張 運(yùn), 王莉莉, 趙 茜, 馬士程, 賀茂林

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京世紀(jì)壇醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，北京 100038)

星形膠質(zhì)細(xì)胞(astrocyte, AS) 是中樞神經(jīng)系統(tǒng)具有免疫吞噬功能的細(xì)胞, 它在致炎因素作用下被激活?；罨腁S既具有保護(hù)神經(jīng)元的作用, 又能分泌細(xì)胞毒因子、炎癥因子、補(bǔ)體蛋白而損害神經(jīng)元。近年來, 神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞功能受到研究者的普遍重視[1-2]。 它與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān), 如阿爾茨海默病、腦血管病、帕金森氏病等，大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為AS活化引起的炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激可能是上述疾病的重要病理機(jī)制之一[3-4]。核因子κB(nuclear factor-kappa B, NF-κB)是一種廣泛存在于體內(nèi)多種細(xì)胞的核轉(zhuǎn)錄因子, 參與多種疾病病理生理、多種基因調(diào)控、機(jī)體免疫應(yīng)答和細(xì)胞凋亡的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程[5]。大量研究證實(shí)，NF-κB可通過活化星形膠質(zhì)細(xì)胞與小膠質(zhì)細(xì)胞，誘發(fā)炎癥反應(yīng)與氧化應(yīng)激，從而引起神經(jīng)元損傷、凋亡[5-6]。G蛋白偶聯(lián)受體激酶5 (G-protein-coupled receptor kinase 5, GRK5) 是調(diào)節(jié)G蛋白偶聯(lián)受體(G-protein-coupled receptors,GPCRs)的一類絲蘇氨酸激酶, 其主要功能是使激活的GPCRs 脫敏, 從而中止后者介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[7]。近年研究報(bào)道，GRK5能通過誘導(dǎo)NF-κB抑制劑IκBα的高表達(dá)而抑制NF-κB[8]。本實(shí)驗(yàn)通過研究對(duì)大鼠皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞GRK5基因沉默后NF-κB表達(dá)變化及其與膠質(zhì)細(xì)胞活化、炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激的關(guān)系，探討GRK5對(duì)NF-κB相關(guān)膠質(zhì)細(xì)胞活化產(chǎn)生影響的可能機(jī)制，為神經(jīng)炎性疾病研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 材料

新生24 h內(nèi)的Wistar大鼠(SPF級(jí)), 由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)自Gibco。N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine, NAC)、DMSO、MgATP和HEPES購(gòu)自Sigma。BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)自Pierce。硝酸纖維素膜購(gòu)自Millipore。GRK5抗體和IκBα抗體購(gòu)自Santa Cruz。、膠質(zhì)細(xì)胞原纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein, GFAP)抗體、活化半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(caspase-3)抗體、 p65抗體及β-actin抗體購(gòu)自Sigma。Ⅱ抗購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。 LipofectamineTMRNAiMAX購(gòu)于Invitrogen。大鼠腫瘤壞死因子α (tumor necrosis factor α, TNF-α) ELISA 試劑盒購(gòu)自BD Pharmigen; 一氧化氮(nitric oxide, NO)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Promega。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)試劑盒為南京建成生物工程研究所產(chǎn)品。

2 體外培養(yǎng)大鼠皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞

消毒斷頭, 取出大腦, 剝?nèi)ボ浤X膜, 分離出大腦皮層, 剪碎后用0.125%胰酶消化,將細(xì)胞數(shù)調(diào)整為(3～5)×108/L 種植于培養(yǎng)瓶?jī)?nèi), 在37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng), 每3～4 d換液1次, 見細(xì)胞長(zhǎng)成致密單層后進(jìn)行傳代培養(yǎng)、篩選、純化, 用免疫組化法檢測(cè)GFAP陽性細(xì)胞達(dá)95%以上時(shí)可進(jìn)行實(shí)驗(yàn)檢測(cè)[9]。

