宋 力,蔣桂芳,黃民生,李 強(qiáng)(.重慶市環(huán)境材料與修復(fù)技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,重慶 40260；2.華東師范大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院,上海 200062)

溫瑞塘河沉積物的生物毒性表征研究

宋 力1,2,蔣桂芳1*,黃民生2*,李 強(qiáng)1(1.重慶市環(huán)境材料與修復(fù)技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,重慶 402160；2.華東師范大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院,上海 200062)

利用淡水型發(fā)光細(xì)菌青海孤菌的一個(gè)變種 Q67和熱帶爪蟾胚胎對(duì)溫瑞塘河沉積物浸出液生物毒性檢測(cè)分析.沉積物相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度平均值為63.3%,屬中等生物毒性,最高發(fā)光強(qiáng)度為81.9%,最低發(fā)光強(qiáng)度為40.6%.沉積物浸出液的發(fā)育毒性結(jié)果為胚胎平均孵化率75.98%,最低點(diǎn)為42.5%,最高點(diǎn)為100%;胚胎成活率平均值為83.77%,最低值為66.25%,最高值為100%;平均致畸形率為16.6%,4個(gè)采樣點(diǎn)無(wú)致畸現(xiàn)象,最大致畸性率為36.3%;爪蟾的平均體長(zhǎng)為3.58cm,最小體長(zhǎng)2.64cm,最大體長(zhǎng)4.06cm.工業(yè)園區(qū)、城市生活與工廠混雜區(qū),河流交匯且易于沉積區(qū)域生物毒性大,在源頭區(qū)及單一生活污染區(qū)生物毒性小.

發(fā)光細(xì)菌；熱帶爪蟾胚胎；沉積物；生物毒性；溫瑞塘河

河流、湖泊沉積物是污染物的“源”與“匯”,污染物在風(fēng)浪或外力作用下再懸浮從而影響河流與湖泊的水質(zhì)[1].沉積物中有毒有害物質(zhì)的含量常被用作判斷河流湖泊水環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[2].生物毒性測(cè)試直接測(cè)定沉積物毒性大小,評(píng)價(jià)污染物在河道累積對(duì)水環(huán)境產(chǎn)生的生物毒性,是研究水體污染的一種重要手段[3].溫瑞塘河是典型的城市平原河網(wǎng),集景觀、運(yùn)輸、農(nóng)業(yè)灌溉、飲用水于一體,流域內(nèi)是溫州市人口與工業(yè)聚集區(qū),皮革及其制品、機(jī)械制造與五金、服裝與印染、塑料制品、電鍍等中小企業(yè)十分發(fā)達(dá).大量的污染物直接排入或隨地表徑流進(jìn)入到溫瑞塘河網(wǎng)水系之中,溫瑞塘河河網(wǎng)(2007～2011)的水質(zhì)監(jiān)測(cè)斷面多數(shù)處于劣Ⅴ類[4].目前對(duì)溫瑞塘河的研究主要是對(duì)沉積物重金屬污染及水體污染的評(píng)價(jià)[1],楊波[5],陳瑞瑞等[6]針對(duì)支流九山河、山下河進(jìn)行生物毒性的研究,而針對(duì)整個(gè)流域的生物毒性的研究未見(jiàn)報(bào)道.

發(fā)光細(xì)菌作為指示生物開(kāi)展生物毒性檢測(cè)分析,具有簡(jiǎn)便、快速、靈敏、廉價(jià)等優(yōu)點(diǎn),目前應(yīng)用廣泛[7-8].爪蟾胚胎致畸實(shí)驗(yàn)(Frog Embryo Teratogenesis Assay-Xenopus, FETAX)主要通過(guò)分析胚胎的孵化率、存活率、畸形率和生長(zhǎng)抑制等指標(biāo)表征樣品的毒性強(qiáng)弱[9-10].

