黃東  吳保祥  王昉

[摘要] 目的 建立苯扎貝特?；镏杏嘘P(guān)物質(zhì)的測(cè)定方法。 方法 NUCLEOSIL 100-5 C18（5μm）0.125m×4mm；流動(dòng)相為磷酸二氫鉀溶液（2.72g/L，用磷酸調(diào)節(jié)pH2.3）︰甲醇=4︰6；檢測(cè)波長(zhǎng)：228nm；流速：1.0mL/min。 結(jié)果 苯扎貝特?；锱c主要雜質(zhì)能得到有效分離，各雜質(zhì)在0.2~3.5μg/mL范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。 結(jié)論 本測(cè)定方法靈敏度高，準(zhǔn)確可靠，可以控制苯扎貝特?；镏杏嘘P(guān)物質(zhì)的含量。

[關(guān)鍵詞] 苯扎貝特?；铮挥嘘P(guān)物質(zhì)；系統(tǒng)適用性

[中圖分類(lèi)號(hào)] R927.2???[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] B???[文章編號(hào)] 2095-0616（2014）09-118-04

Related substances determination of bezafibrate acylate by HPLC

HUANG?Dong1??WU?Baoxiang1??WANG?Fang2

1.Jiangsu Tasly Diyi Pharmaceutical CO., Ltd.， Huaian 223002, China; 2.Analytical＆Testing Center of Nanjing Normal University, Nanjing 210046, China

[Abstract] Objective To establish an HPLC method for detection of the related substances. Methods The analytical column was NUCLEOSIL 100-5 C18 column (4.0mm×12.5cm, 5μm). The mobile phase was potassium dihydrogen phosphate (2.72g/L, adjust to pH 2.3 with phosphoric acid): methanol = 4:6 The flow rate was 1.0mL/min. The wavelenth was 228nm. Results A satisfactory separation condition for the five related impurities, the impurities standard curve was good linear over the range of 0.2-3.5μg/mL. Conclusion The method is sensitive and accurate and it can be used to determine the relateted substances of bezafibrate acylate.

[Key words] Bezafibrate acylate; Related substances; System suitability

苯扎貝特?；锘瘜W(xué)名N-對(duì)羥基苯乙基-4-氯苯甲酰胺，是合成降脂藥苯扎貝特的重要中間體，目前它的合成主要以酪氨（對(duì)羥基苯乙胺)鹽酸鹽為原料，與對(duì)氯苯甲酰氯發(fā)生酰化反應(yīng)后先生成中間體，不經(jīng)分離與甲醇發(fā)生酯交換反應(yīng)而得，再經(jīng)縮合反應(yīng)制得苯扎貝特，所以苯扎貝特?；锏馁|(zhì)量?jī)?yōu)劣直接關(guān)系到苯扎貝特產(chǎn)品的質(zhì)量，在苯扎貝特?；锏纳a(chǎn)過(guò)程中，實(shí)際存在和可能產(chǎn)生的雜質(zhì)有對(duì)羥基苯乙胺、4-氯-苯甲酸及一些未知雜質(zhì)等。本文通過(guò)對(duì)苯扎貝特?；锷a(chǎn)過(guò)程的監(jiān)控，來(lái)確定其質(zhì)量的優(yōu)劣，為下一步苯扎貝特的生產(chǎn)提供有力的保證。

苯扎貝特?；镌械馁|(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中只有性狀、熔點(diǎn)、干燥失重、含量等項(xiàng)目，不能完全反應(yīng)出其真正的質(zhì)量，本文通過(guò)建立高效液相色譜法來(lái)測(cè)定其有關(guān)物質(zhì)，來(lái)更好地控制苯扎貝特?；锏馁|(zhì)量，參考文獻(xiàn)方法，本文采用高效液相色譜法建立了苯扎貝特?；镏杏嘘P(guān)物質(zhì)的分析方法，并對(duì)該方法的專(zhuān)屬性、精密度、線性、回收率、檢測(cè)限和定量限等進(jìn)行了驗(yàn)證，均滿足要求，方法可行。

1?儀器設(shè)備與試劑試藥

高效液相色譜儀HPLC系統(tǒng)：沃特斯高效液相色譜儀2489檢測(cè)器，2695分離單元（四元泵、717自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱）；軟件：Empower3.工作站；HP1020打印機(jī)。