3 實(shí)驗(yàn)分組

3.1GRK5基因沉默 將細(xì)胞接種于涂有多聚賴氨酸蓋玻片的24孔培養(yǎng)板，并加入DMEM培養(yǎng)液進(jìn)行siRNA轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。4 μL LipofectamineTMRNAiMAX和5 μL 20 μmol/L siRNA分別加入100 μL Opti-MEM中并靜置5 min。將2種溶液混合后再于室溫靜置20 min。將混合液加入培養(yǎng)的細(xì)胞中, 混勻。采用Western blotting檢測(cè)siRNA干擾效率。GRK5 siRNA以及control siRNA由Dharmacon公司合成。GRK5 siRNA的干擾序列為 5’-AAG CCG UGC AAA GAA CUC UUU-3’; control siRNA的干擾序列為 5’-AAU UCU CCG AAC GUG UCA CGU-3’。

3.2NAC干預(yù) 參照文獻(xiàn)用含5 mmol/L NF-κB抑制劑NAC的DMEM培養(yǎng)液培育24 h，給予置換培養(yǎng)液[10]。

3.3分組 按照RNA干擾沉默GRK5與加入NF-κB抑制劑NAC干預(yù)的不同，可分為4組：(1)control siRNA處理的對(duì)照組;(2)control siRNA+NAC的NF-κB抑制組;(3)GRK5 siRNA處理的GRK5 siRNA組;(4)GRK5 siRNA處理+NAC的GRK5 siRNA+NF-κB抑制組。

4 培養(yǎng)細(xì)胞分泌TNF-α和NO濃度的檢測(cè)

收集各組細(xì)胞培養(yǎng)的上清,離心去除細(xì)胞碎片,采用雙抗體夾心ELISA 法, 按TNF-α的ELISA 檢測(cè)試劑盒說明檢測(cè)上清中TNF-α濃度。采用常規(guī)Griess法測(cè)定培養(yǎng)細(xì)胞上清中NO濃度, 在檢測(cè)前離心去除細(xì)胞碎片,按NO的檢測(cè)試劑盒說明進(jìn)行操作檢測(cè)。標(biāo)準(zhǔn)溶液用DMEM(+10%FBS) 溶液進(jìn)行稀釋和配制，濃度為(μmol/L): 0、1、2、5、10、20、40、60和100，樣品為細(xì)胞培養(yǎng)液上清。每孔分別加上述溶液、Griess reagent Ⅰ和Griess Reagent Ⅱ溶液各50 μL。即刻用酶標(biāo)儀在540 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得出相應(yīng)的數(shù)值。

5 SOD活性的測(cè)定

作用終止后,吸去培養(yǎng)液, 以冰生理鹽水洗滌細(xì)胞2次, 用細(xì)胞刮板刮下細(xì)胞, 冰生理鹽水收集, 在冰浴中用超聲細(xì)胞破碎儀破碎細(xì)胞, 顯微鏡下觀察無完整細(xì)胞后, 應(yīng)用自動(dòng)生化分析儀和紫外分光光度計(jì)嚴(yán)格按照試劑盒說明測(cè)定細(xì)胞內(nèi)SOD 活性, 結(jié)果分別以103U/(g protein)表示。

6 p65、TNF-α、IL-1β及誘導(dǎo)型NO合成酶(indu-cible nitric oxide synthase, iNOS) mRNA 的測(cè)定

利用Trizol 法提取細(xì)胞RNA, 用紫外分光光度計(jì)測(cè)量總RNA 的A260和A280值, 計(jì)算RNA的濃度和純度。取1 μg總RNA, 以O(shè)ligo dT 為引物, 按Fermentas 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書要求先將mRNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以1 μL cDNA 為模板, 在25 μL real-time PCR 體系, 于ABI PRISM 7000實(shí)時(shí)定量PCR儀上進(jìn)行基因擴(kuò)增(95 ℃ 30 s; 59 ℃ 60 s; 72 ℃ 30 s), 共35個(gè)循環(huán); 72 ℃ 10 min。實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)記錄熒光強(qiáng)度。擴(kuò)增完畢后進(jìn)行熔解曲線分析。每個(gè)樣品重復(fù)3遍?；虮磉_(dá)變化倍數(shù)采用2-ΔΔCt法進(jìn)行比較，管家基因GAPDH作為內(nèi)對(duì)照, ΔCt=Ct目的基因-Ct管家基因, ΔΔCt=ΔCt實(shí)驗(yàn)組-ΔCt對(duì)照組。

