高杰  韋立新

[摘要] 目前，肺癌已經(jīng)成為世界范圍內(nèi)發(fā)病率及死亡率最高的腫瘤之一。隨著分子生物學(xué)研究的飛速進(jìn)展，肺癌的內(nèi)科治療已經(jīng)從傳統(tǒng)的化療、放療發(fā)展為個(gè)性化的靶向治療。針對(duì)多種靶基因突變的靶向治療為肺癌患者延長(zhǎng)生命、提高生活質(zhì)量帶來希望。此文就最新的非小細(xì)胞肺癌靶基因EML4-ALK相關(guān)問題進(jìn)行綜述。

[關(guān)鍵詞] 肺癌；個(gè)性化治療；基因；EML4-ALK融合基因；表皮生長(zhǎng)因子受體

[中圖分類號(hào)] R734.2???[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A???[文章編號(hào)] 2095-0616（2014）09-40-06

Review of the study of EML4-ALK fusion protein of non-small cell lung cancer

GAO?Jie??WEI?Lixin

Department of Pathology, the General Hospital of PLA, Beijing 100853, China

[Abstract] Today, lung cancer is the most commonly diagnosed cancer and the leading causes of tumor-related deaths in the world. Along with the fast progress of molecular biology, the traditional treatment methods, chemotherapy and radiotherapy gradually have been development to individual therapy. Strategies to maximize treatment benefit have centered on individualizing treatment according to the molecular profile of the non-small cell lung cancer. This review describes the relative information of the newest oncogenic drivers, EML4-ALK fusion protein, have also been implicated as in the pathogenesis of the non-small cell lung cancer.

[Key words] Lung cancer; Individual therapy; Gene; EML4-ALK fusion protein; EGFR

目前，肺癌已經(jīng)成為發(fā)病率及死亡率最高的惡性腫瘤之一。肺癌可以根據(jù)治療手段的不同分為兩大類：小細(xì)胞肺癌及非小細(xì)胞肺癌，其中非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）的發(fā)病率所占比重高，約為60%~85%[1]。所以近些年有關(guān)非小細(xì)胞肺癌治療方面的研究成為熱點(diǎn)。自2000年以來，隨著生物工程技術(shù)以及臨床藥理學(xué)的飛速發(fā)展，肺癌的治療不再局限于手術(shù)治療及干擾細(xì)胞生長(zhǎng)周期的傳統(tǒng)放化療。某些特異性靶點(diǎn)的出現(xiàn)，使腫瘤的治療進(jìn)入到一個(gè)特異性高、不良反應(yīng)輕的靶向治療階段，使越來越多的肺癌患者受益[2]。如近幾年來，針對(duì)非小細(xì)胞肺癌重要靶點(diǎn)之一的EGFR基因突變而設(shè)計(jì)的EGFR酪氨酸激酶抑制劑的出現(xiàn)（tyrosine kinase inhibitors，TKI），如吉非替尼（Gefitinib）和厄洛替尼（Erlotinib）等可以通過對(duì)腫瘤細(xì)胞EGFR的特異性結(jié)合阻斷細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路，從而達(dá)到抑制腫瘤細(xì)胞的增殖并促進(jìn)其凋亡達(dá)到治療目的[3]。然而，并非所有的NSCLC患者對(duì)于TKI的治療表現(xiàn)出較好的療效[4]。隨著肺癌腫瘤分子生物學(xué)研究的深入，逐漸發(fā)現(xiàn)NSCLC患者中存在與EGFR突變及K-RAS突變不重疊的另外一個(gè)重要的酪氨酸激酶抑制劑的作用靶點(diǎn)——EML4-ALK融合基因[5]。此融合基因在NSCLC陽性表達(dá)的患者中可能受益于ALK抑制劑的治療。本文中，我們將簡(jiǎn)要探討非小細(xì)胞肺癌中EML4-ALK融合基因的分子基礎(chǔ)及其各種檢測(cè)方法的不同。

1?ALK抑制劑治療的分子基礎(chǔ)

ALK基因重排是于1994年首先在間變大細(xì)胞淋巴瘤（ALCL）AMS3細(xì)胞株中被發(fā)現(xiàn)的[6]，該基因是由1620個(gè)氨基酸組成的一種跨膜蛋白，它編碼一種有結(jié)構(gòu)性激酶活性的細(xì)胞質(zhì)嵌合蛋白，屬于胰島素受體家族成員之一。之后該基因在炎性肌纖維母細(xì)胞瘤、神經(jīng)母細(xì)胞瘤等腫瘤中陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)。

