崔磊，金護定，尹成日

(延邊大學長白山生物資源與功能分子教育部重點實驗室，吉林 延吉 133002)

0 引言

人參皂苷(ginsenosides GS)是人參生理活性的主要物質(zhì)基礎，也是人參成分中最有效的藥用成分.目前，已經(jīng)從人參中分離出約50種人參皂苷成分[1].藥理研究表明，人參皂苷普遍具有抗腫瘤[2]、抗氧化[3]、改善記憶力[4]、抗疲勞[5]、保護神經(jīng)[6]等藥理作用.人參皂苷Rg3最初從紅參中分離得到[7]，它主要作用于細胞增殖周期的G2/M期，具有誘導腫瘤細胞凋亡，選擇性抑制腫瘤細胞黏附和浸潤，抑制腫瘤新生血管的形成，增強機體免疫力等作用；但這些皂苷天然含量極低，如Rg3在白參中的含量僅為0.000 3%，在紅參中的含量約為0.03%，因此從人參中直接提取這些稀有皂苷較為困難.

目前，制備人參皂苷主要采用在人參中對含量較高的Rb1、Rb2、Rc、Rd等主皂苷(major ginsenosides)分子的糖基進行選擇性水解的方法，其中微生物轉化法具有條件溫和、選擇性強、無污染等優(yōu)點[8].侯耀達等[9]利用從林下參根部土壤中分離得到的菌株GS1-33將人參根總皂苷轉化為人參稀有皂苷C-K和Rh1.白龍律等[10]利用一種擴展青霉(Penicilliumexpansum)GY-06將人參皂苷Rb1轉化為Rg3.本文利用從土壤中優(yōu)選的人參皂苷生物轉化高效菌株，對人參莖葉總皂苷及人參提取物進行微生物轉化，并考察了其人參發(fā)酵物對結腸癌colon26-M3.1細胞的抑制作用.

1 材料與方法

1.1 材料

土壤樣品采集于長白山園參、移山參根部土壤以及長白山溫泉土樣.

1.2 試劑

人參莖葉總皂苷和人參皂苷購于成都思科華生物技術有限公司，人參購于延吉市參茸市場，薄層層析板Silica gel 60-F254購于德國Merck公司，營養(yǎng)瓊脂、R2A瓊脂、YM瓊脂和MRS瓊脂培養(yǎng)基購于Sigma公司，實驗中所用化學試劑均為分析純.

1.3 儀器

儀器有：立式電熱壓力蒸汽滅菌器(LDZX- 30KB，上海申安醫(yī)療器械)；生物安全柜(BSC-1300 Ⅱ A/B3)；pH計(雷磁PHS-3C型)；電子天平(JA5003型，上海良平儀器儀表有限公司)；高速離心機(MCD-2000 HSIANGTAI)；液相色譜儀(LC-6A，日本島津)；振蕩培養(yǎng)箱(HZQ-C，哈爾濱市東聯(lián)電子技術開發(fā)有限公司)；分析天平(Sartorius BT 224 S)；ALT試劑盒、AST試劑盒(購于南京建成生物工程研究所)；SP-4430全制動生化分析儀(日本ARKRAY公司)；PCR儀(TC-512，英國Techne公司)；光學顯微鏡(BX61 Olymps Cooperation Made In Japan)；酶標儀(FLx 800，基因有限公司)；MALDI-TOF-MS (Voyager DE-STR，日本導津).