引物采用Primer Premier 5.0進(jìn)行設(shè)計(jì), IL-1β上游引物 5’-CTC CAT GAG CTT TGT ACA AGG-3’, 下游引物 5’-TGC TGA TGT ACC AGT TGG GG-3’, 擴(kuò)增片段長(zhǎng)度245 bp; TNF-α上游引物 5’-TGA ACT TCG GGG TGA TCG GTC-3’, 下游引物 5’-AGC CTT GTC CCT TGA AGA GAA C-3’,擴(kuò)增片段長(zhǎng)度295 bp; iNOS上游引物 5’-CCA AGA ACG TGT TCA CCA TG-3’, 下游引物 5’-GAT GTC CAG GAA GTA GGT GAG G-3’,擴(kuò)增片段長(zhǎng)度317 bp; p65上游引物 5’-CAA GTG CCT TAA TAG CAG GGC AAA-3’, 下游引物 5’-AGA GCT AGA AAG AGC AAG AGT CCA AT-3’, 擴(kuò)增片段長(zhǎng)度249 bp; GAPDH上游引物 5’-TGA AGC AGG CAT CTG AGG G-3’, 下游引物 5’-CGA AGG TGG AAG AGT GGG AG-3’, 擴(kuò)增片段長(zhǎng)度347 bp。

7 免疫熒光檢測(cè)GFAP與活化caspase-3的表達(dá)

經(jīng)多聚甲醛固定后的各組細(xì)胞, 采用免疫熒光染色。0.2% Triton X-100處理10 min, 并用10% 牛血清白蛋白室溫孵育1 h 封閉無關(guān)抗原。加入Ⅰ抗4 ℃孵育24 h, PBS 充分漂洗后, 加入標(biāo)記有熒光染料的Ⅱ抗中室溫孵育1 h。Ⅰ抗包括兔來源抗GFAP抗體和羊來源抗活化caspase-3抗體 (Sigma)；Ⅱ抗包括羊抗兔FITC 和兔抗羊TRITC(北京中杉金橋)。陰性對(duì)照以PBS代替I抗。DAPI(Sigma)用于染細(xì)胞核。倒置熒光顯微鏡采集圖片。

熒光顯微鏡下觀察。GFAP為綠色熒光，caspase-3為紅色熒光。利用Image-Pro Plus圖像分析系統(tǒng)測(cè)定所選區(qū)域caspase-3+細(xì)胞個(gè)數(shù)，并求得其占區(qū)域內(nèi)總體細(xì)胞(DAPI+)百分比。

8 細(xì)胞蛋白的提取以及Western blotting檢測(cè)蛋白表達(dá)

倒掉培養(yǎng)液, 用0.01 mol/L PBS 清洗2次后, 加上2 mL 0.01 mol/L PBS后放冰上孵育5 min, 將PBS倒掉甩干, 加入100 μL細(xì)胞裂解液(50 mmol/L Tris-HCl，pH 6.8，10 mmol/L EDTA，2% SDS，5 mmol/L DTT，0.5 mmol/L PMSF) 混勻后, 放冰上孵育15 min, 將裂解液刮下, 吸入EP管中, 12 000×g離心5 min(4 ℃)后提取上清液。BCA試劑盒定量蛋白。取等量樣本總蛋白, 加入5× SDS loading buffer, 混勻后煮沸5 min, 10% SDS-PAGE電泳分離, 電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜(300 V, 1 h), 含5%脫脂奶粉的TBST封閉,分別加入GRK5抗體(1∶200)、p65抗體(1∶500)、 IκBα抗體(1∶200)及β-actin(1∶5 000)Ⅰ抗, 4 ℃過夜。次日TBST洗膜, 辣根過氧化物酶標(biāo)記的Ⅱ抗室溫孵育1 h, TBST洗膜, ECL顯示特異條帶。β-actin抗體作為內(nèi)參照。利用柯達(dá)數(shù)碼1D軟件對(duì)每個(gè)條帶灰度進(jìn)行定量分析。

9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。采用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件包處理。所有數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)。兩組樣本均數(shù)比較采用兩個(gè)獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn),多組間比較采用單因素方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

