陳智聰， 劉 俊， 廖繼東△， 谷景義， 楊曉蕾， 李揚秋

(暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院 1田家炳醫(yī)學(xué)實驗中心， 2血液病研究所，廣東 廣州 510632)

間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells, MSCs)來源于中胚層，存在于包括胚胎組織等多種成體組織內(nèi)，具有多向分化和自我更新能力，可對T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞等免疫系統(tǒng)細(xì)胞的激活、增殖以及功能產(chǎn)生影響；它在創(chuàng)傷修復(fù)、組織功能重建、免疫治療等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景[1-2]。NOD樣受體(NOD-like receptors，NLRs)是天然免疫受體超家族中重要一員，可識別病原相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular patterns, PAMP)，啟動天然免疫應(yīng)答和誘發(fā)調(diào)節(jié)獲得性免疫[3-5]。報道顯示某些NLR家族成員與MSCs分化和免疫調(diào)節(jié)等功能密切相關(guān)[6-7]。無論何種來源的MSCs，其初始細(xì)胞數(shù)量均無法滿足實驗和臨床應(yīng)用，需要在體外進行傳代擴增。然而，細(xì)胞在體外進行大量擴增后，其生物活性和功能必然隨之發(fā)生變化[8]。迄今，未見有關(guān)NLR家族全體成員在MSCs上表達(dá)及連續(xù)傳代培養(yǎng)對其影響的報道。本研究采用RT-qPCR對人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells, hUC-MSCs)連續(xù)培養(yǎng)傳代前后(第3和28代)的23個NLR家族成員的mRNA表達(dá)進行定量測定，探討傳代培養(yǎng)對hUC-MSCs上所有23個NLR家族成員mRNA表達(dá)的影響，為hUC-MSCs在連續(xù)培養(yǎng)傳代過程中增殖、遷移、分化、參與組織修復(fù)以及免疫調(diào)節(jié)等能力的改變積累實驗數(shù)據(jù)，為改進hUC-MSCs傳代培養(yǎng)質(zhì)量與提高h(yuǎn)UC-MSCs在實驗和臨床應(yīng)用中的數(shù)量及安全性尋找切入途徑。

材 料 和 方 法

1 材料和試劑

取暨南大學(xué)華僑醫(yī)院婦產(chǎn)科出生的健康新生兒臍帶，長度約8～10 cm，胎齡37～40周，供者無先天性疾病及梅毒、艾滋病、肝炎等傳染性疾病，產(chǎn)婦及家屬對臍帶用于實驗研究均知情同意；DMEM/F12培養(yǎng)基和胎牛血清購自Gibco；人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞成骨、脂肪誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基購自Cyagen；RNAsimple Total RNA Kit購自北京天根生化技術(shù)有限公司；2×Taq PCR MasterMix購自廣州美津生物技術(shù)有限公司；THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix購自東洋紡生物技術(shù)有限公司。

2 方法

2.1hUC-MSCs的分離與培養(yǎng) 無菌收集剖宮產(chǎn)新生兒臍帶，用膠原酶II消化結(jié)合貼壁選擇分離純化hUC-MSCs，胰酶消化傳代培養(yǎng)至28代。

2.2hUC-MSCs的生物學(xué)特性鑒定 倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞表面抗原及利用人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞成骨、脂肪誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基進行成骨、脂肪誘導(dǎo)檢測其分化能力。

2.3RT-qPCR引物設(shè)計與合成 根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫，由Oligo 7.0設(shè)計，并用NCBI Primer-BLAST分析引物特異性，滿足要求之后由上海英維捷基貿(mào)易有限公司合成，所有引物均經(jīng)過PCR擴增產(chǎn)物測序，Vector NTI比對分析驗證證實合格，引物序列見表1。

表1 NLRs的PCR引物序列

2.4細(xì)胞總RNA提取、鑒定和cDNA合成 RNA提取方法按天根RNAsimple Total RNA Kit說明書操作；取2 μL RNA樣本用微量核酸定量儀(Thermo)檢測RNA純度以及濃度。cDNA合成按東洋紡ReverTra Ace qPCR RT Kit操作指南進行。提取的RNA樣品于65 ℃變性5 min后置于冰上冷卻8 min，構(gòu)建20 μL反應(yīng)體系，于PCR儀經(jīng)37 ℃ 15 min、98 ℃ 5 min完成cDNA的合成。產(chǎn)物保存于-20 ℃。

2.5PCR產(chǎn)物鑒定 根據(jù)美津生物2×Taq MasterMix配置PCR反應(yīng)體系，在PCR儀(東勝創(chuàng)新)上以94 ℃ 2 min，94 ℃ 30 s，61 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，共35個循環(huán)。收集產(chǎn)物，取5 μL進行瓊脂糖凝膠電泳(2%)，觀察條帶大小與預(yù)期值是否一致，剩余產(chǎn)物送至北京六合華大基因科技股份有限公司進行測序，測序結(jié)果用Vector NTI進行比對分析。選取擴增片段序列與目的基因靶序列一致的引物作為樣本分析用引物。

