲得的Unigene序列進(jìn)行微衛(wèi)星特征分析，查找重復(fù)基元包括：?jiǎn)螇A基≥10次，二堿基≥6次，三堿基≥5次，四堿基≥5次，五堿基≥5次，六堿基≥5次的重復(fù)序列。在統(tǒng)計(jì)各重復(fù)序列時(shí)，將基序的所有可能的+1移碼及其互補(bǔ)序列都視為同一個(gè)序列類型[10-11]。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序組裝結(jié)果及統(tǒng)計(jì)

轉(zhuǎn)錄組測(cè)序共獲得37 107 202條Clean Reads，對(duì)Clean Reads進(jìn)行組裝拼接獲得2 098 231條contig序列。Contig序列長(zhǎng)度主要分布在0～2 000 bp之間，其中以0～300 bp序列數(shù)量居多，約占總contig序列數(shù)量的98.63%，大于2 000 bp的序列數(shù)量約占總contig序列數(shù)量的0.2%。轉(zhuǎn)錄本（Transcript）長(zhǎng)度主要分布在200～2 000 bp之間，在1 000～2 000 bp序列數(shù)量最多，約占總轉(zhuǎn)錄本數(shù)量的27.98%。（見(jiàn)表1）。

表1 中秋酥脆棗轉(zhuǎn)錄組組裝測(cè)序結(jié)果Table 1 Assembly sequencing results of transcriptome of Z.jujuba cv. ‘Zhongqiusucui’

組裝拼接獲得34 587條unigene，序列長(zhǎng)度主要分布在200～3 000 bp范圍內(nèi)，平均長(zhǎng)度為953.25 bp，200～2 000 bp序列數(shù)量最多，占全部unigene序列數(shù)量的87.47%，2 000～3 000 bp的unigene序列有2 866條，占全部unigene序列數(shù)量的8.29%，大于3 000 bp的unigene序列有1 471條，占4.25%（見(jiàn)表2）。

2.2 微衛(wèi)星類型及數(shù)目統(tǒng)計(jì)

使用Misa軟件，共發(fā)現(xiàn)12 624條微衛(wèi)星重復(fù)序列，對(duì)棗轉(zhuǎn)錄組中單堿基至六堿基重復(fù)完整型微衛(wèi)星和復(fù)合型微衛(wèi)星進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，以完整型微衛(wèi)星為主，共有10 453條，占總微衛(wèi)星的82.8%，而復(fù)合型微衛(wèi)星只有2 171條，占17.2%。在完整型微衛(wèi)星中，單堿基完整型微衛(wèi)星（5 076個(gè)，40.21%）最多，其次是二堿基完整型微衛(wèi)星（2 788個(gè)，22.08%）和三堿基完整型微衛(wèi)星（2 501個(gè)，19.81%），而四堿基和五堿基完整型微衛(wèi)星最少（88個(gè)，0.7%）。本研究中未發(fā)現(xiàn)六堿基重復(fù)的微衛(wèi)星（見(jiàn)圖1）。

表2 中秋酥脆棗的Unigene的長(zhǎng)度統(tǒng)計(jì)Table 2 Numbers and proportions of Unigene of Z.jujuba cv. ‘Zhongqiusucui’ in different lengths

圖1 SSR類型及數(shù)目Fig.1 Types and numbers of microsatellite in SSR database

2.3 不同重復(fù)基序微衛(wèi)星的頻率

在棗轉(zhuǎn)錄組微衛(wèi)星數(shù)據(jù)庫(kù)中，共有12 624條微衛(wèi)星序列。單堿基微衛(wèi)星最多（6 314個(gè)，50.02%），并以A/T類型為主；其次是以AG/CT類型最多的二堿基微衛(wèi)星（3 335個(gè)，26.42%）；再次是三堿基微衛(wèi)星（2 871個(gè)，22.74%）；四堿基和五堿基微衛(wèi)星最少，共有104個(gè)，只占所有微衛(wèi)星信息的0.82%（見(jiàn)表3）。

表3 不同類型微衛(wèi)星的頻率Table 3 Frequency of classified repeat SSRs

在對(duì)棗不同類型重復(fù)單元微衛(wèi)星中各重復(fù)單元數(shù)量的變化情況的統(tǒng)計(jì)得出：在2種單堿基重復(fù)微衛(wèi)星中，以A/T為最主要的重復(fù)單元，共有6 217個(gè)，占98.46%，而C/G只占1.54%（見(jiàn)圖2）。