倒置顯微鏡下, 初接種的細(xì)胞呈球形, 4～6 h后開始貼壁, 伸出突起, 成片狀聚集生長(zhǎng)。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng), 細(xì)胞體積逐漸增大, 突起伸長(zhǎng)。傳代3次以后,細(xì)胞形態(tài)趨于一致, 以纖維性星形膠質(zhì)細(xì)胞為主。胞體相對(duì)較小, 但突起較長(zhǎng)，見圖1A。

2 RNA干擾沉默GRK5基因后其蛋白的表達(dá)

將細(xì)胞克隆接種于涂有多聚賴氨酸蓋玻片的24孔培養(yǎng)板，并加入DMEM培養(yǎng)液進(jìn)行siRNA轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。Western blotting檢測(cè)發(fā)現(xiàn)經(jīng)GRK5基因沉默后細(xì)胞內(nèi)GRK5蛋白表達(dá)較對(duì)照組顯著減少,見圖1B。

3 免疫熒光法檢測(cè)各組星形膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)及凋亡率

對(duì)經(jīng)過不同干預(yù)后的各組星形膠質(zhì)細(xì)胞用免疫熒光法進(jìn)行鑒定并檢測(cè)其凋亡率。與對(duì)照組相比, NF-κB抑制組細(xì)胞GFAP熒光強(qiáng)度明顯減弱，突起減少;GRK5 siRNA組細(xì)胞總數(shù)未見明顯差異，但是細(xì)胞GFAP熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，胞體肥大，突起增多;GRK5 siRNA+NAC組與對(duì)照組相比細(xì)胞形態(tài)及突起數(shù)量則無明顯變化;GRK5 siRNA組與NF-κB抑制組及GRK5 siRNA+NAC組相比GFAP熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，胞體肥大，突起增多，見圖2A。

NF-κB抑制組中表達(dá)活化caspase-3的細(xì)胞顯著少于對(duì)照組(P<0.05)；GRK5 siRNA組活化caspase-3明顯高于對(duì)照組(P<0.01)；而GRK5 siRNA+NAC組表達(dá)活化caspase-3的細(xì)胞比率明顯低于GRK5 siRNA組(P<0.01)，與對(duì)照組無明顯差異(P>0.05), 但是仍然顯著高于NF-κB抑制組(P<0.01)，見圖2A、B。上述結(jié)果表明抑制NF-κB可使星形膠質(zhì)細(xì)胞凋亡減少，而GRK5基因沉默可導(dǎo)致星形膠質(zhì)細(xì)胞凋亡增加。盡管向GRK5 siRNA組細(xì)胞培養(yǎng)液中加入NF-κB抑制劑NAC能部分減少凋亡, 但是與NF-κB抑制組比較仍存在顯著差異。

Figure 1. Morphology of the cultured astrocytes from brain cortex of newborn Wistar rats (A) and expression of GRK5 protein after GRK5 gene silencing. Scale bar=50 μm.

4 各組星形膠質(zhì)細(xì)胞中p65、TBF-α、IL-1β及iNOS mRNA的表達(dá)

實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn), NF-κB抑制組細(xì)胞p65 mRNA水平顯著低于對(duì)照組(P<0.01)；GRK5 siRNA組細(xì)胞中p65 mRNA水平顯著高于對(duì)照組(P<0.01)；而GRK5 siRNA+NAC組p65 mRNA水平顯著低于對(duì)照組和GRK5 siRNA組(P<0.05或P<0.01)，但是仍然顯著高于NF-κB抑制組 (P<0.01)，見圖2C。這表明GRK5基因沉默可導(dǎo)致星形膠質(zhì)細(xì)胞NF-κB表達(dá)增加。

與此同時(shí)，NF-κB抑制組細(xì)胞TNF-α、IL-1β及iNOS mRNA水平低于對(duì)照組(P<0.05或P<0.01);GRK5基因沉默可顯著增加細(xì)胞中TNF-α、IL-1β及iNOS mRNA水平(P<0.01)；而GRK5 siRNA+NAC組上述細(xì)胞因子mRNA水平顯著低于GRK5 siRNA組(P<0.01)，與對(duì)照組無明顯差異(P>0.05), 但是仍然顯著高于NF-κB抑制組(P<0.01)，見圖2C。這表明GRK5基因沉默可導(dǎo)致星形膠質(zhì)細(xì)胞炎癥因子顯著升高。