1.4 微生物的分離篩選

將采集的土樣利用十倍稀釋法進行稀釋，將稀釋液分別接種到營養(yǎng)瓊脂、R2A、YM瓊脂和MRS瓊脂培養(yǎng)基上，在30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3 d，隨后挑取單個菌落傳代；重復以上操作數(shù)次，得到純培養(yǎng)的菌種[11].根據(jù)七葉苷顯色原理[12]，七葉苷被β-葡萄糖苷酶水解后生成葡萄糖和6,7-二羥香豆素(七葉苷元)，七葉苷元遇到鐵離子生成黑色物質(zhì).把分離出的單一菌株涂在由七葉苷修飾的R2A瓊脂(E-R2A)培養(yǎng)基上培養(yǎng)，瓊脂培養(yǎng)基成分包括R2A瓊脂15.2 g，七葉苷1.0 g，檸檬酸鐵0.5 g.觀察培養(yǎng)基的顏色變化，變成黑色的即為具有β-葡萄糖苷酶活性的菌株，且顏色越黑，活性越強.

1.5 人參莖葉總皂苷的微生物轉化

配制pH 7.0的液體培養(yǎng)基，加入10 g/L的人參莖葉總皂苷，然后分裝在250 mL三角瓶中，每瓶50 mL；高壓滅菌，冷卻至室溫后，接種5 mL產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的菌株培養(yǎng)液，放置于30 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)器中發(fā)酵.每隔2 d取樣品，連續(xù)取5次，離心后取上清液，然后用TLC和HPLC測定發(fā)酵過程中人參皂苷的變化.液體培養(yǎng)基成分為：NH4Cl (0.5 g/L)，KH2PO4(0.5 g/L)，K2HPO4(1 g/L)，MgSO4·7H2O (0.25 g/L)，酵母膏(1 g/L).

1.6 人參提取物的微生物轉化

取25 g鮮參(或5 g干參)加入250 mL蒸餾水，用保鮮膜密封后置于恒溫培養(yǎng)箱中，24 h后過濾得到人參提取物.將提取物用1 mol/L HCl處理，得到酸處理后的人參提取物.然后，利用產(chǎn)β-葡萄糖苷酶菌株分別對人參提取物和酸處理后的人參提取物進行發(fā)酵，得到兩種人參發(fā)酵物.

1.7 薄層色譜法(TLC法)測定人參皂苷

將人參稀有皂苷Rg3和Rh2的標準品配成混合標準品醇溶液.將樣品與標準品溶液在TLC板上同時展開，展開劑為體積比為10∶5∶1的氯仿、甲醇、水混合液，吹干后用10%(體積比)的硫酸乙醇溶液顯色，并與標準品Rf值比對，以此檢驗稀有人參皂苷Rg3和Rh2是否生成.

1.8 高效液相色譜法(HPLC法)測定人參皂苷

高效液相色譜儀HP 1100，UV檢測器，色譜柱采用BDS HYPERSIL C18柱 (250 mm×4.6 mm)，檢測波長為203 nm，流速為0.8 mL/min，柱溫為30 ℃，流動相為0.001%甲酸-乙腈溶液，梯度洗脫(條件如表1).

表1 高效液相色譜梯度洗脫條件

1.9 人參發(fā)酵物對結腸癌colon26-M3.1細胞的抑制作用

選取菌株YS2、YS5、YS7和YS8對人參提取物和酸處理后的人參提取物進行發(fā)酵轉化，發(fā)酵8 d后，將發(fā)酵液離心，滅菌，凍干成粉末得到人參發(fā)酵物.取對數(shù)生長期細胞，消化后接種細胞于96孔板中，加入不同濃度的人參發(fā)酵物培養(yǎng).加入噻唑藍(MTT)溶液孵育后，用酶標儀測定吸光度，根據(jù)公式：細胞存活率/%=(實驗孔測定值/對照孔測定值)×100,計算結腸癌colon26-M3.1細胞存活率[13]，并計算50%細胞存活率時的發(fā)酵物的濃度(IC50).