圖2 單堿基微衛(wèi)星的頻率Fig.2 Frequency of mononucleotide repeat SSRs

二堿基重復(fù)類型有4種（AC/GT、AG/CT、AT/AT和CG/CG），其中AG/CT重復(fù)的數(shù)量最多，共有2 532個(gè)，占總數(shù)的75.92%；其次是AT/AT（531個(gè)，15.92%）；再次是AC/GT（271個(gè)，8.12%）；而CG/CG只有一個(gè)（見(jiàn)圖3，封三）。

三堿基重復(fù)類型有10種，AAG/CTT重復(fù)的數(shù)量最多，共有1 070個(gè)，占37.27%；其次是ATC/ATG（375個(gè)，13.06%）和ACC/GGT（373個(gè)，12.99%）；再次是AAC/GTT（260個(gè)，9.05%）、AAT/ATT（224個(gè)，7.8%）和AGG/CCT（220個(gè)，7.66%），其他重復(fù)堿基則相對(duì)較少（見(jiàn)圖4，封三）。

在18種四堿基重復(fù)類型中，以AAAT/ATTT重復(fù)數(shù)量為最多，共31個(gè)（33.33%），其次為AAAG/CTTT（21個(gè)，22.58%）（見(jiàn)圖5，封三）。

五堿基重復(fù)類型有9種，AAAAT/ATTTT重復(fù)數(shù)量最多，有3個(gè)，占27.27%（見(jiàn)圖6，封三）。

由分析結(jié)果知，棗的微衛(wèi)星數(shù)量隨著重復(fù)次數(shù)增加而呈遞減趨勢(shì)，其中以單堿基微衛(wèi)星最為明顯，二堿基微衛(wèi)星次之，再次是三堿基微衛(wèi)星，四堿基微衛(wèi)星和五堿基微衛(wèi)星重復(fù)次數(shù)最少。

3 結(jié)論與討論

（1）棗不同重復(fù)序列結(jié)構(gòu)微衛(wèi)星類型

高通量RNA-seq測(cè)序具有高精度、不需要參考基因組信息、低成本、應(yīng)用范圍廣等優(yōu)勢(shì)，尤其可為非模式植物轉(zhuǎn)錄組學(xué)的研究提供捷徑。本研究利用Illumina高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)棗轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測(cè)序，共獲得約2 098 231條contig序列和34 587個(gè)unigene序列。而后再對(duì)unigene數(shù)據(jù)庫(kù)得到的unigene序列進(jìn)行SSR標(biāo)記開(kāi)發(fā)的分析。

按照微衛(wèi)星重復(fù)序列結(jié)構(gòu)的不同，將其分為完整型微衛(wèi)星、不完整型微衛(wèi)星以及復(fù)合型微衛(wèi)星。完整型微衛(wèi)星一般是由1種串聯(lián)重復(fù)序列以不間斷的重復(fù)方式構(gòu)成的單一重復(fù)類型的微衛(wèi)星；不完整型微衛(wèi)星是指2個(gè)或2個(gè)以上的同種重復(fù)序列被3個(gè)或3個(gè)以下的非重復(fù)堿基分隔開(kāi)；復(fù)合型微衛(wèi)星指2個(gè)或2個(gè)以上的串聯(lián)核心序列被3個(gè)或者3個(gè)以上連續(xù)的非重復(fù)堿基所間隔，但這種連續(xù)性的核心序列重復(fù)數(shù)不得少于5[12]。

根據(jù)其重復(fù)序列結(jié)構(gòu)的重復(fù)類型不同將微衛(wèi)星重復(fù)序列進(jìn)行分類，并對(duì)由此獲得的12 624條微衛(wèi)星重復(fù)序列中單堿基至六堿基重復(fù)完整型和復(fù)合型進(jìn)行分析得出：大部分為完整型微衛(wèi)星，共有10 453條，占總微衛(wèi)星的82.79%；而復(fù)合型微衛(wèi)星只有2 171條，占總微衛(wèi)星的17.2%。又針對(duì)完整型微衛(wèi)星進(jìn)行分析得出：以單堿基重復(fù)完整型微衛(wèi)星為最多，其次是二堿基重復(fù)完整型微衛(wèi)星，再次是三堿基重復(fù)完整型微衛(wèi)星，四堿基和五堿基重復(fù)完整型微衛(wèi)星最少，未發(fā)現(xiàn)六堿基。在棗的基因組序列微衛(wèi)星特征研究中，六堿基重復(fù)微衛(wèi)星出現(xiàn)的頻率（40.1%）明顯高于其他類型，之后依次為復(fù)合堿基（18.0%）、單堿基（17.1%）、四堿基（8.1%）、二堿基（7.5%）、三堿基（7.0%）、五堿基（2.2%）[9:83]?？梢?jiàn)，棗轉(zhuǎn)錄組比基因組低級(jí)基元頻率高，而高級(jí)基元比基因組的低。