苯扎貝特?；飿?biāo)準(zhǔn)品（lot：101169-201001）；甲醇（色譜純201308066，江蘇漢邦科技)；雜質(zhì)對(duì)羥基苯乙胺lot：20131016，含量：99.8%)；雜質(zhì)4-氯-苯甲酸（lot：130112，含量：100%阿拉丁化學(xué)試劑有限公司）。

2?方法與結(jié)果

2.1?色譜條件

色譜柱：十八烷基硅烷鍵合硅膠色譜柱 C18（5μm）12.5cm×4mm。流速為1.0mL/min ；檢測(cè)波長(zhǎng)為228nm。流動(dòng)相：磷酸二氫鉀溶液（2.72g/L，用磷酸調(diào)節(jié)pH2.3）︰甲醇=400︰600； 進(jìn)樣量：20.0μL。

2.2?溶液制備

試驗(yàn)溶液：取本品50.0mg加流動(dòng)相溶解稀釋至100.0mL。

對(duì)照溶液（1）：吸取試驗(yàn)溶液10.0mL加流動(dòng)相稀釋至100.0mL，再吸上述溶液10.0mL加流動(dòng)相稀釋至100.0mL。

對(duì)照溶液（2）：吸取對(duì)照溶液（1）5.0mL加流動(dòng)相稀釋至50.0mL。

對(duì)照溶液（3）：取4-氯苯甲酸（雜質(zhì)B）對(duì)照品2mg加流動(dòng)相適量使溶解，加入2mL試驗(yàn)溶液用流動(dòng)相稀釋至50mL。

2.3?進(jìn)樣操作與系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)

系統(tǒng)平衡后，按照以上的色譜條件，在記錄對(duì)照溶液（3）的色譜圖中，兩主峰分離度在1.5以上，在記錄對(duì)照溶液（2）的色譜圖中采用信噪比至少為5。

空白測(cè)試：取稀釋溶劑進(jìn)樣，作為空白，表明稀釋溶劑對(duì)雜質(zhì)測(cè)定無(wú)干擾，在樣品測(cè)定中出現(xiàn)溶劑峰的應(yīng)忽略。

分別取20μL試驗(yàn)溶液和20μL對(duì)照溶液（1）、（2）、（3）注入液相色譜儀，記錄色譜圖至主峰保留時(shí)間的2倍。

2.4?計(jì)算公式

總雜質(zhì)含量（%)＝

式中：WS→配制對(duì)照液（a)的樣品的重量，mg；

Wi→樣品的重量，mg；

As→對(duì)照液（a)中主峰的峰面積。

→供試液色譜圖中總雜質(zhì)的峰面積。

2.5?結(jié)果判定

記錄試驗(yàn)溶液的色譜圖中，除主峰外，其他峰面積不得大于對(duì)照溶液（1）的主峰面積（1.0%）。除主峰外，所有峰面積的總和，不得大于對(duì)照溶液（1）的主峰面積的2倍（2.0%），小于對(duì)照溶液（1）的主峰面積的0.05倍的峰不記錄。

2.6?方法的專(zhuān)屬性

2.6.1?雜質(zhì)及苯扎貝特?；锏姆肿咏Y(jié)構(gòu)確認(rèn)（委托南京師范大學(xué)分析中心檢測(cè))?通過(guò)紫外分光光度計(jì)、液相色譜-質(zhì)譜、紅外分光光度計(jì)等方法進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析確證各雜質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)[1-6]。

2.6.2?單個(gè)雜質(zhì)的定性?依次取雜質(zhì)對(duì)羥基苯乙胺（lot：20131016，含量：99.8%)10mg，至一個(gè)25mL容量瓶中，用稀釋溶劑稀釋至刻度，混合均勻。進(jìn)樣，記錄色譜圖，用保留時(shí)間對(duì)對(duì)羥基苯乙胺進(jìn)行定性，雜質(zhì)4-氯-苯甲酸（lot：130112，含量：100%阿拉丁化學(xué)試劑有限公司）10mg，至一個(gè)50mL容量瓶中，用溶劑稀釋至刻度，混合均勻，進(jìn)樣，記錄色譜圖，用保留時(shí)間對(duì)4-氯-苯甲酸進(jìn)行定性，取苯扎貝特?；飳?duì)照品（lot：101169-201001）10mg至一個(gè)25mL容量瓶中，用稀釋溶劑稀釋至刻度，混合均勻。進(jìn)樣，記錄色譜圖，用保留時(shí)間對(duì)苯扎貝特?；镞M(jìn)行定性。然后分別取上述三種溶液各5mL至50mL容量瓶中，用溶劑稀釋至刻度，進(jìn)樣記錄色譜圖，各雜質(zhì)的分離度和理論板數(shù)都符合規(guī)定，見(jiàn)圖1。