直到2007年，日本學(xué)者Soda發(fā)現(xiàn)該融合基因與肺癌的關(guān)系，其在一位吸煙的肺癌患者的腫瘤組織內(nèi)檢測(cè)到了棘皮動(dòng)物微管相關(guān)蛋白樣4和間變性淋巴瘤激酶基因（EML4-ALK）發(fā)生基因融合而成的具有致瘤性的變異基因[7]。對(duì)NSCLC患者進(jìn)行該融合基因表達(dá)情況的檢測(cè)，同時(shí)經(jīng)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)ALK抑制劑可以通過濃度依賴的方式抑制轉(zhuǎn)染該基因的BA/F3細(xì)胞生長(zhǎng)，從而誘發(fā)凋亡的發(fā)生。這不僅證實(shí)了ALK變異基因?qū)Ψ伟┠[瘤細(xì)胞增殖中所起到的作用，也充分的支持其作為一種藥物靶點(diǎn)的有效性[8]。

EML4-ALK融合基因的產(chǎn)生源于染色體的重排，發(fā)生部位在2號(hào)染色體短臂上。EML4由N'末端堿基區(qū)、疏松的棘皮動(dòng)物微管相關(guān)蛋白樣區(qū)（hydrophobic echinoderm microtubule-associated protein-like protein，HELP）及WD重復(fù)區(qū)三部分組成，屬于棘皮動(dòng)物微管相關(guān)蛋白樣家族成員。在EML4-ALK融合基因中，EML4的N'末端堿基區(qū)、HELP及WD重復(fù)區(qū)與ALK的胞內(nèi)近胞膜部位發(fā)生融合[9]。正常情況下，棘皮動(dòng)物微管相關(guān)蛋白樣4和間變性淋巴瘤激酶基因分別位于染色體的2p21-2p23兩端；當(dāng)基因重排時(shí)ALK基因和EML4基因在2號(hào)染色體N'末端發(fā)生倒位，產(chǎn)生了包含酪氨酸激酶（TK）活性的癌蛋白嵌合體，此改變是肺癌中最常見的ALK基因異常。目前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有27種EML4-ALK的融合變型體存在，21種變型體位于EML4端，因?yàn)镋ML4斷裂可以存在于多個(gè)不同的外顯子上（如2，6，13，14，15，17，18和20等）。在所有變型體中，ALK基因的TK區(qū)域均位于20號(hào)外顯子。最常見的融合基因變型體為發(fā)生于EML4基因端的外顯子1和3a/b。在肺非小細(xì)胞癌中，除了EML4-ALK融合基因外，還存在一些罕見的ALK融合情況被發(fā)現(xiàn)，如ALK與驅(qū)動(dòng)蛋白家族成員5B基因（kinesin family member 5B， KIF5B）和原肌凝蛋白受體激酶融合基因（tropomyosin receptor kinase-fused gene， TFG）發(fā)生融合的情況。因此，ALK基因重排可能定義為一種對(duì)靶向激酶抑制敏感的腫瘤分子亞組。

另外，由于EML4-ALK融合基因與KRAS基因突變比較相似，又與EGFR突變不共同存在，因此有學(xué)者推測(cè)EML4-ALK融合基因的存在可能解釋為又一個(gè)潛在的原發(fā)耐藥機(jī)制。Shaw等發(fā)現(xiàn)在輕度或不吸煙且無EGFR突變的非小細(xì)胞肺癌患者中，約33%的患者EML4-ALK融合基因?yàn)殛栃訹10]。同時(shí)，他們還對(duì)53例非小細(xì)胞肺癌患者進(jìn)行EGFR-TKI治療，19例患者療效顯著，其中未檢出EML4-ALK基因陽性，而在34例EGFR-TKI耐藥者中檢測(cè)出該融合基因檢出率高達(dá)29%。另外，Koivunen[11]等發(fā)現(xiàn)厄洛替尼不能抑制EML4-ALK陽性的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株H3122增殖。由此可以假設(shè)，EML4-ALK融合基因可能是EGFR-TKI原發(fā)性耐藥的重要原因之一。

