鄒金艷 商建 易三鳳 伍威 林軍

Wnt/β-catenin信號通路直接影響胰腺癌細胞的增殖、分化和遷移。研究發(fā)現，在許多腫瘤組織中Wnt/β-catenin信號通路異常激活[1-4]。β-catenin在胰腺上皮內瘤變(pancreatic intraepithelial neoplasia, PanIN)及胰腺癌蛋白的核內高度積聚[5]。文獻報道[6]，非甾體抗炎藥(non-steroidal anti-inflammatory drugs, NASIDs)能抑制結腸癌組織中Wnt/β-catenin信號通路，抑制β-catenin的核聚集及β-catenin/TCF靶基因的轉錄。但NASIDs對胰腺癌的作用目前少有研究。本研究應用NASIDs的舒林酸處理人胰腺癌細胞PANC1，觀察其對PANC1細胞增殖、凋亡及Wnt信號通路成員β-catenin表達的影響。

一、材料和方法

1．細胞增殖測定：人胰腺癌細胞PANC1購于中國科學院典型培養(yǎng)物委員會細胞庫(上海)，常規(guī)培養(yǎng)、傳代。取對數生長期細胞接種于96孔板，應用0.25、0.5、1.0、1.5、2.0 mmol/L的舒林酸(美國Enzo公司)分別處理PANC1細胞24、48、72 h，以不加舒林酸的細胞作為對照組。應用MTT法檢測細胞的增殖，按MTT試劑盒(江蘇碧云天生物科技有限公司)說明書操作。最后上酶標儀測各孔在波長490 nm處的吸光度值(A490值)。生長抑制率=實驗組A490值/對照組A490值×100%。

2．細胞凋亡測定：取不同濃度舒林酸處理48 h的PANC1細胞，常規(guī)消化制備細胞懸液，按照Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒說明書操作。染色完成后1 h內上流式細胞儀檢測。

3．β-catenin mRNA表達檢測：利用Primer Express1.5軟件設計β-catenin引物，序列為5′-GTGCTATCTGTCTGCTCTAGTA-3′及5′-CTTCCTGTTTAGTTGCAGCATC-3′；內參GAPDH引物序列為5′-GAAGGTGAAGGTCGGAAGT-3′及5′-GGAAGATGGTGATGGGATT-3′。 引物由上海生工合成。取不同濃度舒林酸處理24 h的PANC1細胞以及2 mmol/L舒林酸處理12、24、48、72 h的PANC1細胞，采用Trizol(美國Invitrogen公司)提取細胞總RNA，采用RT-PCR法檢測β-catenin mRNA表達。先逆轉錄成cDNA。PCR條件：94℃ 5 min，94℃ 45 s、58℃ 30 s、72℃ 45 s，35個循環(huán)，最后72℃ 10 min。PCR產物在1%瓊脂糖凝膠電泳分離后掃描，以目的條帶與內參條帶灰度比值表示mRNA表達量。

4．β-catenin蛋白表達檢測：取不同濃度舒林酸處理24、48 h的PANC1細胞，制作細胞爬片，采用免疫組化SP法檢測β-catenin蛋白。兔抗人β-catenin多抗購自Santa Cruz公司，生物素化羊抗兔IgG購自武漢天興生物科技有限公司，免疫組化試劑盒及DAB顯色試劑盒購自武漢天興生物科技有限公司。在400倍顯微鏡下閱片，按“米”字形隨機選擇5個視野，計算每個視野內胞質和胞核呈棕黃色的陽性腫瘤細胞，根據陽性細胞占總細胞數的百分數及染色強度進行半定量。無陽性細胞計0分，陽性細胞1%～30%計1分，31%～70%計2分，71%～100%計3分；根據著色強度依次計0、1、2、3分，兩分相加，0分為陰性(-)，1～2分為弱陽性(+)，3～4分為陽性(++)，5～6分為強陽性(+++)[7]。

二、結果

1．舒林酸對PANC1細胞增殖的影響：應用0.5、1.0、1.5、2.0 mmol/L舒林酸處理后，PANC1細胞生長均受到不同程度抑制，與陰性對照組相比，差異均具有統(tǒng)計學意義(F值分別為80.755、91.701、134.087，P值均<0.05)，但1.5和2.0 mmol/L舒林酸處理48、72 h時的抑制率差異無統(tǒng)計學意義(P值分別為0.348、0.843)，其余各組間差異有統(tǒng)計學意義(P值均<0.05，表1、圖1)。