Figure 2. Identification of the cultured astrocytes, and the expression of activated caspase-3 and the mRNA levels of NF-κB p65, TNF-α, IL-1β and iNOS in the astrocytes. A: expression of GFAP (a～d) and activated caspase-3 (e～h) detected by immunofluorescence staining; B: semi-quantitative analysis of the ratio of activated caspase-3-positive cells to DAPI-positive cells; C: the mRNA levels of NF-κB p65, TNF-α, IL-1β and iNOS detected by real-time PCR. Scale bar=50 μm. Mean+SD. n=6. *P<0.05, **P<0.01 vs control siRNA group; &&P<0.01 vs GRK5 siRNA group; ##P<0.01 vs control siRNA +NAC group.

5 各組星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌TNF-α、NO濃度的檢測(cè)與SOD活性的測(cè)定

ELISA檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組的星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌處于較低水平的TNF-α和NO;NF-κB抑制劑NAC能降低TNF-α和NO分泌 (P<0.01);GRK5基因沉默后細(xì)胞分泌TNF-α和NO水平顯著高于對(duì)照組(P<0.01)；雖然GRK5 siRNA+NAC組TNF-α和NO水平與GRK5 siRNA組相比均顯著降低(P<0.01)，但仍然高于對(duì)照組(TNF-αP<0.01, NOP<0.05)，且顯著高于NF-κB抑制組(P<0.01),見圖3A、B，可見GRK5基因沉默可以刺激星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌NO和TNF-α。

Figure 3. Effects of GRK5 siRNA on the secretion of TNF-α (A) and NO (B) and the activity of SOD (C) in astrocytes. Mean±SD. n=6. *P<0.05, **P<0.01 vs control siRNA group; &P<0.05， &&P<0.01 vs GRK5 siRNA group; ##P<0.01 vs control siRNA+NAC group.

酶活性檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，NF-κB抑制組SOD活性明顯高于對(duì)照組(P<0.01);GRK5基因沉默后細(xì)胞SOD活性顯著低于對(duì)照組(P<0.01);雖然GRK5 siRNA+NAC組SOD活性與GRK5 siRNA組相比明顯升高(P<0.05)，但仍顯著低于對(duì)照組(P<0.01)與NF-κB抑制組(P<0.01)，見圖3C，可見GRK5基因沉默可抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)SOD活性。

6 各組細(xì)胞中GRK5、p65及IκBα的表達(dá)

Western blotting檢測(cè)發(fā)現(xiàn)NF-κB抑制劑NAC處理膠質(zhì)細(xì)胞后不影響GRK5表達(dá), 但可導(dǎo)致IκBα表達(dá)增加及p65表達(dá)減少(P<0.01)。GRK5基因沉默后GRK5表達(dá)低于對(duì)照組，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，同時(shí)IκBα蛋白表達(dá)較對(duì)照組顯著降低, p65蛋白表達(dá)較之對(duì)照組顯著增加(P<0.01)。與GRK5基因沉默組比較，GRK5 siRNA+NAC組GRK5表達(dá)無明顯改變。與GRK5 siRNA組相比較，GRK5 siRNA+NAC組能增加IκBα蛋白表達(dá), 減少p65蛋白表達(dá)水平(P<0.05)，其p65蛋白表達(dá)水平與對(duì)照組無明顯差異(P>0.05)，但二者與NF-κB抑制組比較仍存在顯著差異(P<0.01)，見圖4。上述結(jié)果表明GRK5基因沉默可能抑制IκBα蛋白的表達(dá)，從而增加NF-κB蛋白表達(dá)。

Figure 4. Western blotting assay for GRK5, IκBα and p65 protein expression. Mean±SD. n=6. **P<0.01 vs control siRNA group; &P<0.05 vs GRK5 siRNA group; ##P<0.01 vs control siRNA+NAC group.

