李海燕，王志，2，陳雄，2，*，付剛

（1.湖北工業(yè)大學生物工程學院，湖北武漢430068；2.發(fā)酵工程教育部重點實驗室，湖北武漢430068；3.濰坊盛泰藥業(yè)有限公司，山東昌樂262400）

植酸酶（Phytase）是一類水解植酸的磷酸酶類，在動物、植物、微生物中均有發(fā)現，其主要來源是微生物源植酸酶。自然界有許多微生物都能產生植酸酶，如細菌、酵母和絲狀真菌等，特別是曲霉菌屬微生物，如黑曲霉、無花果曲霉、米曲霉等都能產生活性較高的植酸酶[1]。微生物來源的植酸酶與其他來源的相比較具有來源廣、生產周期短、pH耐受范圍大等優(yōu)點，因而優(yōu)化培養(yǎng)條件和工藝、進一步提高產量，成為微生物發(fā)酵產植酸酶研究的熱點。

目前植酸酶在飼料中應用比較廣泛，植酸酶可以降解植酸鹽蛋白質絡合物，提高動物對蛋白質的利用，從而減少植酸鹽對微量元素的螯合，提高飼料的營養(yǎng)價值，另一方面可以降低糞便中的磷含量，減少環(huán)境污染[2-6]。

本文以黑曲霉為底物，利用液態(tài)發(fā)酵，探索了不同工藝條件對黑曲霉發(fā)酵產植酸酶的影響，篩選了最佳工藝條件，為大規(guī)模發(fā)酵生產廉價的植酸酶制劑奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌種

黑曲霉（Aspergillus niger）：湖北工業(yè)大學發(fā)酵工程教育部重點實驗室保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基

活化培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，去離子水1 000 mL。

種子培養(yǎng)基：麩皮2 g，葡萄糖3 g，硫酸銨0.15 g，去離子水100 mL。

搖瓶培養(yǎng)基：蛋白胨1.0 g，葡萄糖60.0 g，NH4NO32.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，KCl 0.5 g，FeSO4·7H2O 0.01 g，MnSO40.01 g，吐溫-80 2.0 mL，溶于 1 000 mL 去離子水中。

優(yōu)化培養(yǎng)基：詳見實驗方法。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養(yǎng)方法

1.2.1.1 活化培養(yǎng)

將黑曲霉菌種，接種到PDA斜面培養(yǎng)基上，26℃下培養(yǎng)5 d。

1.2.1.2 種子培養(yǎng)

按配方配制種子培養(yǎng)基，在250 mL三角瓶中裝100 mL，115℃滅菌30 min，從上述活化的斜面培養(yǎng)基上刮取幾環(huán)孢子集中到種子培養(yǎng)液中，在30℃下，220 r/min培養(yǎng)36 h。

1.2.1.3 培養(yǎng)基優(yōu)化研究

運用正交試驗理論對發(fā)酵培養(yǎng)基進行優(yōu)化，采用六因素五水平的方法，設計出如表1培養(yǎng)基配方。正交實驗培養(yǎng)條件：培養(yǎng)基初始pH自然，接種量10%，培養(yǎng)溫度28℃，搖床轉速300 r/min。

表1 黑曲霉培養(yǎng)基優(yōu)化正交試驗方案Table 1 Medium optimization of Aspergillus niger with orthogonal experimental program

1.2.1.4 發(fā)酵條件優(yōu)化研究

在上述實驗中確定的最佳培養(yǎng)基條件下研究發(fā)酵條件。從培養(yǎng)基初始pH，培養(yǎng)溫度及搖床轉速3個方面做單因素實驗。詳細設計方案如表2所示。在發(fā)酵過程中每隔6 h取樣測定植酸酶酶活力，確定最佳的發(fā)酵條件。

1.2.1.5 發(fā)酵培養(yǎng)

按配方配制發(fā)酵培養(yǎng)基，在250 mL三角瓶中裝50 mL，115℃滅菌30 min，接種5 mL種子液。30℃，220 r/min搖床培養(yǎng)。每隔6 h取樣，測總糖、酶活、pH和生物量。