表1 舒林酸作用PANC1細胞后A490均值及抑制率

圖1 不同濃度舒林酸處理后PANC1細胞的生長曲線

2．舒林酸對PANC1細胞凋亡的影響：應用0.5、1.0、1.5、2.0 mmol/L舒林酸處理PANC1細胞48 h后，細胞早期凋亡率分別為(6.6±0.7)%、(9.3±1.4)%、(23.7±1.2)%、(29.4±0.9)%，隨舒林酸濃度增加，凋亡率亦隨之增加，其中0.5、1.0 mmol/L處理組與對照組的(6.5±0.3)%相比，差異無統(tǒng)計學意義(P值分別為0.792、0.288)，1.5、2.0 mmol/L組與對照組相比，差異有統(tǒng)計學意義(F值分別為189.432、164.400，P值均<0.05，圖2)。

圖2 對照組(a)及0.5、1.0、1.5、2.0 mmol/L舒林酸(b、c、d、e)處理48 h后PANC1細胞的凋亡

3．舒林酸對細胞β-catenin mRNA及蛋白表達的影響：PANC1細胞β-catenin mRNA表達量隨著舒林酸濃度的增加而下調，對照組及0.5、1.0、1.5、2.0 mmol/L組的β-catenin mRNA表達量分別為1.00±0.03、0.96±0.03、0.92±0.04、0.52±0.09、0.35±0.09，0.5、1.0 mmol/L組與對照組的差異無統(tǒng)計學意義(P值分別為0.322、0.074)，而1.5、2.0 mmol/L組與對照組的差異具有統(tǒng)計學意義(P值均<0.05)。2.0 mmol/L舒林酸處理PANC1細胞12、24、48、72 h，細胞β-catenin mRNA表達量分別為0.44±0.02、0.30±0.05、0.16±0.01、0.16±0.04，隨著處理時間延長而逐漸降低，均較對照組的0.60±0.02下調，差異有統(tǒng)計學意義(F=192.408，P<0.05，圖3)。

細胞的β-catenin蛋白表達亦隨著舒林酸濃度的增加逐漸降低，其中0.25、0.5 mmol/L處理組與對照組間的差異無統(tǒng)計學意義(P值分別為0.472、0.586)，而1.0、1.5、2.0 mmol/L處理組與對照組間的差異均有統(tǒng)計學意義(P值均<0.05，表2，圖4)。

圖3 0、0.5、1.0、1.5、2.0 mmol/L舒林酸(1、2、3、4、5)處理24 h后(a)及2.0 mmol/L舒林酸處理0、12、24、48、72 h(1、2、3、4、5)后(b)細胞β-Catenin mRNA的表達

表2 不同濃度舒林酸對人胰腺癌PANC1細胞β-catenin表達影響

圖4 對照組(a)及0.25、0.5、1.0、1.5、2.0 mmol/L舒林酸(b～f)處理24 h后細胞β-catenin蛋白的表達(免疫組化 ×400)

討論NSAIDs是常用的解熱鎮(zhèn)痛消炎藥物，近年來研究證明NSAIDs還能對腫瘤有化學預防的作用，尤其是在結、直腸癌預防方面。Peter等對17 285名需要口服阿司匹林預防心血管疾病的患者平均隨訪6.5年，結果發(fā)現阿司匹林能降低腫瘤的遠處轉移，尤其是結直腸腺瘤的遠處轉移[8]。Stein等[9]應用舒林酸處理不同結腸癌細胞系，結果能降低細胞β-catenin的表達及核聚集，在動物體內實驗中舒林酸能降低腫瘤的轉移，其機制與β-catenin及其下游轉錄激活基因S100A4表達減少有關。他們認為舒林酸通過調節(jié)β-catenin信號通路具有抗腫瘤細胞轉移的潛質。

本研究結果顯示，舒林酸呈濃度依賴及時間性抑制PANC1細胞的增殖，誘導細胞的凋亡。但在藥物處理48 h后的細胞增殖抑制效果不如48 h前明顯，可能與藥物消耗及細胞內β-catenin表達下降相關。RT-PCR及免疫細胞化學結果顯示，經舒林酸處理后PANC1細胞的β-catenin mRNA及蛋白表達均明顯下調，在1.5及2.0 mmol/L舒林酸處理后細胞基本不表達β-catenin蛋白，與舒林酸對肝癌細胞及結腸癌細胞的影響相似。

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