2.6RT-qPCR 根據(jù)東洋紡THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix配置PCR反應(yīng)體系，在熒光定量PCR儀(Bio-Rad PTC-200)上反應(yīng)(95 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s，61 ℃ 15 s，72 ℃ 30 s，共45個循環(huán))。觀察擴增動力學(xué)曲線和溶解曲線，用公式2-ΔCt方法進行相對定量，計算得出目的基因相對于管家基因GAPDH的量。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件分析。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，采用Levene’s方差齊性檢驗和獨立樣本t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 hUC-MSCs的形態(tài)及生長特性

經(jīng)膠原酶消化分離的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞接種24 h后貼壁。原代培養(yǎng)細(xì)胞除梭形MSCs以外還含有形狀不規(guī)則的雜質(zhì)細(xì)胞，見圖1A；傳代培養(yǎng)細(xì)胞至第3代時，細(xì)胞純度較高，呈梭形聚集狀生長，一般3～5 d便可達(dá)80%～90%融合，見圖1B；傳代培養(yǎng)至23代，細(xì)胞增殖能力有所下降，但仍保持了良好的細(xì)胞形態(tài)，見圖1C；第28代后，細(xì)胞生長速度減緩、部分細(xì)胞呈平鋪狀、胞體變大、胞漿內(nèi)出現(xiàn)空泡等現(xiàn)象，見圖1D。

2 hUC-MSCs的細(xì)胞表型

流式細(xì)胞術(shù)檢測顯示體外培養(yǎng)第3代和第28代hUC-MSCs的細(xì)胞表型均為：CD29+/CD44+/CD105+/CD31-/CD34-/ CD40-/CD45-/CD106-/HLA-DR-，見圖2。

Figure 1. Morphology of human umbilical cord mesenchymal stem cells at different passages (×100). A: primary cells; B: passage 3; C: passage 23; D: passage 28.

3 hUC-MSCs的分化能力

第3和28代hUC-MSCs被成骨誘導(dǎo)分化后，經(jīng)茜素紅染色，可以見到大量紅色鈣化基質(zhì)(圖3A、B)；兩代細(xì)胞被脂肪誘導(dǎo)分化后，經(jīng)油紅O染色，可以見到細(xì)胞內(nèi)有紅色脂滴(圖3C、D)，表明第3和28代hUC-MSCs均具有向成骨和脂肪分化的潛能，但第28代的分化能力較第3代弱，在脂肪誘導(dǎo)分化過程中表現(xiàn)尤為明顯。

4 RT-PCR產(chǎn)物的電泳分析結(jié)果

如圖4所示，NOD1、NOD2、NLRC3、NLRC4、NLRC5、NLRP1、NLRP2、NLRP3、NLRP4、NLRP5、NLRP6、NLRP7、NLRP8、NLRP9、NLRP10、NLRP11、NLRP12、NLRP13、NLRP14、CIITA、NAIP、NLRX1和APAF1目的條帶單一、清晰且與預(yù)期值相符。

5 第3和28代 hUC-MSCs的NLRs mRNA表達(dá)量比較

如圖5所示，23個NLR家族成員在連續(xù)培養(yǎng)傳代前后的hUC-MSCs中均有表達(dá)，其中NOD1、NLRC4、NLRC5、NLRP1、NLRP3、NLRP10、NAIP、NLRX1和APAF1 mRNA高表達(dá)，其余成員低表達(dá)， NLRP6和CIITA的表達(dá)尤為低下。hUC-MSCs經(jīng)長期培養(yǎng)至第28代，除NLRP10 mRNA表達(dá)上升和NLRC5、NLRX1 mRNA表達(dá)量基本保持不變外，其余成員的表達(dá)均有所下降，其中NLRP1 mRNA表達(dá)的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

討 論

MSCs來自于中胚層，存在于包括胚胎組織等多種成體組織內(nèi)，具有來源廣泛、取材容易、分離純化程序簡單、可在體外連續(xù)傳代培養(yǎng)擴增和保存等優(yōu)點，已成為替代治療和基因治療領(lǐng)域中極具應(yīng)用前景的干細(xì)胞。因此，研究MSCs的增殖、遷移、分化、組織修復(fù)、免疫調(diào)節(jié)功能具有十分重要的意義。研究顯示，天然免疫識別受體NLR家族部分成員與MSCs的功能有密切聯(lián)系[6-7]。

Figure 2. The flow cytometry results of cell surface markers on human umbilical cord mesenchymal stem cells at passage 3 (A) and passage 28 (B).