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2?克唑替尼的治療

克唑替尼是一種口服小分子的ALK和c-MET酪氨酸激酶的共同抑制劑，可以抑制激活的ALK酪氨酸磷酸化。適用于非小細(xì)胞肺癌患者腫瘤組織內(nèi)ALK基因檢測(cè)陽性的患者。在一期臨床研究中[12]，最初設(shè)計(jì)為包含MET基因擴(kuò)增的腫瘤的擴(kuò)大研究，此階段研究顯示具有顯著的抗腫瘤活性，約為61%的患者獲得客觀有效性，中位PFS值為9.7個(gè)月。在二期臨床研究中也獲得了較為驚人的結(jié)果，由910名ALK陽性的非小細(xì)胞肺癌患者入組，這些患者之前至少接受過一個(gè)療程化療后再接受克唑替尼的治療。這組患者總反應(yīng)率達(dá)到了59.8%，中位PFS為8.1個(gè)月[13]。三期臨床研究對(duì)比了克唑替尼和二線化療藥的情況。有347名ALK陽性患者入組觀察，與化療組對(duì)比克唑替尼治療者有有利的PFS值（7.7個(gè)月），化療組僅為3.0個(gè)月。2010年ASCO會(huì)議上報(bào)到早期臨床試驗(yàn)針對(duì)EML4-ALK融和基因的藥物PF-02341066對(duì)陽性人群有效率超過64%[14]。克唑替尼似乎具有很差的血腦屏障通透性，但臨床試驗(yàn)中對(duì)于非小細(xì)胞肺癌晚期發(fā)生腦部轉(zhuǎn)移的部分患者似乎可以受益。該藥不僅具有令人肯定的療效，同時(shí)還有較好的耐受性，有報(bào)道的相關(guān)副作用包括：惡心（46%），視力損傷（45%），嘔吐（39%），和腹瀉（29%），多數(shù)為1和2級(jí)的不良事件， 3到4級(jí)不良事件患者僅為15%（多數(shù)為丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶升高，呼吸困難，中性粒細(xì)胞減少癥等）[15]?；诹己玫呐R床試驗(yàn)結(jié)果及患者良好的耐受性，加快了克唑替尼應(yīng)用于臨床的步伐。繼FDA批準(zhǔn)克唑替尼作為治療非小細(xì)胞肺癌ALK融合基因陽性的患者之后，我國(guó)于2013年初，中國(guó)食品藥品總局（CFDA）也批準(zhǔn)了該藥用于臨床。

隨著治療的深入，發(fā)現(xiàn)小于10%的ALK陽性患者應(yīng)用該藥仍然表現(xiàn)為疾病進(jìn)程的進(jìn)展，或者一些患者對(duì)治療無任何反應(yīng)或僅開始有反應(yīng)。因此發(fā)現(xiàn)，克唑替尼與其他酪氨酸激酶抑制劑一樣，即使在治療有效的患者也會(huì)出現(xiàn)耐藥性。新英格蘭雜志發(fā)表一篇文章，該文獻(xiàn)報(bào)道了1例對(duì)克唑替尼產(chǎn)生耐藥的NSCLC患者，其腫瘤標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)了兩種新發(fā)突變，可能與克唑替尼耐藥有關(guān)[16]。患者為年輕不吸煙、Ⅳ期的腺癌患者，EGFR突變檢測(cè)為陰性。于其癌細(xì)胞內(nèi)檢測(cè)出EML4-AlK融合基因存在，并接受克唑替尼治療有效，治療后5個(gè)月出現(xiàn)腫瘤進(jìn)展。對(duì)其進(jìn)行DNA測(cè)序和EML4-ALK突變體檢測(cè)。發(fā)現(xiàn)兩處堿基（堿基4374G-A和4493C-A）改變導(dǎo)致該位點(diǎn)氨基酸（分別為C1156Y，L1196M）改變，同時(shí)進(jìn)行細(xì)胞學(xué)試驗(yàn)和磷酸化檢測(cè)驗(yàn)證了該突變確實(shí)可導(dǎo)致耐藥的出現(xiàn)。ALK與ATP或ALK抑制劑的結(jié)合程度與兩處突變?cè)贏LK基因蛋白空間構(gòu)象上所處的位置有著重要的關(guān)系[17]。除了ALK激酶域的突變外，耐藥性的幾個(gè)機(jī)制還可能解釋為ALK基因重排的拷貝增加或者是EGFR/KRAS基因突變等。

