倪 芳， 張玉俠， 汪心怡， 趙 華， 汪思應

(安徽醫(yī)科大學病理生理學教研室，安徽 合肥 230032)

MicroRNA(miRNA,miR)是一類長度為19～25個核苷酸的內源性非編碼RNA, 可以在轉錄水平或轉錄后水平調節(jié)基因的表達[1]。研究發(fā)現, miRNA不僅在細胞增殖、分化和凋亡等多種生理過程中發(fā)揮重要作用[2], 越來越多的研究表明, miRNA在包括惡性血液病在內的多種疾病發(fā)病中同樣發(fā)揮著重要作用[3-4]。盡管目前miRNA在白血病中的研究取得了一些進展，但仍有大量miRNA的功能是未知的。本研究中的miR-3666，其在白血病細胞中的表達及其相關功能至今尚未見報道，我們利用TargetScan軟件預測分析發(fā)現，miR-3666 與抑癌基因第10號染色體缺失的磷酸酶和張力蛋白同源基因(phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome ten,PTEN)的mRNA 3’端非翻譯區(qū)域(3’-untranslated region，3’UTR)存在3個結合位點，提示miR-3666 對PTEN的表達可能具有調控作用。本研究旨在進一步檢測miR-3666在白血病細胞中的表達，并驗證miR-3666對PTEN的靶向調控作用。

材 料 和 方 法

1 試劑

DMEM培養(yǎng)基、RPMI-1640培養(yǎng)基和熱滅活的胎牛血清購自Gibco；脂質體Lipofectamine 2000購自 Invitrogen；Amaxa Cell Line Nucleofector Kit V 購自Amaxa Biosystems；氯仿、乙醇和異丙醇 (分析純)均購自國藥集團化學試劑有限公司；DEPC(分析純)購自上海生工有限公司；Trizol購自Invitrogen；micro-RNA反轉錄試劑盒(miScript Reverse Transcription Kit)、hsa-miR-3666 及內參照RNU6B引物和microRNA定量PCR檢測試劑盒(miScript SYBR Green PCR Kit)均購自Qiagen；雙螢光素酶報告基因質粒psi-CHECK-2和雙螢光素酶報告基因測定系統(Dual-Luciferase Reporter Assay System)購自Promega；PTEN鼠抗人單克隆抗體購自Santa Cruz； HRP 標記的山羊抗鼠II抗購自北京中杉金橋生物公司。

2 細胞系和原代細胞培養(yǎng)

人胚腎細胞株HEK293T采用DMEM 培養(yǎng)基和10%胎牛血清培養(yǎng)；慢性粒細胞白血病細胞系K562細胞用含10% 胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。2種細胞系均由本實驗室長期保存。人原代白血病細胞分離自臨床初診未治的白血病病人外周血。

3 方法

3.1miRNA的提取及qRT-PCR Trizol提取細胞總RNA(含miRNA)，細胞的cDNA合成采用miScript Reverse Transcription Kit(含通用反向引物)(Qiagen)；正向引物購自Qiagen公司miScript Primer Assays。 按照miScript SYBR Green PCR Kit(Qiagen)說明書配制PCR反應液，混勻后置于Rotor Gene 3000實時定量PCR儀，進行miRNA的定量PCR測定，按下列條件擴增: 95 ℃預變性10 s；95 ℃ 5 s， 60 ℃ 34 s，40個循環(huán)。反應結束后，由電腦自動分析計算出模板的拷貝數，并進行相對定量分析。

3.2miRNA 模擬體及抑制體的合成 hsa-miR-3666(miRBase accession No.MI0016067)的模擬體(mi-mic)及陰性對照(negative control， NC)、FAM標記的miR-3666抑制體(inhibitor， FAM-anti-miR-3666) 及陰性對照(inhibitor NC，FAM-anti-miR-C)均由上海吉瑪生物公司設計合成。