為了揭示與深入分析溫瑞塘河流域沉積物受污染的生物毒性大小,利用淡水型發(fā)光細(xì)菌青?；【?Vibrio qinghaiensis sp.nov)的一個(gè)變種Q67和熱帶爪蟾(Xenopus tropicalis)胚胎進(jìn)行生物毒性檢測(cè)分析,以期為溫瑞塘河治理特別是是否清淤提供參考依據(jù).

1 樣品采集

采樣時(shí)間為 2011年 4月 22～27日,利用TATO天泰正合MM9手持GPS定位儀定位,在溫瑞塘河流域共設(shè)置29個(gè)采樣點(diǎn),采樣點(diǎn)見(jiàn)圖1.柱狀采樣器(可采深度≥50cm)采樣,并遵循河流采樣技術(shù)導(dǎo)則(HJ/T52-1999).

圖1 溫瑞塘河采樣點(diǎn)示意Fig.1 Sampling sites in Wenruitang River basin

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 測(cè)試生物

青?；【?Q67菌樣(vibrio qinghaiensis),熱帶爪蟾胚胎.

2.2 沉積物浸出液提取

2.2.1 發(fā)光細(xì)菌試驗(yàn) 按沉積物與超純水的質(zhì)量比1:3稀釋,常溫振蕩12h,靜置12h,取上清液作為沉積物浸出液進(jìn)行發(fā)光細(xì)菌測(cè)試[11].

2.2.2 熱帶爪蟾胚胎致畸試驗(yàn) 按沉積物與熱帶爪蟾養(yǎng)殖用水(自來(lái)水經(jīng)市售凈水器處理),按照1:4的體積比混合后裝入500mL的棕色瓶中,密封后置于振蕩機(jī)上振蕩 24h,震蕩機(jī)的條件控制設(shè)置為:100r/min,常溫.然后靜置24h,提取上清液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)[5,16].

2.3 利用胚胎進(jìn)行生物毒性實(shí)驗(yàn)

2.3.1 胚胎的獲取 挑選性成熟熱帶爪蟾8對(duì),人工注射絨毛膜促性腺激素(HCG)誘導(dǎo)產(chǎn)卵.每對(duì)爪蟾均注射2次HCG;挑選NF10～11階段且發(fā)育正常的胚胎進(jìn)行實(shí)驗(yàn).

2.3.2 胚胎生物毒性測(cè)試 采用24孔板的培養(yǎng)皿進(jìn)行胚胎培養(yǎng)實(shí)驗(yàn),以養(yǎng)殖用水為對(duì)照,實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組各設(shè)4個(gè)平行,每個(gè)平行樣選取10個(gè)挑選胚胎.胚胎暴露條件:多功能培養(yǎng)箱,25℃,24h更換1次培養(yǎng)暴露液,在24h后將未孵化的胚胎挑出,并記錄胚胎孵化數(shù),在48h后統(tǒng)計(jì)孵化后胚胎存活數(shù)與死亡數(shù).將存活胚胎用 100mg/L MS-222麻醉液處理并固定于4%的甲醛溶液中.取固定在甲醛溶液的胚胎,在 Nikon解剖鏡下觀察胚胎的生長(zhǎng)發(fā)育狀況,采用NikonDS-SM型顯微鏡拍攝系統(tǒng)進(jìn)行拍照.

2.3.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) 孵化率為 24h后孵化胚胎個(gè)數(shù)的百分比;存活率為48h后存活胚胎個(gè)數(shù)的百分比;體長(zhǎng):胚胎頭部至尾尖的水平距離;畸形率:48h后胚胎畸形個(gè)體數(shù)占總存活個(gè)體數(shù)的百分比.本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS16.0和origin8.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析.