臨床病理特點(diǎn)：最近研究顯示，EML4-ALK融合基因存在于大約3%~7%的非小細(xì)胞肺癌患者。臨床特點(diǎn)為傾向于腺癌（特別是實(shí)性、印戒細(xì)胞和黏液篩狀型）、不吸煙或輕度吸煙，年輕人的患者。但此基因的融合也見于老年有吸煙史的患者[18]。

有關(guān)非小細(xì)胞肺癌ALK融合基因檢測(cè)的研究陸續(xù)見到報(bào)道，發(fā)生率約為5%（0.5%~7.5%）。不同實(shí)驗(yàn)室結(jié)果也略為不同。來自我國(guó)第一份研究顯示，在肺腺癌該融合基因的檢出率為16.13%，而非吸煙患者略高，為19.23%。而EGFR、K-RAS、HER2基因未發(fā)生突變的NSCLC中，ALK融合基因陽性檢出率可高達(dá)25%[19]。在我國(guó)大陸及臺(tái)灣地區(qū)K-RAS及EGFR均為野生型的腺癌中ALK檢出比例可高達(dá)42.8%。組織學(xué)為實(shí)性、印戒細(xì)胞和黏液篩狀型腺癌中ALK的發(fā)生率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他類型腺癌（分別為46.2%，8%）。

因此有些學(xué)者建議在具有ALK病理學(xué)特征的，并且已經(jīng)明確EGFR和K-RAS分子檢測(cè)為野生型的非小細(xì)胞肺癌患者中開展ALK檢測(cè)會(huì)大大提高檢測(cè)的陽性比率，此舉利于臨床工作的開展。但實(shí)際研究發(fā)現(xiàn)在一些非腺癌患者中，如腺鱗癌、鱗癌以及EGFR和K-RAS突變型的肺癌中也可以檢測(cè)出ALK陽性[20]。對(duì)于富集人群開展常規(guī)ALK的分子檢測(cè)是必需的。但僅憑這些臨床病理學(xué)特點(diǎn)遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能完全反映全部情況，所以廣泛開展ALK篩查是非常必要的。

3?檢測(cè)方法學(xué)

對(duì)非小細(xì)胞肺癌患者腫瘤組織內(nèi)ALK融合基因進(jìn)行檢測(cè)， 目前有3種不同的方法分別為：FISH法（fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH），基于PCR法（包括RACE-PCR，qRT-PCR或特異性RT-PCR）及免疫組織化學(xué)方法。由于腫瘤患者的組織來源類型不同，有時(shí)需要以標(biāo)本類型選擇不同的方法進(jìn)行檢測(cè)，而上述三種方法檢測(cè)原理以及各自存在不同的優(yōu)缺點(diǎn)，所以當(dāng)懷疑一種技術(shù)的可靠性時(shí)，可以考慮用另外一種方法進(jìn)行驗(yàn)證。下面就對(duì)這三種方法進(jìn)行一一介紹。

FISH檢測(cè)：此方法為最早被FDA認(rèn)證的克唑替尼（Crizotinib）處方使用推薦的檢測(cè)方法，推薦使用雅培公司Vysis ALK斷裂部分FISH探針試劑盒（Abbott Molecular，Inc）來進(jìn)行非小細(xì)胞肺癌患者腫瘤組織中ALK融合基因檢測(cè)[21]。大部分克唑替尼治療的ALK融合基因陽性的非小細(xì)胞肺癌的臨床實(shí)驗(yàn)均是依據(jù)FISH檢測(cè)的結(jié)果。因此，F(xiàn)ISH檢測(cè)仍是ALK基因檢測(cè)的參照標(biāo)準(zhǔn)方法。此方法學(xué)的顯色原理：由于ALK和EML分別位于2號(hào)染色體的3'和5'兩端位置，分別在300kb3'端和442kb的5'端用標(biāo)記的兩個(gè)探針（分別為橘紅色和綠色）進(jìn)行標(biāo)記。當(dāng)未發(fā)生倒位時(shí)二者都應(yīng)位于ALK基因側(cè)，因此紅色與綠色信號(hào)彼此緊鄰。當(dāng)EML4-ALK融合基因存在時(shí)，由于具有ALK激酶區(qū)域的EML的N'末端發(fā)生倒位，產(chǎn)生了包含酪氨酸激酶（TK）活性的癌蛋白嵌合體。這個(gè)結(jié)果導(dǎo)致了橘紅色和綠色探針的距離拉遠(yuǎn)。