3.3雙螢光素酶報告基因質粒的構建 GenBank中查找miR-3666靶基因PTEN3′UTR序列，由上海生工合成PTEN-WT 3’UTR(包含了整段預測miR-3666結合序列的上、下游各100 bp左右的片段)和PTEN-mutant 3’UTR(相比PTEN-WT 3’UTR缺失了整段預測的miR-3666結合序列)基因，且兩端具有XhoI 和NotI酶切位點；之后重組入雙螢光素酶報告基因質粒psiCHECK-2多克隆位點，分別獲得野生型及突變型克隆并測序鑒定正確性。

3.4細胞轉染和雙螢光素酶報告基因活性檢測 將HEK293T細胞接種到96孔板中，每孔5×103細胞，DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后用無抗生素的DEME-洗滌2次，按照Lipofectamine 2000說明書配制轉染試劑，將0.2 μg雙螢光素酶報告質粒及20 nmol/L終濃度的miRNA mimic或陰性對照共轉染HEK293T細胞，6 h后更換DMEM完全培養(yǎng)基，48 h后用Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega)檢測螢光素酶的活性。

3.5核轉染(nucleofection)實驗 根據Amaxa Cell Line Nucleofector Kit V 試劑盒說明書，用核轉染儀Nucleofector II (Amaxa Biosystems) 分別將FAM-anti-miR-3666 及陰性對照anti-miR-C轉入K562 白血病細胞系，方法如下:血細胞計數儀計數細胞，臺盼藍拒染實驗檢測細胞存活率后將1×106細胞用1.5 mL RPMI-1640完全培養(yǎng)基接種于12 孔培養(yǎng)板， 37 ℃、5%CO2孵箱中預熱。細胞移至1.5 mL Eppendorf管中，室溫下200×g離心10 min，棄上清，細胞用100 μL預熱到室溫的Nueleofector Solution V混懸，并加入200 pmol/L (10 μL) FAM-anti-miR-3666或FAM-anti-miR-C，轉移到Amaxa 核轉染杯的底部，避免產生氣泡，蓋上杯蓋。將核轉染儀的程序設置為T-16，并將核轉染杯放入杯孔中，按“X”鍵開始程序。結束后立即拿出轉染杯，并用Amaxa 標準吸管將細移至含有0.5 mL完全培養(yǎng)基的12 孔板中。20 h 后流式細胞術檢測FAM-anti-miR-3666 轉染K562 的效率，并收集轉染后的細胞，進行后續(xù)實驗。

3.6Western blotting檢測靶蛋白表達水平 收集上述不同轉染組的K562 細胞，加入蛋白裂解液，BCA法測定蛋白濃度。取40 μg 樣品蛋白質加入等體積上樣緩沖液，經SDS-PAGE后，用水浴式電轉儀轉至硝酸纖維素膜上。室溫封閉1 h，加入1∶500 稀釋的小鼠抗人PTEN單克隆抗體，4 ℃孵育過夜，TBST振搖漂洗10 min×3次，然后加入HRP標記的II抗，室溫孵育1 h，取出，TBST振搖漂洗10 min×4次，化學發(fā)光法檢測后分析結果。

4 統計學處理

數據以均數±標準差(mean±SD)表示, 均數間的比較采用單因素方差分析或t檢驗。SPSS 15.0 統計軟件分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 miR-3666 在白血病細胞中高表達

qRT-PCR 結果表明，與正常人外周血單個核細胞相比，白血病細胞系中miR-3666的表達明顯升高，尤其以K562細胞系中表達升高最為顯著,見圖1A；在臨床初診未治的人原代白血病細胞中，以慢性髓細胞性白血病(chronic myelognous leukemia, CML)細胞miR-3666表達升高最為顯著，見圖1B。

Figure 1. qRT-PCR analysis of miR-3666 expression in various leukemic cell lines (A) and human primary leukemic cells (B) compared to normal PBMC. Mean±SD. AML:n=6; ALL:n=8;CML:n=9.*P<0.05,**P<0.01 vs PBMC or normal.