表2 黑曲霉發(fā)酵條件優(yōu)化單因素實驗設計Table 2 Aspergillus Niger fermentation conditions optimization single factor experiment design

1.2.2 分析檢測

1.2.2.1 植酸酶酶活力的測定

無機磷與鉬酸銨結合，生成黃色的磷鉬酸銨，再經過還原劑作用，則變?yōu)樗{色物質，在一定范圍內藍色的深淺與磷的含量成正比，可用比色法測定。利用植酸酶可以水解植酸磷釋放無機磷的原理，用VC-鉬藍法測定植酸酶活[7]。

酶活力單位的定義：在上述反應條件下，每毫升酶每分鐘產生1毫微摩爾無機磷的酶量為一個植酸酶活力單位（U）。

1.2.2.2 發(fā)酵液總糖含量測定

總糖測定參見文獻中蒽酮比色法測定食品中總糖含量[8]。

1.2.2.3 黑曲霉生物量及發(fā)酵液酸度測定

黑曲霉生物量采用干重法計量。發(fā)酵液酸度用實驗室pH計測定。

2 結果與分析

2.1 磷標曲確定

根據實驗設計測定磷含量，以光密度為縱坐標，磷含量為橫坐標，制作磷標準曲線如圖1。

圖1 磷標準曲線Fig.1 Phosphorus standard curve

根據圖1的標準曲線，通過測定發(fā)酵液的OD值，可以在曲線上對應磷含量，計算出植酸酶酶活力，然后分析發(fā)酵過程中酶活力的變化趨勢。

2.2 總糖標曲確定

根據實驗設計測定葡萄糖含量，以光密度為縱坐標，葡萄糖含量為橫坐標，制作葡萄糖標準曲線如圖2。

圖2 葡萄糖標準曲線Fig.2 Glucose standard curve

根據圖2的標準曲線，通過測定發(fā)酵液的OD值，可以在曲線上對應葡萄糖含量?？梢苑治霭l(fā)酵過程中葡萄糖變化趨勢。

2.3 發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化

按照正交試驗表進行發(fā)酵實驗，在60 h時對搖瓶的植酸酶活進行測定，測定數據見表3。

表3 培養(yǎng)基優(yōu)化實驗結果與分析Table 3 Results and analysis of medium optimization experiment

由正交結果可以看出，實驗12中發(fā)酵得到的植酸酶的活性最高。均值中，C源在因素3時獲得最大，氮源在因素5獲得最大，鉀離子在因素4獲得最大，亞鐵離子在因素1獲得最大，鎂離子在因素5獲得最大，錳離子在因素3獲得最大。即最佳的配比為：5%可溶性淀粉，5%豆粕，0.9%KCl，0.1%FeSO4·7H2O，0.9%MgSO4·7H2O，0.5%MnSO4。根據極差可知，影響程度，MgSO4·7H2O＞可溶性淀粉＞豆粕＞MnSO4＞FeSO4·7H2O＞KCl。

2.4 發(fā)酵條件優(yōu)化

2.4.1 最適初始pH確定

發(fā)酵培養(yǎng)基的pH對植酸酶酶活力有一定的影響。一般菌體的生長pH與產酶pH不一致，因此考慮對產酶pH進行優(yōu)化，其余發(fā)酵參數參見培養(yǎng)基優(yōu)化，結果見圖3。

圖3 不同初始pH對酶活的影響Fig.3 Effects of different initial pH value on enzyme activity

圖3 顯示在5個梯度的初始pH條件下，5條產酶曲線均在發(fā)酵培養(yǎng)60 h時表現出最高酶活，初始pH控制在5.5時，酶活力最高，達到18.51 U。

2.4.2 最適培養(yǎng)溫度確定

溫度是保證微生物生長和產物的合成的重要因素，也是保證酶活力的重要條件。溫度太低或太高都不利于菌體生長和產酶，因此發(fā)酵是必須保證穩(wěn)定而合適的溫度環(huán)境[9]。其余發(fā)酵條件為：初始pH為5.5，搖床轉速為300 r/min。由圖4可以看出，黑曲霉發(fā)酵產植酸酶的最適發(fā)酵溫度為30℃，植酸酶最高酶活力為19.02 U。溫度低于或者高于30℃都不利于產酶，只是因為隨著溫度的變化，黑曲霉的生產代謝出現加快或者滯后的狀態(tài)，沒有達到最佳狀態(tài)而提前衰老，從而影響酶的產量。