Kim等[6]證實hUCB-MSCs表達(dá)NLRs家族成員的NOD1和NOD2，且二者與MSCs成骨、脂肪分化和細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinases, ERK)介導(dǎo)的磷酸化有關(guān)。本實驗結(jié)果證實，23個NLR家族成員在連續(xù)培養(yǎng)傳代前后的hUC-MSCs中均有表達(dá)，其中NLRP1的 mRNA在連續(xù)培養(yǎng)傳代前后的表達(dá)差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。長期連續(xù)傳代培養(yǎng)后hUC-MSCs的成骨和脂肪分化能力降低與NOD1和NOD2的改變是否存在相關(guān)性有待進一步實驗證實。已知，NLRC5通過阻止NF-κB和IFN-I信號通路中IKKα和IKKβ的磷酸化而起負(fù)性調(diào)節(jié)作用[9]；NLRX1位于線粒體基質(zhì)中，參與針對細(xì)菌/病毒入侵的活性氧生成反應(yīng)[10-11]。NLRP10屬于抗炎家族，參與體內(nèi)炎癥反應(yīng)的精細(xì)調(diào)控[12-13]。hUC-MSCs經(jīng)長期培養(yǎng)后，其NLRC5和NLRX1表達(dá)基本不變，NLRP10的表達(dá)上升，這是否意味著長期培養(yǎng)后，hUC-MSCs對免疫反應(yīng)的負(fù)性調(diào)控和識別細(xì)菌/病毒入侵的能力保持不變，而抗炎能力加強，應(yīng)在臨床移植治療中對此更進一步的研究。CIITA主要表達(dá)于巨噬細(xì)胞，B、T淋巴細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞[14]，是MHC-II表達(dá)所需的重要轉(zhuǎn)錄因子[15]，Tse等[16]證實人MSCs不表達(dá)MHC-II，本實驗發(fā)現(xiàn)hUC-MSCs表達(dá)的 CIITA mRNA極低，可能是其不表達(dá)MHC-II的誘因之一。NLRP12主要表達(dá)于骨髓來源的細(xì)胞，對TLR介導(dǎo)的NF-κB活化具有負(fù)性調(diào)控作用[17]。連續(xù)傳代培養(yǎng)前后(第3和28代)，hUC-MSCs的NLRP12 mRNA表達(dá)量降低，是否意味著TLR介導(dǎo)的NF-κB活化程度、細(xì)胞對外界病原體的感知能力和炎癥反應(yīng)發(fā)生的可能性會隨著hUC-MSCs的傳代培養(yǎng)逐漸升高，有待進一步實驗驗證。

Figure 3. Osteogenic (A, B; alizarin red staining, ×100) and adipogenic (C, D; oil red O staining, ×100) differentiation of human umbilical cord mesenchymal stem cells at the 3rd (A, C) and 28th (B, D) passages.

Figure 4. The agarose gel electrophoretogram of PCR products of NLRs. 1～23：NOD1, NOD2, NLRC3, NLRC4, NLRC5, NLRP1, NLRP2, NLRP3, NLRP4, NLRP5, NLRP6, NLRP7, NLRP8, NLRP9, NLRP10, NLRP11, NLRP12, NLRP13, NLRP14, CIITA, NAIP, NLRX1 and APAF1, respectively; M: marker.

綜上所述，hUC-MSCs表達(dá)NLR家族所有成員的基因，不同成員之間的基因表達(dá)量存在較大差異。在培養(yǎng)傳代過程中，hUC-MSCs大多數(shù)NLR家族成員的基因表達(dá)呈下降趨勢，部分基因表達(dá)水平增加或無變化，提示體外連續(xù)傳代培養(yǎng)對hUC-MSCs表達(dá)NLR家族成員的影響是多向性的。因NLR家族不同成員及其信號通路與細(xì)胞的增殖分化、炎癥反應(yīng)、免疫調(diào)節(jié)功能等作用機制密切相關(guān)，可能反映長期培養(yǎng)對hUC-MSCs相關(guān)功能的影響，從而為hUC-MSCs的功能干預(yù)提供研究的靶標(biāo)，為改善培養(yǎng)細(xì)胞質(zhì)量，強化細(xì)胞功能指示方向。這些都必將有利于hUC-MSCs在組織工程和臨床移植治療中的應(yīng)用。

Figure 5. The mRNA expression of NLRs in passage 3 and passage 28 human umbilical cord mesenchymal stem cells. 1～23: NOD1, NLRC4, NLRC5, NLRP1, NLRP3, NLRP10, NAIP, NLRX1, APAF1, NOD2, NLRC3, NLRP2, NLRP4, NLRP5, NLRP6, NLRP7, NLRP8, NLRP9, NLRP11, NLRP12, NLRP13, NLRP14 and CIITA, respectively.Mean±SD.n=6.*P<0.05 vs passage 3.

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