為保證檢出的可靠性，組織的前期處理尤為重要。FISH檢測(cè)法腫瘤組織前期處理的具體要求：活檢或者切除標(biāo)本需要用10%中性福爾馬林固定充分，一般固定時(shí)間要求為6~24h。包埋組織塊的大小要求不超過2cm寬，3mm厚。處理過程要求符合標(biāo)準(zhǔn)。最好切成3~5μm厚度的切片，用涂膠片可以避免裂縫假象及避免洗掉。需要在60℃微波爐內(nèi)烤片1h，或在45℃保溫箱內(nèi)過夜。石蠟組織塊最好為1~6個(gè)月之內(nèi)的，這樣RNA降解較少，可以很好地避免雜交失敗，以避免假陰性和假陽性結(jié)果的出現(xiàn)。標(biāo)本的適度脫蠟是避免組織切片染色出現(xiàn)背景或不均勻等問題的關(guān)鍵。組織消化時(shí)間多少需要在在工作中進(jìn)行實(shí)際調(diào)整。當(dāng)細(xì)胞成分少于50%的細(xì)胞學(xué)標(biāo)本，對(duì)腫瘤細(xì)胞的進(jìn)行顯微切割是非常必要的。最少的腫瘤細(xì)胞數(shù)在組織學(xué)標(biāo)本中不少于100個(gè)細(xì)胞，大于一半不能為熒光染色，由于立體分析的原因。少于40個(gè)的腫瘤細(xì)胞標(biāo)本陽性的FISH信號(hào)是不可信的。

陽性結(jié)果的判讀標(biāo)準(zhǔn)： 至少紅色與綠色信號(hào)之間存在一定距離，應(yīng)大于等于大的信號(hào)直徑的2倍。單獨(dú)出現(xiàn)紅色信號(hào)時(shí)，而無綠色信號(hào)伴隨出現(xiàn)，提示基因由于轉(zhuǎn)化或缺失導(dǎo)致的融合。當(dāng)單一的綠色信號(hào)出現(xiàn)，而無紅色信號(hào)伴隨時(shí)被認(rèn)為陰性。同樣，非重排的ALK基因增加的拷貝數(shù)融合信號(hào)代表染色體的多倍體或ALK擴(kuò)增，而非重排。當(dāng)大于25個(gè)細(xì)胞（50%）是認(rèn)為陽性。小于5個(gè)細(xì)胞是陰性（10%）；當(dāng)5~25個(gè)細(xì)胞陽性（0~50%）被認(rèn)為是模棱兩可的！應(yīng)該重做一遍。如果重復(fù)后兩次的平均值在至少15%的陽性細(xì)胞，此時(shí)被認(rèn)為陽性。

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雖然，原位雜交技術(shù)是首先被FDA推薦的一種檢測(cè)ALK融合基因技術(shù)。但它也存在許多不足之處。首先，該檢測(cè)試劑盒的價(jià)格昂貴，不利于廣泛推廣采用，同時(shí)這種方法不能明確ALK融合基因的具體變異體。另外，對(duì)于操作和判讀的要求較高，必須進(jìn)行嚴(yán)格培訓(xùn)的診斷醫(yī)生才能勝任。其次，多數(shù)的患者發(fā)現(xiàn)腫瘤時(shí)為晚期肺癌，此時(shí)已經(jīng)失去手術(shù)機(jī)會(huì)，只能獲取很小的活檢組織，小活檢組織很難保證每個(gè)視野具有足夠的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行判斷。所以，此方法嚴(yán)重的限制了對(duì)大多數(shù)非小細(xì)胞肺癌患者的大規(guī)模的篩查及診斷。