（2）棗優(yōu)勢(shì)重復(fù)堿基類型分析

本研究中，單堿基微衛(wèi)星出現(xiàn)的頻率（50.02%）明顯高于其他類型，其次是二堿基微衛(wèi)星（26.42%），再次是三堿基微衛(wèi)星（22.74%），四堿基微衛(wèi)星（0.74%）和五堿基微衛(wèi)星（0.08%）最少。從基元重復(fù)次數(shù)來(lái)看，棗微衛(wèi)星數(shù)量隨著重復(fù)次數(shù)增加而呈遞減趨勢(shì)，堿基重復(fù)次數(shù)越少，微衛(wèi)星數(shù)量下降速率越快。其中以單堿基微衛(wèi)星最為明顯，二堿基微衛(wèi)星次之，再次是三堿基微衛(wèi)星，四堿基微衛(wèi)星和五堿基微衛(wèi)星重復(fù)次數(shù)最少。單堿基微衛(wèi)星集中在10～23次重復(fù)，二堿基微衛(wèi)星是6～12次重復(fù)，三堿基微衛(wèi)星是5～8次重復(fù)，四堿基微衛(wèi)星是5～6次重復(fù)，五堿基微衛(wèi)星僅集中于5次重復(fù)。通常認(rèn)為SSR位點(diǎn)的變異頻率與基元重復(fù)數(shù)存在一定的正相關(guān)，即重復(fù)次數(shù)越多，SSR產(chǎn)生變異的可能性越大[13]。本研究中單堿基重復(fù)微衛(wèi)星為棗最優(yōu)勢(shì)微衛(wèi)星，所占比例最多，而且單堿基微衛(wèi)星重復(fù)單元次數(shù)的變化明顯高于其他重復(fù)類型，其次是二堿基微衛(wèi)星，這在一定程度上說(shuō)明單堿基在整個(gè)棗轉(zhuǎn)錄組中變異最為活躍。

（3）棗優(yōu)勢(shì)重復(fù)單元堿基組成分析

在2種單堿基重復(fù)微衛(wèi)星中，以A/T為最主要的重復(fù)單元；4種二堿基重復(fù)類型是AG/CT重復(fù)的數(shù)量最多，其次為AT/AT；10種三堿基重復(fù)類型中AAG/CTT重復(fù)的數(shù)量最多，其次為ATC/ATG和ACC/GGT，再次為AAC/GTT、AAT/ATT和AGG/CCT，其他重復(fù)堿基則相對(duì)較少；在18種四堿基重復(fù)類型中， AAAT/ATTT的重復(fù)數(shù)量最多，其次是AAAG/CTTT；五堿基重復(fù)類型有9種，AAAAT/ATTTT重復(fù)的數(shù)量最多。由此發(fā)現(xiàn)棗不同重復(fù)堿基類型優(yōu)勢(shì)重復(fù)單元的共同特點(diǎn)是富含A和T堿基。不同植物中優(yōu)勢(shì)重復(fù)單元不同：杜仲轉(zhuǎn)錄組微衛(wèi)星中，出現(xiàn)頻率高的2個(gè)重復(fù)類型是AG/TC和CT/GA，其次是AC/TG和AGA/TCT[14]；南方紅豆杉轉(zhuǎn)錄組中，出現(xiàn)頻率高的重復(fù)類型是AAG/CTT、AGG/CCT、AGC/CTG、ATC/ATG、AG/CT、AT/AT[15]。同一物種不同組織器官優(yōu)勢(shì)重復(fù)單元不同：在茶樹(shù)轉(zhuǎn)錄組微衛(wèi)星中占優(yōu)勢(shì)的前3種重復(fù)類型是CT/AG 、TC/GA和AT/TA，其次是A/T[16]；在茶樹(shù)花轉(zhuǎn)錄組中單堿基至六堿基重復(fù)單元中出現(xiàn)頻率最高的類型分別是A/T、AG/CT、AAG/CTT、AAAG/CTTT、AAAAT/ATTTT 和 AAAAAC/GTTTTT[17]。