2 生物信息學軟件預測miR-3666靶向PTEN基因3’UTR 序列

為了更好地研究miR-3666的生物學功能，我們通過TargetScan在線分析軟件(www.targetscan.org)，將microRNA名稱hsa-miR-3666輸入檢索框中，點擊“Submit”，系統預測出hsa-miR-3666可能的靶基因。結果發(fā)現其靶點非常廣泛，其中抑癌基因PTEN引起了我們的關注，PTEN3’UTR 含有3個miR-3666的結合位點,見圖2。

Figure 2. Predicted interaction between miR-3666 and the three putative binding sites in the PTEN 3’UTR.

3 miR-3666對PTEN基因3’UTR的調控

為了進一步證明miR-3666對PTEN基因的3’UTR具有直接調控作用，我們采用雙螢光素酶報告基因質粒psiCHECK-2，構建了包含靶基因 WT 3’UTR的野生型克隆(分別包含軟件預測的整段miR-3666結合序列)及包含靶基因 mutant 3’UTR(分別缺失了整段預測的miR-3666結合位點)的突變型克隆，并通過測序鑒定正確。雙螢光素酶報告基因實驗結果初步表明PTEN是miR-3666的潛在靶基因,見圖3A。此外我們發(fā)現：miR-3666能通過野生型PTEN3’UTR(binding site 1)抑制報告基因的活性，而且這種抑制作用是“miR-3666結合元件”依賴性的，在人為缺失突變該元件時(缺失了整段預測的miR-3666結合位點1)，miR-3666即不能對報告基因的活性產生抑制效應,見圖3B。以上結果表明PTEN是miR-3666的潛在靶基因之一。

Figure 3. Luciferase activity of various reporters in the presence or absence of miR-3666 mimic in HEK293T cells.A: dual-luciferase assay of HEK293T cells transfected with luciferase constructs containing the three putative miR-3666-binding sites (binding site 1, binding site 2 or binding site 3), synthetic mature miR-3666 (miR-3666) or synthetic control miRNA with a scrambled sequence (miR-C); B: dual-luciferase assay of HEK293T cells transfected with luciferase constructs containing wild-type 3’ UTR (WT 3’ UTR) or mutated 3’ UTR (mutant 3’UTR) (with deletion of the miR-3666-responsive element) from PTEN, plus miRNA (as in A).Mean±SD. n=3.**P<0.01 vs miR-C; ##P<0.01 vs miR-3666 in WT 3’UTR.

4 miR-3666調控K562白血病細胞中PTEN蛋白的表達

轉染FAM-anti-miR-3666 組，PTEN蛋白水平明顯上調,見圖4。這表明PTEN的表達受miR-3666的調控。

討 論

白血病的發(fā)生機制復雜，近年來研究發(fā)現很多功能基因(尤其是癌基因、抑癌基因或轉錄因子)的時空、量的表達差異或突變不僅參與白血病等腫瘤發(fā)病，還參與調控腫瘤細胞惡性生物學行為，如p53、PTEN及Her2等基因表達異?；蛲蛔兣c多種腫瘤的惡性生物學行為有關[5-7]。PTEN是1997年發(fā)現的編碼具有脂質磷酸酶和蛋白磷酸酶活性的抑癌基因，具有雙重腫瘤抑制功能。大量的研究顯示，在多種實體瘤中存在PTEN基因的突變或低表達，從而影響其腫瘤抑制功能。近年來PTEN在白血病發(fā)病中的作用逐漸受到重視，PTEN蛋白可以通過其磷酸酶活性抑制多種信號通路，參與白血病的發(fā)生發(fā)展。多項研究表明，PTEN基因在白血病中突變罕見，但存在不同程度的缺失和低表達，然而，PTEN基因的表達調控的機制還很不清楚[7]。