免疫組化法 FISH檢測(cè)法為FDA認(rèn)證的克唑替尼處方使用推薦的檢測(cè)方法。此技術(shù)最初被認(rèn)為ALK融合基因檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)。但由于FISH檢測(cè)技術(shù)操作難度大，普及較為困難，以及其價(jià)格昂貴，此方法的用于ALK篩查面臨較大的阻力。因此探索其他分子診斷檢測(cè)方法成為必然。免疫組織化學(xué)法為病理醫(yī)生熟悉，其操作簡(jiǎn)便易行，價(jià)格便宜等優(yōu)點(diǎn)，成為潛在的篩查方法。通過大樣本和不同抗體成功的證實(shí)免疫組化法也變成較好的篩查方法。免疫組化檢測(cè)的生物前提是ALK基因異位和轉(zhuǎn)化具有多個(gè)可能存在的配體導(dǎo)致ALK蛋白的過表達(dá)。ALK蛋白酪氨酸激酶是克唑替尼的靶點(diǎn)。 因此，可以直接合理評(píng)價(jià)藥物。

目前，ALK免疫組化檢測(cè)法可以分為手動(dòng)免疫組化法和由羅氏公司開發(fā)的Ventana全自動(dòng)儀器操控兩種方法。免疫組化檢測(cè)法作為一種半定量實(shí)驗(yàn)方法，有經(jīng)濟(jì)、迅速、容易得出診斷性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果的優(yōu)點(diǎn)，并為病理學(xué)專家熟悉。雖然使用IHC法僅僅是處于初篩狀態(tài)（尤其是手動(dòng)免疫組化染色）。這種方法需要面臨如下問題：組織的前期處理、抗體的選擇、顯色信號(hào)放大系統(tǒng)以及評(píng)分系統(tǒng)等。

組織前期處理階段：包括組織的固定、固定所持續(xù)時(shí)間可能對(duì)于ALK抗原的保存情況均沒有被評(píng)價(jià)。假陰性可能由于固定較差而出現(xiàn)。在外科手術(shù)切除標(biāo)本，陽性梯度的出現(xiàn)可能由于組織固定穿透性的梯度導(dǎo)致的。

抗體的選擇：目前針對(duì)ALK融合蛋白檢測(cè)常見的有三種抗體，即ALK1，D5F3和5A4。大量的實(shí)驗(yàn)研究證明，由于非小細(xì)胞肺癌組織內(nèi)ALK融合蛋白濃度相對(duì)較低，最早出現(xiàn)的抗體ALK1敏感性較差，僅適合用作識(shí)別間變性淋巴瘤，不適合用于非小細(xì)胞肺癌ALK融合基因的檢測(cè)。隨著不斷的探索，新一代的具有較高敏感性的抗體陸續(xù)出現(xiàn)，如D5F3和5A4，有研究針對(duì)這兩種抗體與FISH法進(jìn)行對(duì)照研究，得出二者對(duì)非小細(xì)胞肺癌ALK融合基因檢測(cè)的敏感性和特異性分別達(dá)到了100%及95%~99%[22]。

評(píng)分系統(tǒng)方面的問題主要見于手動(dòng)免疫組化法，ALK免疫組化陽性部位是胞漿，呈棕黃色顆粒狀改變，在一些例子同時(shí)可以表現(xiàn)為膜陽性。評(píng)價(jià)陽性的強(qiáng)度是非常主觀的，并且缺乏統(tǒng)一的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。改良H-score法是依次使用物鏡用法評(píng)價(jià)陽性強(qiáng)度可以得出更統(tǒng)一的強(qiáng)度評(píng)分。通常認(rèn)為在2倍或4倍物鏡下可以清楚看到陽性為（3+）；而在10倍或20倍物鏡下可以清楚看到陽性為（2+）；在40倍物鏡下可以清楚看到陽性（1+）。

采用免疫組化法需注意以下的問題。由于ALK融合蛋白表達(dá)與神經(jīng)外胚層的分化有關(guān)，故其可能在正常人的神經(jīng)組織和小細(xì)胞肺癌中存在表達(dá)。因此，不推薦在小細(xì)胞肺癌中使用ALK融合蛋白的免疫組化檢測(cè)。另外，在壞死組織、黏液組織以及肺泡腔內(nèi)的泡沫細(xì)胞經(jīng)免疫組化染色常易著色，造成假陽性結(jié)果，在判讀免疫組化染色結(jié)果時(shí)一定要加以注意。