2.4 利用發(fā)光細(xì)菌測(cè)試實(shí)驗(yàn)方法

1) 取菌種凍干粉加入質(zhì)量濃度為 3%生理鹽水10mL中,充分搖勻后,放置在20℃下30min左右進(jìn)行細(xì)菌復(fù)蘇制備菌液;取 2mL測(cè)試液,依次加入 20μL菌液至測(cè)試管中,充分混勻,每隔15min左右,用BHP9511型水質(zhì)毒性分析儀測(cè)定其相對(duì)發(fā)光率,并以2mL的3%生理鹽水作為空白對(duì)照組,每個(gè)測(cè)試樣設(shè)置3組平行樣.

2) 采用 EC50法對(duì)所得的生物毒性的數(shù)據(jù)進(jìn)行有效分析評(píng)價(jià).用直線內(nèi)插法求出相對(duì)發(fā)光率為50%時(shí)所對(duì)應(yīng)的待測(cè)水樣中ZnCl2的濃度,利用 ZnCl2的濃度來(lái)評(píng)價(jià)各待測(cè)水樣的毒性大小.Y=-16.056χ+96.068,其中 R2=0.9716,相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度計(jì)算如式(1).

從圖4可以看出,隨著通信半徑的增加,網(wǎng)絡(luò)連通性提高,所以各算法的平均定位誤差均降低,本文定位算法平均定位誤差始終保持最小,優(yōu)于其他算法?？梢钥闯鲈谙嗤亩ㄎ徽`差下,本文算法所需要的通信半徑最小,通信半徑越小,能耗越小,在同等條件下,本文算法可以節(jié)約能耗,延長(zhǎng)網(wǎng)絡(luò)壽命,降低網(wǎng)絡(luò)維護(hù)成本。

式中:I為相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度;L1為正常發(fā)光強(qiáng)度;L2為與毒物作用后的發(fā)光強(qiáng)度.

其中毒性評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表1.

表1 毒性評(píng)價(jià)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[11]Table 1 rating standard of toxicity[11]

3 結(jié)果與討論

3.1 發(fā)光細(xì)菌測(cè)試沉積物的生物毒性分析

由圖 2可知,溫瑞塘河沉積物相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度的平均值 63.3%,最高發(fā)光強(qiáng)度為 81.9%,最低發(fā)光強(qiáng)度為 40.6%,其生態(tài)毒性評(píng)價(jià)中處于較大毒性的點(diǎn)有4個(gè)點(diǎn),分別是1#、2#、7#、8#點(diǎn)這些點(diǎn)處于機(jī)械工業(yè)園區(qū),與城市河道交匯區(qū). 22#,23#,24#處于輕微毒性,位于溫瑞塘河源頭區(qū),受工業(yè)生產(chǎn)和生活污染相對(duì)較小,其余22個(gè)樣點(diǎn)處于中等生物毒性等級(jí),由于溫瑞塘河屬于典型的平原城市河網(wǎng),水流相對(duì)較緩慢,污染物易于沉積,同時(shí)受到工業(yè)生產(chǎn)和城市生活污染的雙重影響現(xiàn)象明顯,污染物的組成成分復(fù)雜,再加上曾經(jīng)的管理落后等歷史原因,導(dǎo)致其沉積物的污染較重,特別是重金屬的影響,劉贊[12],雷炳莉[13]的相關(guān)研究也證實(shí)沉積物受污染的污染物組成越復(fù)雜其生物毒性也越強(qiáng). Ho等[14]的研究結(jié)果顯示,沉積物產(chǎn)生生物毒性主要受到氨氮、有機(jī)物和重金屬 3類物質(zhì)的影響,產(chǎn)生生物毒性的比例為有機(jī)物占8%,有機(jī)物+氨氮+重金屬占8%,有機(jī)物+氨氮占 23%,有機(jī)物+重金屬占 8%,氨氮+重金屬占15%,重金屬占15%.董小蓉等[15]研究指出水中微量有機(jī)污染物能對(duì)生物形成致畸變,產(chǎn)生生物毒性.王子健等[16]指出沉積物生物毒性大小受污染物質(zhì)影響種類有待進(jìn)一步細(xì)化,實(shí)驗(yàn)用測(cè)試生物根據(jù)其敏感性對(duì)受試物質(zhì)也有待進(jìn)一步研究.