近年來發(fā)現的miRNA參與多種功能基因的表達調控，它可通過識別靶基因mRNA 的 3’UTR，并與之結合，抑制翻譯或導致mRNA 降解，從而抑制靶基因的表達[8-9]。目前,已有研究表明某些表達失調的miRNA與白血病的發(fā)生發(fā)展密切相關，也有與急性髓細胞白血病、慢性淋巴細胞白血病和霍奇金淋巴瘤的細胞遺傳學以及臨床治療結果有關的miRNA表達標簽的報道[10-14]。

本研究報道的miR-3666，我們首次發(fā)現其在人白血病細胞中顯著高表達，并進一步通過雙螢光素酶報告基因實驗證實了PTEN是miR-3666的潛在靶基因，并且證明在白血病細胞中下調miR-3666后，可以促進PTEN蛋白的表達，表明在白血病細胞中，可能由于miR-3666的高表達，抑制了抑癌基因PTEN的表達，從而促進白血病的發(fā)生和發(fā)展。因此，miR-3666上調可能是白血病發(fā)生發(fā)展的機制之一, 也為白血病的治療提供了新的思路。

[參 考 文 獻]

[1] Bartel DP. MicroRNAs:genomics, biogenesis, mechanism, and function[J]. Cell, 2004, 116(2): 281-297.

[2] Cheng AM, Byrom MW, Shelton J, et al. Antisense inhibition of human miRNAs and indications for an involvement of miRNA in cell growth and apoptosis [J]. Nucleic Acids Res, 2005, 33(4):1290-1297.

[3] Zhou XX, Wang X. Role of microRNAs in chronic lymphocytic leukemia [J]. Mol Med Rep, 2013,8(3):719-725.

[4] So AY, Zhao JL, Baltimore D.The Yin and Yang of microRNAs: leukemia and immunity [J]. Immunol Rev, 2013, 253(1):129-145.

[5] Sanefuji K, Taketomi A, Iguchi T, et al.Significance of DNA polymerase delta catalytic subunit p125 induced by mutant p53 in the invasive potential of human hepatocellular carcinoma[J]. Oncology, 2010, 79(3-4):229-237.

[6] Scaltriti M, Eichhorn PJ, Cortés J, et al .Cyclin E amplification/overexpression is a mechanism of trastuzumab resistance in HER2+breast cancer patients[J].Proc Natl Acad Sci U S A, 2011,108(9):3761-3766.

[7] Wrighton KH.Cancer biology: role of nuclear PTEN revealed [J].Nat Rev Mol Cell Biol, 2011, 12(3):134.

[8] Ambros V． The functions of animal microRNAs[J]． Nature，2004，431(7006): 350-355．

[9] Carthew RW，Sontheimer EJ． Origins and mechanisms of miRNAs and siRNAs[J].Cell,2009,136(4): 642-655．

[10] Calin GA, Ferracin M, Cimmino A,et al. A microRNA signature associated with prognosis and progression in chronic lymphocytic leukemia [J]. N Engl J Med, 2005, 353(17):1793-1801.

[11] Garzon R, Volinia S, Liu CG, et al. MicroRNA signatures associated with cytogenetics and prognosis in acute myeloid leukemia [J]. Blood, 2008, 111(6): 3183-3189.

[12] Garzon R, Garofalo M, Martelli MP, et al. Distinctive microRNA signature of acute myeloid leukemia bearing cytoplasmic mutated nucleophosmin [J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2008, 105(10): 3945-3950.

[13] Navarro A, Gaya A, Martinez A, et al. MicroRNA expression profiling in classical Hodgkin lymphoma[J]. Blood, 2008, 111(5): 2825-2832.

[14] Zhu DX, Miao KR, Fang C, et al. Aberrant microRNA expression in Chinese patients with chronic lymphocytic leukemia [J]. Leuk Res, 2011, 35(6):730-734.