2.6.3?高溫破壞性試驗(yàn)?精密稱(chēng)取樣品細(xì)粉10.0mg置于10.0mL容量瓶中，共4份，分別進(jìn)行80℃高溫烘箱中加熱1、3、5、10d進(jìn)行破壞性試驗(yàn)，用溶劑溶解稀釋至制成1.0mg/mL的溶液。

2.6.4?光照破壞性試驗(yàn)?精密稱(chēng)取樣品細(xì)粉10.0mg置于10.0mL容量瓶中，共4份，在4500L X光照下照射1、3、5、10d用溶劑溶解稀釋至制成1.0mg/mL的溶液。

2.6.5?酸破壞性試驗(yàn)?精密稱(chēng)取樣品細(xì)粉10.0mg置于10.0mL容量瓶中，共4份，分別加入1.0mol/L鹽酸的1mL在100℃水浴中加熱1、2、3、5h進(jìn)行破壞性試驗(yàn)，再用1.0mol/L的氫氧化鈉中和，再用溶劑稀釋至制成1.0mg/mL的溶液。

2.6.6?堿破壞性試驗(yàn)?精密稱(chēng)取樣品細(xì)粉10.0mg置于10.0mL容量瓶中，共4份，分別加入1.0mol/L的氫氧化鈉1mL在100℃水浴中加熱1、2、3、5h進(jìn)行破壞性試驗(yàn)，再用1.0mol/L的鹽酸中和，再用溶劑稀釋至制成1.0mg/mL的溶液。

2.6.7?氧化破壞性試驗(yàn)?精密稱(chēng)取樣品細(xì)粉10.0mg置于10.0mL容量瓶中，共4份，分別加入30%雙氧水1mL在100℃水浴中加熱1、2、3、5h進(jìn)

圖1??分離度色譜圖

行破壞性試驗(yàn)，再用溶劑稀釋至制成1.0mg/mL的溶液。

分別取上述溶液進(jìn)樣，記錄色譜圖，結(jié)果表明苯扎貝特?；锝?jīng)，高溫、光照、酸、堿、氧化等破壞性試驗(yàn)所降解產(chǎn)生的雜質(zhì)與主成分份均能有效分離，經(jīng)對(duì)主成分峰的峰純度分析，峰純度均符合要求，表明該方法具有良好的專(zhuān)屬性。

2.7?精密度和重復(fù)性

分別精密稱(chēng)取苯扎貝特?；?0mg、對(duì)羥基苯乙胺10mg、4-氯苯甲酸10mg，與同一50mL容量瓶中，用溶劑稀釋溶解并定容至刻度，在上述色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖，苯扎貝特酰化物的峰面積的RSD為1.1%，對(duì)羥基苯乙胺峰面積的RSD為0.9%，4-氯苯甲酸峰面積的RSD為1.3%，均小于2.0%。重復(fù)性和中間精密度符合規(guī)定。

2.8?雜質(zhì)線性回歸試驗(yàn)

標(biāo)準(zhǔn)貯備液：分別精密稱(chēng)取以下標(biāo)準(zhǔn)品：雜質(zhì)對(duì)羥基苯乙胺、雜質(zhì)4-氯-苯甲酸10.0mg，各至一個(gè)500mL容量瓶中，各加入流動(dòng)相超聲溶解并稀釋至刻度，混合均勻，得到每個(gè)雜質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)貯備液。每個(gè)雜質(zhì)的濃度均約為20.0μg/mL。

分別取標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液0.5，1.0，2.5，4，5，6，10mL分別至7個(gè)50.0mL容量瓶，用流動(dòng)相稀釋至刻度，制成濃度分別為0.2、0.4、1、1.6、2、2.4、4μg/mL的一系列溶液，搖勻，各精密量取20μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖。以各組分峰面積平均值對(duì)其濃度（μg/mL），進(jìn)行線性回歸分析，得到各組分的標(biāo)準(zhǔn)曲線。對(duì)羥基苯乙胺、4-氯-苯甲酸線性回歸相關(guān)系數(shù)r分別為0.9995、0.9998均大于0.999，結(jié)果表明對(duì)羥基苯乙胺、4-氯-苯甲酸在濃度0.2~0.32ug/mL范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.9?加樣回收試驗(yàn)