圖2 沉積物生物毒性分析與評(píng)價(jià)等級(jí)Fig.2 Sediment analysis and evaluation of biological toxicity

3.2 沉積物提取液對(duì)爪蟾胚胎孵化率的影響

由圖 3可知,沉積物提取液對(duì)爪蟾胚胎孵化產(chǎn)生影響,孵化率最低的點(diǎn)僅為 42.5%,孵化率最高點(diǎn)為100%,平均孵化率75.98%.根據(jù)單因子方差分析實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較,存在顯著性差異點(diǎn)21個(gè)點(diǎn),而其中在 2#點(diǎn),孵化率為 0,其結(jié)果占約75%的樣點(diǎn)對(duì)爪蟾胚胎的孵化產(chǎn)生影響.在熱帶爪蟾胚胎外側(cè)有保護(hù)膜組織,胚胎受精后保護(hù)膜組織會(huì)逐步分解,在本研究中可能存在保護(hù)膜對(duì)熱帶爪蟾胚胎孵化產(chǎn)生保護(hù)作用,胚胎的整體孵化率較高,部分點(diǎn)的孵化率達(dá)到 100%,但是在一些點(diǎn),沉積物提取液對(duì)兩棲類胚胎存在較強(qiáng)的發(fā)育毒性.1#、7#、8#、25#、26#、27#、28#點(diǎn)處在城市河道人口聚集區(qū)域,及河道交匯區(qū)與工業(yè)區(qū)域,其污染物來(lái)源相對(duì)復(fù)雜,生物毒性較大,導(dǎo)致胚胎的孵化率存在顯著性的差異.不具有顯著差異性的點(diǎn)11#、21#、22#、23#、24#、25#,均處于溫瑞塘河源頭區(qū),農(nóng)業(yè)區(qū)的孵化率高,與其污染物相對(duì)單一,主要受農(nóng)業(yè)與生活的污染,污染程度相對(duì)低.楊波[5]在對(duì)溫瑞塘河支流山下河、九山河沉積物及長(zhǎng)江口沉積物利用爪蟾胚胎的檢驗(yàn)與本研究有相似的結(jié)論,復(fù)雜的污染環(huán)境對(duì)胚胎孵化產(chǎn)生影響.

圖3 暴露于沉積物提取液48h后熱帶爪蟾胚胎的孵化率Fig.3 Effects of sediment extracts on hatching of embryos of amphibian (Xenopus tropicalis) after 48h of exposure Each vertical bar represents a mean of four replicates, and error bar represents standard deviation

3.3 對(duì)爪蟾胚胎成活率的影響

由圖 4可知,胚胎的成活率最低值 66.25%,成活率最高值為100%,平均值83.77%,單因素顯著性分析顯示 1#、7#、8#、27#、28#呈極顯著性差異,9#、18#、26#呈顯著性差異,其余各點(diǎn)成活率與對(duì)照組無(wú)明顯差異,沉積物提取液對(duì)成活率影響不明顯,可能存在實(shí)驗(yàn)中對(duì)胚胎是否孵化認(rèn)定,對(duì)孵化不明顯的胚胎去除,優(yōu)質(zhì)爪蟾胚胎孵化后對(duì)毒性的耐受性提高,成活可能性增大.

