蔣紹妍,王文星,薛向欣*(.東北大學材料與冶金學院,遼寧 沈陽 089；.東北大學生命科學與健康學院,遼寧 沈陽 089)

撫順盆地西露天組油頁巖微生物碳代謝多樣性分析

蔣紹妍1,王文星2,薛向欣1*(1.東北大學材料與冶金學院,遼寧 沈陽 110819；2.東北大學生命科學與健康學院,遼寧 沈陽 110819)

為探討油頁巖微生物的碳代謝功能多樣性,以撫順盆地西露天組油頁巖為研究對象,利用Biolog-GN2和GP2微孔板檢測法,在連續(xù)7d的培養(yǎng)期內(nèi),測定油頁巖本源微生物群落水平生理圖譜(CLPP),并根據(jù)化學基團的不同,分析微生物對不同類型碳源的代謝能力和代謝差異.結(jié)果顯示,微生物對不同類型碳源的代謝程度和代謝速率存在明顯的差異.革蘭氏陰性和陽性細菌群落均對氨基類碳源的利用較好,其次是羧酸類以及糖和糖衍生物,而對磷酸糖利用較差.連續(xù)多點測算Shannon-Wiener,Simpson和McIntosh多樣性指數(shù),分析表明微生物群落碳代謝功能多樣性總體較高,但是隨著培養(yǎng)時間的增加,多樣性略有降低.

油頁巖；功能多樣性；Biolog；碳代謝；多樣性指數(shù)

油頁巖是一種富含有機質(zhì)、具有微細層理、可以燃燒的細粒沉積巖.我國已探明的油頁巖總儲量為 329.89億 t,居世界第四位[1].微生物是重要的生物資源和基因資源[2].早在 1926年, Beckman[3]就提出了細菌采油的設(shè)想;1947年, Zobell[4]獲得第一項微生物采油專利.微生物浸溶采礦的研究始于1947年,美國Colmer等[5]從礦山酸性礦水中分離鑒定出氧化亞鐵硫桿菌并證實了其在浸出礦石中的生物化學作用;1959年,中國學者分別從不同礦山酸性礦水中分離得到了氧化亞鐵硫桿菌和氧化硫硫桿菌等嗜酸細菌[6];迄今已經(jīng)有20多個國家的學者展開了微生物在貧礦、廢礦、表外礦及難采礦、難選礦、難冶礦的堆浸和就地浸出研究[7-11],浸出方式逐步也由池(槽)浸、地表堆浸擴展到了地下就地破碎浸出,并有向地下原地鉆孔浸出發(fā)展的趨勢.將微生物浸礦技術(shù)應(yīng)用于油頁巖的研究始于 1974年,Findley等[12]開展了利用氧化亞鐵硫桿菌發(fā)酵液對美國綠河地區(qū)油頁巖進行了連續(xù)浸礦研究,在14d的持續(xù)浸溶過程中,占油頁巖總量約40%的礦物組分和幾乎所有的 CaMg(CO3)2被去除.微生物轉(zhuǎn)化技術(shù)在油頁巖領(lǐng)域的研究目前仍屬于起步階段,相關(guān)報道不多[13-14],對油頁巖本源微生物代謝多樣性的研究是促進微生物轉(zhuǎn)化技術(shù)在該領(lǐng)域發(fā)展的重要前提.

特定的生態(tài)環(huán)境決定相應(yīng)的微生物群落結(jié)構(gòu),反之,微生物群落結(jié)構(gòu)又會影響微生物生存的環(huán)境.沉積巖有許多特殊性質(zhì)對微生物的生長代謝不利,而本源微生物的代謝功能在長期進化中逐漸與油頁巖環(huán)境相適應(yīng),從而有能力代謝具有多種官能團、含有多種化學鍵的古代有機質(zhì).目前僅有關(guān)于微生物對黑頁巖[15-17]、原油[18]和天然瀝青[19]碳代謝的相關(guān)報道.本研究選擇撫順盆地西露天組油頁巖作為研究對象,利用 Biolog-GN2、GP2微孔板技術(shù)分別測定油頁巖中微生物群落水平的革蘭氏陰性細菌和革蘭氏陽性細菌對不同化學基團碳源的利用能力及代謝差異,進而表征微生物的碳代謝功能多樣性,力求反應(yīng) Biolog模板與細菌反應(yīng)模式的相關(guān)性[20-21],這在油頁巖相關(guān)研究中尚屬首次.對油頁巖微生物的群落功能進行了解和測定在現(xiàn)階段研究中可能比對油頁巖微生物的個體功能進行研究更加具有直接的意義,而 Biolog方法正是基于這種群落碳源代謝水平來進行多樣性研究的.