顯色信號(hào)放大系統(tǒng)：羅氏的Ventana全自動(dòng)儀，可以做到檢測(cè)流程及判讀結(jié)果都達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)化。其特色的技術(shù)是使用了基于非內(nèi)源性半抗原、信號(hào)擴(kuò)增多聚體及辣根過氧化酶系統(tǒng)染色信號(hào)放大技術(shù)。不影響結(jié)果的特異性的前提下，大大提高了ALK融合蛋白檢出的敏感性。

免疫組化結(jié)果與FISH檢測(cè)的一致性：來自三個(gè)大樣本的免疫組化與FISH法對(duì)照研究結(jié)果顯示：FISH法陰性同時(shí)免疫組化法也總是陰性（一致性為100%），IHC3+陽性與FISH檢測(cè)完全一致，兩種方法存在較好的符合率[23]。因此，有的學(xué)者建議用IHC評(píng)價(jià)的病例無需再通過FISH檢驗(yàn)。但是，另一些實(shí)驗(yàn)室有不同的結(jié)果，免疫組化判讀為3+，而FISH檢測(cè)為陰性；也有的病例FISH檢測(cè)陽性，而免疫組化為陰性結(jié)果。因此，有學(xué)者建議所有經(jīng)免疫組化法ALK陽性的病例都應(yīng)該行FISH或PCR法進(jìn)行驗(yàn)證。

RT-PCR 此方法是一種敏感性高，而且快速出結(jié)果的分子檢測(cè)技術(shù)，即使存在較少的RNA拷貝數(shù)也可以檢測(cè)出來。因此，RT-PCR法可以用于對(duì)FISH法和免疫組化法的結(jié)果進(jìn)行檢驗(yàn)。也可以代替FISH法和免疫組化法單獨(dú)用于ALK融合基因的檢測(cè)。此法可以用來檢測(cè)出多個(gè)已知的ALK融合基因突變體的存在。然而其也存在一些不利因素，阻礙了其不能成為此種檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方式。RT-PCR法需要高品質(zhì)的RNA，需要超過1000bp的擴(kuò)增子并且要恰當(dāng)?shù)牡蜏乇４婺[瘤組織，這在常規(guī)工作中是很難達(dá)到的。常規(guī)工作中，多數(shù)肺癌標(biāo)本都是石蠟包埋組織，長(zhǎng)時(shí)間后組織內(nèi)RNA的降解難以避免。另外，由于ALK融合基因已知存在20多種變異體的存在，需要多組引物才能完成，這種檢測(cè)要求更復(fù)雜的系統(tǒng)來實(shí)現(xiàn)?；赗T- PCR 技術(shù)對(duì)實(shí)驗(yàn)室有較高要求，這也是其難以成為 ALK 檢測(cè)主要方法之一。

對(duì)于ALK融合基因的檢測(cè)，盡管常見于上述3種方法，但有不同的研究者仍在探討一些改良方法或者創(chuàng)新的方法。韓國(guó)首爾國(guó)立大學(xué)評(píng)價(jià)了FISH和一種新的方法——顯色原位雜交法（chromogenic in situ hybridization，CISH），用來評(píng)價(jià)兩種方法在檢測(cè)ALK基因重排的一致性的研究。該實(shí)驗(yàn)對(duì)465例NSCLC進(jìn)行CISH法檢測(cè)，18例檢測(cè)出ALK基因重排，陽性率為4%。兩種檢測(cè)方法高度一致性（吻合系數(shù)為0.92）。另外，還對(duì)比了CISH與IHC檢測(cè)ALK基因狀態(tài)和ALK蛋白表達(dá)情況，也表現(xiàn)為較高一致性（吻合系數(shù)為0.82）[24]。

綜上所述，ALK融合基因陽性的非小細(xì)胞肺癌是肺癌的新的分子亞型，也是繼EGFR、 KRAS之后發(fā)現(xiàn)的又一個(gè)重要腫瘤靶點(diǎn)。其靶向治療藥——克唑替尼的出現(xiàn)為非小細(xì)胞肺癌患者帶來新的希望。在臨床工作中，要根據(jù)肺癌標(biāo)本的類型合理的、 順次的進(jìn)行靶點(diǎn)基因的篩選，依據(jù)具體檢測(cè)結(jié)果選擇相應(yīng)的個(gè)體化靶向治療，最終達(dá)到提高肺癌患者的生存質(zhì)量和延長(zhǎng)生存時(shí)間的目的。

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（收稿日期：2014-02-11）

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