精密稱(chēng)取已測(cè)定有關(guān)物質(zhì)含量的樣品適量，共3份，分別置50mL容量瓶中，加適量溶劑溶解，然后各精密加入已知濃度的對(duì)羥基苯乙胺，4-氯苯甲酸對(duì)照品的貯備液，制成相當(dāng)于雜質(zhì)80%、100%、120%的溶液并稀釋至刻度，搖勻，按2.1項(xiàng)下色譜條件，進(jìn)樣，記錄色譜圖，計(jì)算對(duì)羥基苯乙胺、4-氯苯甲酸的含量，減去樣品本底具有的含量，計(jì)算回收率，結(jié)果對(duì)羥基苯乙胺的平均回收率為： 99.2%，RSD=0.69%（n=9）；4-氯苯甲酸為100.1%， RSD=0.92% （n=9)。

2.10?雜質(zhì)檢測(cè)限的測(cè)定

在2.1色譜系統(tǒng)下進(jìn)樣，記錄色譜圖。當(dāng)對(duì)羥基苯乙胺進(jìn)樣濃度為0.01μg/mL時(shí)，其色譜峰高約為基線噪音的3倍，當(dāng)4-氯苯甲酸進(jìn)樣濃度為0.02μg/mL時(shí)，其色譜峰高約為基線噪音的3倍，當(dāng)苯扎貝特?；镞M(jìn)樣濃度為0.005μg/mL時(shí)，其色譜峰高約為基線噪音的3倍，根據(jù)進(jìn)樣量20μL計(jì)算，對(duì)應(yīng)的對(duì)羥基苯乙胺檢測(cè)限為1ng，4-氯苯甲酸檢測(cè)限為2ng，苯扎貝特?；餀z測(cè)限為0.5ng。

2.11?樣品的穩(wěn)定性

取同一供試品溶液分別于配制后0、2、4、8h內(nèi)按“ 2.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄峰面積，結(jié)果苯扎貝特?；锏姆迕娣eRSD為0.8%，對(duì)羥基苯乙胺的峰面積RSD為1.1%，4-氯苯甲酸的峰面積RSD為1.0%，表明溶液在8h內(nèi)穩(wěn)定。

2.12?樣品有關(guān)物質(zhì)測(cè)定

樣品中有關(guān)物質(zhì)測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。

表1??樣品中有關(guān)物質(zhì)測(cè)定結(jié)果（%）

名稱(chēng) 批號(hào)

BZ1306001a BZ1306002a BZ1306003a

對(duì)羥基苯乙胺 0.05 0.08 0.10

4-氯苯甲酸 0.21 0.30 0.28

單個(gè)最大未知雜質(zhì) 0.02 0.01 0.02

總雜質(zhì) 0.50 0.56 0.53

取樣品溶液，按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖至主成分保留時(shí)間的2.5倍。按面積歸一化法計(jì)算單一雜質(zhì)及總雜質(zhì)的含量，苯扎貝特?；飿悠冯s質(zhì)含量測(cè)定結(jié)果均符合標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定[7]。

3?討論

本實(shí)驗(yàn)考慮到后期成品的質(zhì)量檢測(cè)，且這幾種物質(zhì)在228nm處均有較大吸收，所以采用苯扎貝特成品的有關(guān)物質(zhì)色譜條件來(lái)進(jìn)行[8]。

溶劑的選用，考慮到苯扎貝特?；镌诹鲃?dòng)相中也具有一定的溶解度，對(duì)于有關(guān)物質(zhì)檢查樣品的濃度可以滿足要求，所以選擇流動(dòng)相做為溶劑，也避免了其他溶劑對(duì)雜質(zhì)的干擾[9-10]。

本實(shí)驗(yàn)采用高效液相色譜法法來(lái)檢查苯扎貝特?；锏挠嘘P(guān)物質(zhì)，通過(guò)實(shí)驗(yàn)可以看到，本方法對(duì)雜質(zhì)與主成分苯扎貝特?；锬茌^好的分離，該方法簡(jiǎn)單易行并且具有良好的專(zhuān)屬性[11-12]。

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（收稿日期：2014-03-12）