1 材料與方法

1.1 供試樣品

表1 樣品的含水量、酸堿度、總DNA含量和活菌數(shù)量(平均值±標準偏差,n=3)Table 1 Water content, pH value, total DNA content and the number of living microbes (values are means ± S.D., n = 3)

油頁巖于 2011年 6月采自撫順西露天礦(123°57′E,41°50′N,海拔75.9m).礦區(qū)為溫帶大陸性季風氣候,年平均氣溫 5～7 ,℃年平均降雨量 750～850mm.撫順盆地為半咸水湖拗陷沉積形成,有機質(zhì)來源以水生生物為主、陸源供給少,基底為下白堊統(tǒng)砂礫巖,油頁巖賦存于古城子組、計軍屯組和西露天組.古城子組主要由煤層組成,夾炭質(zhì)頁巖、油頁巖及砂巖等;計軍屯組主要由一套內(nèi)陸湖相沉積的淺褐、暗褐色薄層狀油頁巖組成,含豐富的動植物化石,該巖段位于煤層頂部;西露天組油頁巖由一套巨厚的綠色泥巖夾泥灰?guī)r層組成,由于互層頻繁,顏色為雜色及綠色.采樣時去除表面沉積巖后,按五點法徒手(佩戴無菌手套)采集西露天組褐色油頁巖細粒,并且避開聚集在局部的黑色頁巖,錘子就地粉碎油頁巖并充分混勻后過4mm篩子,四分法取適量放于50mL無菌離心管,與冰袋一起裝入保溫盒帶回實驗室4℃保存.所有工具均經(jīng)高壓蒸汽滅菌后烘干.3個重復取樣地間隔約 500m.樣品經(jīng)東北大學分析測試中心測定灰分80.95%,揮發(fā)分16.57%,燒失量19.05%,水不溶物97.46%,含油率11.47%;X-Ray Diffraction分析主要為高嶺石、菱鐵礦和石英,X-Ray Fluorescence元素分析 SiO2為 43.90%,CO2為28.41%,Al2O3為 17.08%,Fe2O3為 5.36%,K2O為1.26%.樣品含水量、酸堿度、微生物總 DNA含量和活菌數(shù)量列于表1.

1.2 微生物碳代謝多樣性

使用Biolog Microplate(GN2、GP2)測算微生物群落的碳代謝功能多樣性,經(jīng)梯度實驗確定稀釋液濃度為 10-2,使用八道移液器向微孔板的每個微孔移入150μL稀釋液,37℃避光培養(yǎng)7d,每隔12h使用酶標儀(BioTek μQuant)測定590nm吸光度.微生物種群整體活性采用微孔板每孔顏色平均變化率(AWCD)來描述,它可以評判微生物群落對碳源利用的總能力,AWCD=[∑(Ci-R)]/n,式中:Ci為第i孔吸光值;R為對照孔吸光值;n為微孔板孔數(shù) 95.采用生態(tài)學 3個 α多樣性指數(shù)Shannon-Wiener、Simpson和McIntosh指數(shù),從不同側(cè)面反映微生物群落功能多樣性, Shannon-Wiener指數(shù)H’=-∑Pi(lnPi),式中Pi為第i孔相對吸光值與整個微孔板相對吸光值總和的比率,即 Pi=(Ci-R)／∑(Ci-R);Simpson指數(shù)D=1-λ,式中 λ=∑Pi2;McIntosh指數(shù) DM=(N-U)/ (N-N1/2),式中N=∑(Ci-R),U=[∑(Ci-R)2]1/2.

2 結(jié)果與分析

2.1 革蘭氏陰性細菌利用 GN2微孔板碳源的動力學分析

圖1 油頁巖微生物利用Biolog GN2微孔板碳源的平均每孔顏色變化率(AWCD)曲線Fig.1 Average well color development (AWCD) for carbon sources of GN2 microplates Utilized by oil shale microbes