1.10 菌株的形態(tài)學觀察及ITS測序

在光學顯微鏡下觀察菌株YS2菌體的大小、形態(tài)及孢子形態(tài).采用氯化芐法[14]提取YS2菌株基因組總DNA，使用nested-PCR擴增ITS序列[15].先用引物NSA3 (5′-AAA CTC TGT CGT GCT GGG GAT A-3′)和NLC2 (5′-GAG CTG CAT TCC CAA ACA ACT C-3′)進行PCR擴增.PCR反應體系(25 μL)為：2X Taq PCR MasterMix (TIANGEN) 12.5 μL，MgCl2(25 mΜ)1 μL，引物為NSA3 (5 μΜ)和NLC2 (5 μΜ)各1 μL，DNA模板1 μL，超純水8.5 μL.PCR擴增程序為：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，20個循環(huán)；72 ℃ 15 min.采用PCR純化試劑盒(Bioneer公司)純化PCR產(chǎn)物，送上海英駿生物技術有限公司進行測序.

將測得的基因序列通過Blast程序(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)與GenBank中核酸數(shù)據(jù)庫進行對比分析，相似的序列進行多重匹配排列分析(clustalx 1.83)[16].用Mega 4.0[17]分析軟件中的Neighbor Joining方法[18]構建系統(tǒng)發(fā)育樹.

2 結果與分析

2.1 微生物的分離與篩選

從采集的長白山土壤樣品中共分離得到256種菌株，且篩選出102種產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的菌株.在其中挑選出14種β-葡萄糖苷酶高產(chǎn)菌株(編號為YS1-YS14)進行人參莖葉總皂苷和人參提取物的微生物轉化實驗.

2.2 人參莖葉總皂苷和人參提取物中人參皂苷的含量分析

用HPLC分析人參莖葉總皂苷水溶液10 g/L，其主要成分及含量見表2.人參提取物中人參皂苷的含量見表3.由表3可知，鮮參和干參提取物中均含有較高含量的Rb1、Rb2和Rd，且干參中人參皂苷的含量比鮮參高.

表2 人參莖葉總皂苷中人參皂苷含量 μg/mL

表3 人參提取物中人參皂苷含量 μg/mL

2.3 人參莖葉總皂苷的微生物轉化

在14種高產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的菌株中，YS2、YS12、YS13和YS14菌株對人參莖葉總皂苷具有較好的轉化作用，其中菌株YS2的轉化效果最好.利用菌株YS2發(fā)酵人參莖葉總皂苷的產(chǎn)物為稀有人參皂苷Rg3 (圖1)，并且發(fā)酵2 d后Rg3的產(chǎn)率達到最高值(見表4).利用MALDI-TOF-MS進一步確定發(fā)酵產(chǎn)物Rg3 (分子量785.02)，在負離子模式下，分子離子峰([M+35Cl]-=818.1)與同位素峰([M+37Cl]-=820.1)的峰高比值為3∶1，由此可知產(chǎn)物的分子量與Rg3吻合(見圖2).

圖1 菌株YS2發(fā)酵人參莖葉總皂苷的HPLC譜圖:(A)為發(fā)酵前；(B)為發(fā)酵2 d后

表4 YS2對人參莖葉總皂苷的轉化 μg/mL

圖2 發(fā)酵產(chǎn)物的MALDI-TOF-MS譜圖

2.4 人參提取物的微生物轉化

本文對人參發(fā)酵采取了直接發(fā)酵和酸處理后發(fā)酵的兩種方法.發(fā)酵前的人參提取物中主要含有人參皂苷Rb1、Rb2和Rd，未含有稀有人參皂苷Rg3和Rh2 (見表3).菌株YS2、YS5、YS7和YS8均能將人參中的Rb1、Rb2、Rd轉化為稀有人參皂苷Rg3，其中菌株YS2的轉化率最高，并且菌株YS2、YS7和YS8對酸處理后的人參顯示出更高的轉化率(見表5).