圖4 暴露于沉積物提取液48h后熱帶爪蟾胚胎的成活率Fig.4 Effects of sediment extracts on survival of amphibian (Xenopus tropicalis) embryos after 48h of exposure

圖5 暴露于沉積物提取液48h后熱帶爪蟾胚胎的畸形率Fig.5 Teratogenic effects of sediment extracts on embryos of amphibian (Xenopus tropicalis) after 48h of exposure

由圖 5可知,溫瑞塘河沉積物提取液平均致畸形率為 16.6%,最小畸形率為 0,最大致畸性率為 36.3%.其結(jié)果整體的平均值比楊波等[5]對(duì)山下河、九山河的研究結(jié)果偏小.在本研究中山下河與九山的結(jié)果為13.9%和20.4%其春季的結(jié)果一致.具有極顯著性點(diǎn) 7#、8#、9#、28#、19#,這些點(diǎn)的沉積物的重金屬污染評(píng)價(jià)屬于污染嚴(yán)重等級(jí),污染嚴(yán)重的區(qū)域,其致畸率相對(duì)較高.在本研究中,發(fā)現(xiàn)的主要畸形現(xiàn)象如圖6.

圖6 熱帶爪蟾胚胎48h后主要的畸形表型Fig.6 Major malformation phenotypes of Xenopus tropicalis after 48h for exposure

在暴露組中能夠觀察到各種類型的畸形特征,主要的畸形表型包括:眼睛畸形、軀干腫大、心包水腫、背鰭變窄、脊索彎曲、泄殖腔擴(kuò)張、泄殖腔腫大、皮膚色素減少、皮膚色素沉著、發(fā)育延遲等現(xiàn)象,在畸形現(xiàn)象表征中,在一個(gè)胚胎生長(zhǎng)發(fā)育中也表現(xiàn)出多種畸形現(xiàn)象如色素減輕,泄殖腔腫大、眼睛受損、尾鰭變窄等.這與Shi等[17]、陳瑞瑞等[6]在研究長(zhǎng)江口沉積物與溫瑞塘河山下河、九山河的研究結(jié)果具有相似性,由于沉積物樣品組成物質(zhì)的復(fù)雜性和多變性,導(dǎo)致其畸形的主要因素確定具有難度.

3.5 對(duì)爪蟾胚胎生長(zhǎng)體長(zhǎng)的影響

由圖7可知,爪蟾的平均體長(zhǎng)為3.58cm,最小體長(zhǎng)2.64cm,最大體長(zhǎng)4.06cm.與對(duì)照組的單因子顯著性分析顯示,在4#、21#、22#、24#、25#點(diǎn)體長(zhǎng)不具有顯著的差異性,這些點(diǎn)均處于溫瑞塘河的源頭區(qū)與農(nóng)業(yè)區(qū)域,受污染相對(duì)較小,污染物也單一.其中有22個(gè)采樣點(diǎn)均存在顯著性差異,溫瑞塘河沉積物79%的采樣點(diǎn)提取液對(duì)爪蟾胚胎生長(zhǎng)產(chǎn)生影響.這些點(diǎn)處于受工業(yè)生產(chǎn),及生活的影響,但位于城市生活區(qū)20#點(diǎn)爪蟾胚胎體長(zhǎng)無(wú)差異,可能提取液中的毒性物質(zhì)在抑制胚胎,楊波[5]在研究九山外河的實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)該現(xiàn)象存在.

圖7 暴露48h后沉積物提取液對(duì)熱帶爪蟾胚胎生長(zhǎng)的影響Fig.7 Effects of sediment extracts on growth of amphibian (Xenopus tropicalis) embryos after 48h of exposure

4 結(jié)論

4.1 溫瑞塘河沉積物相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度的平均值63.3%,屬于中等生物毒性,最高發(fā)光強(qiáng)度為81.9%,最低發(fā)光強(qiáng)度為40.6%.

4.2 對(duì)青?；【?Q7)產(chǎn)生生物毒性在區(qū)域分布中,工業(yè)園區(qū)、城市與工廠混雜區(qū)域高于源頭區(qū)及農(nóng)業(yè)區(qū)域.