在微衛(wèi)星重復(fù)序列中，如CA、GA、GT等重復(fù)可以通過(guò)影響DNA的結(jié)構(gòu)而影響DNA重組，因此微衛(wèi)星中的重復(fù)單元堿基組成在很大程度上會(huì)影響生物的生命活動(dòng)[18]。造成不同植物基因組中不同重復(fù)堿基類型及重復(fù)單元偏好性的原因除了與不同物種間的真實(shí)微衛(wèi)星信息差異有關(guān)外，可能還與不同微衛(wèi)星查找工具中的參數(shù)設(shè)置有一定關(guān)系[19]。

（4）微衛(wèi)星技術(shù)在棗研究中的應(yīng)用前景

微衛(wèi)星序列廣泛分布于真核生物基因組的編碼區(qū)和非編碼區(qū)，通過(guò)對(duì)棗轉(zhuǎn)錄組中微衛(wèi)星序列特征的分析，對(duì)開(kāi)發(fā)大量高效的微衛(wèi)星分子標(biāo)記提供了重要的信息資源，另外對(duì)于在轉(zhuǎn)錄組序列中發(fā)掘的微衛(wèi)星序列，它是具有基因功能的序列，有助于開(kāi)發(fā)出棗的重要基因關(guān)聯(lián)的微衛(wèi)星標(biāo)記。本研究中所得到的棗轉(zhuǎn)錄組微衛(wèi)星對(duì)以后該物種的進(jìn)化、遺傳多樣性、棗品種的鑒別及分子標(biāo)記輔助育種等方面的研究奠定基礎(chǔ)。

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Microsatellites characteristics of transcriptomic sequences fromZiziphus jujubacv. ‘Zhongqiusucui’

WEI Qi-qia,b, LIN Qinga,b, JIA Bao-guanga,b, WU Lianb, LI Cheng-xianga,b, ZHANG Lina,b
(a. Key Lab. of Cultivation and Protection for Non-wood Forest Tree Co-constructed by China Education Ministry and Hunan;b. College of Forestry, Central South University of Forestry and Technology, Changsha 410004, Hunan, China)

Transcriptome sequencing was conducted on fruits, fl owers, and bearing shoots of eliteZiziphus jujubacv. ‘Zhongqiusucui’by using Illumina-based RNA-seq technology. The microsatellites characteristics were then analyzed from the obtained unigenes. The assembled unigenes were totally 34 584, from which 12 624 microsatellites repeats were detected with Misa software. In the 1～5 bases repeat microsatellites, the mononucleotide repeat microsatellites (MNRs) were the maximum in quantitative terms (6 314, 50.02%), of which the A/T (6 217, 98.46%) was the main repeating MNRs; the next was the the dinucleotide repeat microsatellites(3 335, 26.42%), in which AG/CT was the most common DNRs(2 532, 75.92%); the third was trinucleotide repeat microsatellites(2 871,occupying 22.74%); the last was tetranucleotide and pentanucleotide repeat microsatellites( the least, accounting for 0.82% of the total microsatellites). It is concluded that the MNRs was the preponderance among Z. jujuba, and changes in the number of the MNRs repeat motifs was higher than the others, which indicates that the mononucleotide is the most active motif in the variation from theZ. jujuba’s transcriptome.

Ziziphus jujuba; transcriptome sequencing; RNA sequencing; microsatellite characteristics

S727.3；S665.1

A

1673-923X(2015)06-0093-05

10.14067/j.cnki.1673-923x.2015.06.017

2014-09-24

國(guó)家“十二五”農(nóng)村領(lǐng)域科技計(jì)劃課題（2013BAD14B03）

魏琦琦，碩士研究生 通訊作者：張 琳，副教授，博士；E-mail: triwoodtim918@126.com

魏琦琦,林 青,賈寶光,等. 棗轉(zhuǎn)錄組序列的微衛(wèi)星特征分析[J].中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報(bào),2015,35(6):93-97.

[本文編校：吳 彬]