GN2微孔板的95種碳源按化學基團分為10類:糖和糖的衍生物28種,聚合物5種,甲酯2種,羧酸25種,酰胺類3種,氨基酸21種,核苷類3種,胺類2種,醇類3種,磷酸糖類3種.革蘭氏陰性細菌對不同類型碳源的利用速率和程度不同(圖1).甲酯類、羧酸類、核苷類、氨基酸以及酰胺類、胺類碳源均有明顯的快速被利用階段,分別在24～48,12～48,24～48,12～48,24～72,24～72,前四者被快速利用時間較短,均在培養(yǎng)48h前;后兩者被快速利用時間較長,均在72h前.除這6類碳源外,其他碳源沒有明顯被快速利用階段:糖和糖的衍生物在培養(yǎng)的180h內(nèi)始終被較快利用;而聚合物類在72～96h時出現(xiàn)了停滯階段,這可能與微生物群落結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生了一定改變、使微生物對碳源的代謝產(chǎn)生選擇性變異或轉(zhuǎn)移有關(guān);磷酸糖類在108h前被快速利用,醇類則是在168h前.培養(yǎng)24h前,胺類被較好利用,24～120h期間氨基酸被較好利用,120h后,糖和糖的衍生物被較好利用;然而,磷酸糖類 AWCD卻始終較低,說明樣品中微生物對帶有不同化學基團的糖類的利用存在差異.此外,微生物對醇類和聚合物的利用程度也較低.

2.2 革蘭氏陽性細菌利用GP2微孔板碳源的動力學分析

GP2微孔板的95種碳源分為10類:糖和糖的衍生物44種,聚合物8種,甲酯1種,羧酸16種,酰胺類2種,氨基酸9種,核苷類8種,胺類1種,醇類2種,磷酸糖類4種.聚合物、羧酸類、醇類、酰胺類、氨基酸、胺類和核苷類碳源均有明顯的快速被利用階段,分別在24 ～ 60h,12 ～96h,12 ～ 60h,24 ～ 72h,12 ～ 60h,24 ～ 60h和24 ～96h;糖和糖的衍生物在 24h后始終被較快速利用,磷酸糖類和甲酯類碳源沒有明顯被快速利用階段;羧酸類和核苷類在96h后、醇類和氨基酸在60h后,它們的AWCD增長較慢,胺類則在60h后基本停滯;聚合物類在60h后被利用速度逐漸變緩,96h后基本停滯;酰胺類在72 ～ 120h期間停滯,72h后又小幅上升(圖2).培養(yǎng)12h后,氨基酸、酰胺類和胺類被利用程度明顯高于其他碳源,且氨基酸 > 酰胺類 > 胺類;其次為羧酸類及糖和糖的衍生物,在24 ～ 132h期間,羧酸類大于糖和糖的衍生物,而132h后,后者被利用程度略大;核苷酸、醇類和聚合物被利用程度較低,72h前,聚合物 > 醇類 > 核苷類,而96h后,核苷類被利用程度最高,120h后,醇類被利用程度超過聚合物.對于磷酸糖類和甲酯類,在 108h前,二者被利用程度較低,在132h后,二者超過核苷類、醇類和聚合物.

革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細菌群落均對氨基酸、酰胺類和胺類碳源利用較好.氨基酸、酰胺類和胺都是氨基化合物,是氨分子中去掉一個氫原子的有機物,某種程度上具有類似的化學性質(zhì).微生物群落對羧酸類以及糖和糖的衍生物同樣能夠較好的利用,且對糖和糖的衍生物的利用從 24h后幾乎保持著同一斜率上升,其滯后期較短,且在連續(xù)培養(yǎng)期內(nèi)沒有出現(xiàn)利用速率減慢的趨勢,說明微生物對糖類的利用是持續(xù)升高的,與對磷酸糖的利用結(jié)果對比來看,微生物對不同種類糖的利用存在差異.

2.3 微生物碳代謝多樣性分析

表2 在不同時間下微生物碳源代謝的多樣性指數(shù)Table 2 Diversity indexes of microbial metabolism for carbon sources under different time