4.3 熱帶爪蟾平均孵化率 75.98%,最低點(diǎn)孵化率為 42.5%,最高點(diǎn)孵化率為 100%;胚胎的成活率平均值 83.77%,最低成活率為 66.25%,最高成活率為100%;平均致畸形率為16.6%,4個(gè)采樣點(diǎn)無(wú)致畸現(xiàn)象,最大致畸性率為 36.3%;爪蟾的平均體長(zhǎng)為 3.58cm,最小體長(zhǎng) 2.64cm,最大體長(zhǎng)4.06cm.

4.4 在污染源復(fù)雜與污染嚴(yán)重區(qū)域如工業(yè)園區(qū)與城市生活區(qū),河流交匯易于沉積的區(qū)域?qū)ψ概咛サ陌l(fā)育生長(zhǎng)影響大,在河流的源頭區(qū)及污染源單一生活污染區(qū)域的影響小.

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致謝：本論文實(shí)驗(yàn)中發(fā)光細(xì)菌與熱帶爪蟾胚胎由華東師范大學(xué)朱文杰教授、施華宏研究員友情提供,碩士研究生楊波參與部分實(shí)驗(yàn),在此表示感謝.

Biotoxicity characterization of sediments from Wenruitang River

SONG Li1, JIANG Gui-fang1*, HUANG Ming-

The biotoxicity of sediments from Wenruitang River was characterized and analyzed using luminescent bacteria Vibrio qinghaiensis sp. Nov-Q67 and Xenopus tropicalis embryos. The maximum, minimum and average luminous intensity of Q67was 81.9%, 40.6% and 63.3%, respectively, which indicated moderate biotoxicity. In terms of the developmental toxicity of the sediment leachate, the average, maximum and minimum hatching rate of the Xenopus tropicalis embryos was 75.98%, 100% and 42.5%, respectively. The average, minimum and maximum survival rate of the embryos was 83.77%, 66.25% and 100%, respectively. Four sites among all sampling points did not show embryos malformations. The average and maximum teratogenic rate of the embryos was 16.6% and 36.3%. The average, minimum and maximum body length of the embryos was 3.58, 2.64 and 4.06cm, respectively. Sediments collected from combined industrial and residential area exhibited significant biotoxicity, while sediments from the river source area and/or isolated residential area had relatively low biotoxicity.

luminescent bacteria；Tropicalis xenopus embryos；sediment；biological toxicity；Wenruitang River

X171.5

A

1000-6923(2014)09-2374-06sheng2*, LI Qiang (1.Chongqing Key Laboratory of Environmental Material and Remediation Technologies, Chongqing 402160；2.College of Resources and Environmental Science, East China Normal University, Shanghai 200062). China Environmental Science, 2014,34(9)：2374～2379

宋 力(1979-)男,重慶酉陽(yáng)縣人,講師,博士,主要從事水資源利用與水環(huán)境污染控制的研究工作.發(fā)表論文10篇.

《中國(guó)環(huán)境科學(xué)》2012年度引證指標(biāo)

《中國(guó)環(huán)境科學(xué)》編輯部

2014-01-20

國(guó)家科技重大水專項(xiàng)(2009ZX07317-006);重慶市教委項(xiàng)目(KJ121207);重慶文理學(xué)院科研項(xiàng)目(Y2010HH46)

* 責(zé)任作者, 講師, songlicq@163.com,教授,mshuan@des.ecnu.edu.cn

根據(jù)《2013年版中國(guó)科技期刊引證報(bào)告(核心版)》,《中國(guó)環(huán)境科學(xué)》2012年度引證指標(biāo)繼續(xù)位居環(huán)境科學(xué)技術(shù)及資源科學(xué)技術(shù)類科技期刊前列,核心影響因子1.657,學(xué)科排名第1位,在被統(tǒng)計(jì)的1994種核心期刊中列第21位;綜合評(píng)價(jià)總分72.0,學(xué)科排名第3位.《中國(guó)科技期刊引證報(bào)告》每年由中國(guó)科學(xué)技術(shù)信息研究所編制,統(tǒng)計(jì)結(jié)果被科技管理部門和學(xué)術(shù)界廣泛采用.