圖4 不同發(fā)酵溫度對酶活的影響Fig.4 Effects of different initial fermentation temperature on enzyme activity

2.4.3 最適搖床轉速確定

搖床轉速影響發(fā)酵過程中的溶氧，低溶氧條件對黑曲霉的生長不利，影響植酸酶的生成，轉速對酶活力的影響如圖5所示。

圖5 不同搖床轉速對酶活的影響Fig.5 Effects of different initial shaking speed on enzyme activity

隨著轉速的提高，黑曲霉生長比較好，植酸酶產量升高，在轉速為220 r/min時達到最佳，酶活力達到了19.88 U。當超過220 r/min后，酶活力降低，表明高溶氧濃度不利于菌體的生長和酶的生成，原因可能是因為溶氧過高，發(fā)酵過程中的副產物增加，抑制了菌體的生長和酶的形成。

2.5 黑曲霉發(fā)酵產植酸酶

在優(yōu)化的培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件下，對黑曲霉的發(fā)酵過程進行監(jiān)控，探索黑曲霉發(fā)酵產植酸酶過程中的總糖變化，pH變化，生物量變化以及植酸酶酶活力的變化過程。

圖6 黑曲霉發(fā)酵產植酸酶實驗Fig.6 Aspergillus Niger fermentation production phytase experiment

由圖6可知，植酸酶酶活力在60 h達到了最大值19.927 8 U，最佳發(fā)酵時間為60 h。生物量的變化展現了黑曲霉的生產過程，在60 h之前成對數生長期，菌體生長較快，60 h～78 h是穩(wěn)定期，78 h后進入衰退期。黑曲霉的生長狀況與植酸酶的生產以及總糖的消耗情況相吻合。黑曲霉液態(tài)發(fā)酵產生的植酸酶屬于酸性植酸酶，植酸酶酶學性質另文發(fā)表。

3 小結

黑曲霉液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化得出最佳配比為：5%可溶性淀粉，5% 豆粕，0.9%KCl，0.1%FeSO4·7H2O，0.9%MgSO4·7H2O，0.5%MnSO4，影響程度，MgSO4·7H2O＞可溶性淀粉＞豆粕＞MnSO4＞FeSO4·7H2O＞KCl。發(fā)酵條件優(yōu)化的最佳發(fā)酵時間為60 h，最適初始pH為5.5，最佳發(fā)酵溫度為30℃，最佳搖床轉速為220 r/min。

[1]Rudy J Wodzinskl,A H J Ullah.Phytase[J].Advances in Applled Microbiology,1996(42):263-302

[2]Lambrechts C,Boze H.Utilization of phytate by some yeast[J].Biotechnology Letters,1992,14(1):61-66

[3]Scwarz G,Hoppe P P.Phytase enzyme to curb pollution from pigs and poultry[J].Feed Magazine,1992,22-26

[4]Nagashima T,Tange T,Anazaws H.Dephosphorulation of phytate by using the Aspergillus niger phytase with a high affinity for phytate[J].Appl Environ Microbial,1999,65(10):4682-4684

[5]Mitchell D B,Vogel K,Weimann B J,et al.The phytase subfamily of histidine acid phosphatases:isolation of genes for two novel phytase from the fungi Aspergillus terreus and Myceliophthora thermophila[J].Microbiology,1997,143:245-252

[6]Haifeng Y,Xiaowen LV,Jing W,et al.Near-infrared reflectance spectroscopy based methods for phytase registration in feed industry[J].J Agri Chem,2007,55:7667-7675

[7]Heinohen J K,Lathi R J.A new and convenient colorimetric determination of inorganic orthophosphate and its application to the assay of inorganic pyrophosphatase[J].Anal Biochem 1981,113:313-317

[8]張水華.食品分析實驗[M].北京:化學工業(yè)出版社,2005:43

[9]姚汝華.微生物工程工藝原理[M].廣州:華南理工大學出版社,2005:194