從表2可以看出,GN2和GP2微孔板的DM指數(shù)值在培養(yǎng)期前 36h逐漸降低,36h后基本不變;H’和D指數(shù)值則在整個培養(yǎng)期內(nèi)變化很小.DM指數(shù)略有降低的原因可能是隨著培養(yǎng)時間的增加,微生物代謝碳源的種類略有減少,氨基化合物和糖類代謝菌可能逐漸成為群落的優(yōu)勢菌.而從整個培養(yǎng)期內(nèi)各多樣性指數(shù)的數(shù)值來看,微生物碳代謝功能多樣性在培養(yǎng)期間內(nèi)雖存在顯著變化但變化幅度較小,多樣性總體較好,這意味著這些土著菌利用碳源的途徑較多,但細菌、真菌和放線菌數(shù)量及微生物總DNA含量卻較少(表1),這可能與油頁巖本身性質(zhì)有關(guān),油頁巖中水分低、養(yǎng)分低、雜質(zhì)多,無機礦物質(zhì)含量高于有機質(zhì)含量,且有機質(zhì)主要由復雜三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的干酪根構(gòu)成,這些均不利于微生物的生長繁殖,導致該生境的微生物數(shù)量極低.在養(yǎng)分貧瘠的生態(tài)環(huán)境中,微生物的數(shù)量少但代謝多樣性并不一定低,這一發(fā)現(xiàn)與曹成有等[22]對流動沙丘的研究結(jié)果一致,養(yǎng)分的貧瘠主要限制微生物的生長和繁殖,對有限資源的競爭,有可能會使少數(shù)微生物成為優(yōu)勢種.

3 結(jié)語

通過對油頁巖本源微生物碳代謝多樣性的深入了解,為后續(xù)開展微生物的分離培養(yǎng)提供一定的理論依據(jù),也為進一步挖掘本源微生物在浸溶轉(zhuǎn)化油頁巖方面的利用潛力提供一條新的研究思路.在群落水平,革蘭氏陰性細菌對氨基酸、胺類和酰胺類利用較好,對糖和糖的衍生物、甲酯類和羧酸類其次,對醇類、聚合物類和磷酸糖類較差;甲酯類、羧酸類、核苷類、氨基酸在12 ～48h、酰胺類和胺類在24～72h被利用效率較高.革蘭氏陽性細菌對氨基酸、酰胺類和胺類利用較好,對羧酸類及糖和糖的衍生物其次,108h前,對磷酸糖類和甲酯類利用較差,而 132h后,對核苷類、醇類和聚合物類利用較差;聚合物、醇類、氨基酸和胺類在24～60h、羧酸類和核苷類在24～96h、酰胺類在 24～72h、糖和糖的衍生物在24～48h被利用效率最高.連續(xù)多點監(jiān)測計算多樣性指數(shù)H’、D和DM,其數(shù)值顯示微生物群落碳代謝功能多樣性總體較好;其動態(tài)變化特征說明隨著培養(yǎng)時間的增加,微生物群落碳代謝功能多樣性略有降低.由于微生物群落產(chǎn)生對某些碳源利用的較強烈偏好,因此在實際培養(yǎng)和生產(chǎn)過程中,需要通過外部添加營養(yǎng)源來促進油頁巖中本源微生物的生長代謝時,應(yīng)根據(jù)需要,合理搭配供給的碳源種類,特別是氨基化合物和糖類應(yīng)作為基本成分,并綜合考慮微生物對各碳源的代謝需要和代謝效率來確定較為經(jīng)濟高效的培養(yǎng)基和培養(yǎng)時間.

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Carbon-source metabolic diversity of oil shale microorganisms in Fushun Basin Western Open Group

JIANG Shao-yan1, WANG Wen-xing2, XUE Xiang-xin1*(1.School of Materials and Metallurgy, Northeastern University, Shenyang 110819, China；2.College of Life and Health Sciences, Northeastern University, Shenyang 110819, China). China Environmental Science, 2014,34(9)：2321～2327

Functional diversity of carbon-source metabolism of oil shale microorganisms in Fushun Basin Western Open Group was investigated by Biolog-GN2 and GP2 microplates method. The microbial community level physiological profiles (CLPP) were determined during 7 consecutive days. According to different chemical groups, the metabolic capacity and differences of microbial communities on different carbon sources were analyzed. The results showed that the metabolic level and metabolic rate of microbial communities on different carbon sources were obviously different. For the Gram-negative or Gram-positive bacteria communities, the utilization of carbon sources with amino group was the highest, followed by carboxylic acid, sugar and its derivatives, and sugar phosphates was the lowest. The analyses of Shannon-Wiener, Simpson and McIntosh indexes through multi-point calculation indicated that the carbon metabolic diversity of microbial communities in oil shale was generally high, but the diversity slightly decreased with incubation time.

oil shale；functional diversity；Biolog；carbon metabolism；diversity index

X172

A

1000-6923-(2014)09-2321-07

蔣紹妍(1985-),女,遼寧沈陽人,東北大學材料與冶金學院博士研究生,主要從事油頁巖微生物多樣性及油頁巖微生物轉(zhuǎn)化研究.發(fā)表論文6篇.

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2013-11-23

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* 責任作者, 教授, xuexx@mail.neu.edu.cn

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