表5 人參發(fā)酵物中稀有人參皂苷的含量

2.5 人參發(fā)酵物對結腸癌colon26-M3.1細胞的抑制作用

IC50值可以用來衡量藥物誘導凋亡的能力，即誘導能力越強，該數(shù)值越低.菌株YS2、YS5、YS7和YS8的人參發(fā)酵物對結腸癌colon26-M3.1細胞均有較強的抑制作用，其IC50值如表6所示.從表6中可以看出：菌株YS2和YS7的人參發(fā)酵物(酸處理后發(fā)酵)對結腸癌colon26-M3.1細胞的IC50值分別為180 μg/mL和170 μg/mL，具有很強的抑制活性(文獻值為730 μg/mL)[13]；其次是菌株YS8的人參發(fā)酵物(IC50值為220 μg/mL)；其余發(fā)酵產(chǎn)物的抑制作用相對弱一些.分析表明，人參發(fā)酵物對結腸癌colon26-M3.1細胞的抑制活性直接與人參發(fā)酵物中稀有人參皂苷Rg3的含量有關.

表6 人參發(fā)酵物對結腸癌colon26-M3.1細胞的抑制濃度(IC50) μg/mL

2.6 菌株YS2的形態(tài)學觀察及其ITS測序鑒定

菌株YS2在PDA培養(yǎng)基上生長旺盛，呈絲狀、白色(見圖3).菌絲細長，分隔，分枝，淡色；分生孢子梗由菌絲頂端生成或從菌絲側壁產(chǎn)生，直立，不分枝(見圖4).

圖3 YS2菌PDA培養(yǎng)基上的菌落

圖4 YS2菌的分生孢子

菌株YS2的ITS序列如下：

>YS2_NLB4_1

CTCCTGGTCGTCTGGGATAAAGCATGCAATTATGCTTTCAACGAGGATGCCTAGTAAGCGCGTGTCATCAGCATGGTTTGATTACGTCCCTGACCTTTGTACACACCGCCCGTCGCTACTACCGATTGAATGGCTCAGTGAGGCCTTCGGCTGCTCGAGGAGGTTGGCAAGACCACCTCAAGCCGGAAAGTTCGTCAAACTCGGTCATTTAGAGGAAGTAAAAGTCGTAACAAGGTCTCCGTAGGTGAACCTGCGGAGGGATCATTACACAAATATGAAGGCGGGCTGGAACCTCTCGGGGTTACAGCCTTGCTGAATTATTCACCCTTGTCTTTTGCGTACTTCTTGTTTCCTTGGTGGGTTCGCCCACCACTAGGACAAACATAAACCTTTTGTAATTGCAATCAGCGTCAGTAACAAATTAATAATTACAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAGTGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCTTTGGTATTCCAAAGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTGTACCCTCAAGCTTTGCTTGGTGTTGGGCGTCTTGTCTCTAGCTTTGCTGGAGACTCGCCTTAAAGTAATTGGCAGCCGGCCTACTGGTTTCGGAGCGCAGCACAAGTCGCACTCTCTATCAGCAAAGGTCTAGCATCCATTAAGCCTTTTTTTCAACTTTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGAAAAGAAACCAACAGGGATTGCCCTAGTAACGGCGAGGAAGCTTCTTTTTTTTCGAATTTGAAA.

菌株YS2的ITS序列測定和系統(tǒng)發(fā)育分析結果表明(圖5)，該菌株歸屬于鏈格孢屬(Alternaria).

圖5 菌株YS2的無根系統(tǒng)發(fā)育樹

3 結論

本文利用β-葡萄糖苷酶高產(chǎn)菌株將人參莖葉總皂苷和人參提取物中的人參皂苷轉化為稀有人參皂苷Rg3，研究表明，經(jīng)酸處理后的人參顯示出更高的轉化率.菌株YS2和YS7的人參發(fā)酵物對結腸癌colon26-M3.1細胞具有很強的抑制作用，其IC50值分別為180 μg/mL和170 μg/mL.經(jīng)形態(tài)學觀察和ITS序列分析，確定菌株YS2為鏈格孢屬(Alternaria).本研究對利用微生物轉化法提高人參的生物活性和制備抗腫瘤稀有人參皂苷均具有一定的意義.

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