討 論

星形膠質(zhì)細(xì)胞與神經(jīng)元之間存在復(fù)雜的相互作用, 以維持神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。當(dāng)中樞神經(jīng)系統(tǒng)遭遇炎癥、缺血、損傷時(shí)，AS從靜息狀態(tài)快速轉(zhuǎn)變?yōu)榛罨癄顟B(tài), 激活后AS對(duì)神經(jīng)元的影響包括兩方面: (1)通過分泌大量的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、細(xì)胞因子和基質(zhì)分子促進(jìn)軸突再生, 保護(hù)神經(jīng)元免受損傷, 有利于損傷后神經(jīng)元的功能恢復(fù); (2)可產(chǎn)生細(xì)胞炎癥因子、補(bǔ)體、氧自由基等, 啟動(dòng)炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激，促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的損傷和死亡, 加重疾病進(jìn)程[11]。 而NF-κB是介導(dǎo)許多免疫與炎癥反應(yīng)的中心物質(zhì)。大量研究證實(shí)，NF-κB可通過活化AS與小膠質(zhì)細(xì)胞，誘發(fā)炎癥反應(yīng)與氧化應(yīng)激，從而引起神經(jīng)元損傷、凋亡[5-6]。近年研究報(bào)道，GRK5敲除小鼠老化時(shí)表現(xiàn)出β-淀粉樣蛋白生成增加,誘發(fā)炎癥反應(yīng)并引起細(xì)胞凋亡[12]。更有研究發(fā)現(xiàn)GRK5能通過誘導(dǎo)IκBα表達(dá)增高,從而抑制NF-κB的表達(dá)[8]，提示GRK5可能參與NF-κB激活星形膠質(zhì)細(xì)胞及引起的相關(guān)反應(yīng)。

已知IκBα是NF-κB的抑制蛋白。在靜息狀態(tài)下，染色體區(qū)域維持蛋白1(chromosome region maintenance 1, CRM-1)通過識(shí)別IκBα C末端的核轉(zhuǎn)出序列(nuclear exporting sequence, NES)將IκBα/NF-κB復(fù)合體轉(zhuǎn)出細(xì)胞核，NF-κB的p65和p50亞單位以失活狀態(tài)存在于細(xì)胞質(zhì)中[8]。當(dāng)上游信號(hào)激活I(lǐng)κB激酶(IκB kinase，IKK)后，活化的IKK會(huì)泛素化、磷酸化并降解IκBα，使得NF-κB 2個(gè)亞單位從失活狀態(tài)活化，并從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)(尤其是p65亞單位)，與相應(yīng)的炎癥相關(guān)基因結(jié)合，啟動(dòng)炎癥細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄，誘發(fā)炎癥[5-6]。研究報(bào)道GRK5同源調(diào)節(jié)域能與IκBα N末端相結(jié)合，掩蓋了IκBα C末端NES功能區(qū)，使得IκBα/NF-κB復(fù)合體在核內(nèi)聚集，抑制了NF-κB的活化[8]。本研究通過Western blotting檢測(cè)發(fā)現(xiàn)將培養(yǎng)膠質(zhì)細(xì)胞GRK5基因沉默后，IκBα表達(dá)減弱，p65亞單位表達(dá)增強(qiáng)。該結(jié)果表明GRK5基因沉默可引起星形膠質(zhì)細(xì)胞NF-κB活化，推測(cè)GRK5基因沉默解除了對(duì)IκBα C末端NES功能區(qū)的抑制，IκBα可順利轉(zhuǎn)出細(xì)胞核，易于被降解失活，從而激活NF-κB。

已有大量研究證實(shí)，TNF-α等炎癥因子的分泌可活化星形膠質(zhì)細(xì)胞?；罨男切文z質(zhì)細(xì)胞在損傷早期也可加快釋放致炎因子如TNF-α和IL-1β, 進(jìn)一步激活NF-κB，加重炎癥變化[5-6]。本實(shí)驗(yàn)熒光顯微鏡下觀察到GRK5 siRNA組GFAP熒光強(qiáng)度增強(qiáng)、胞體肥大、突起增多,形態(tài)學(xué)上提示星形膠質(zhì)細(xì)胞活化[13]。此外，實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，GRK5基因沉默刺激膠質(zhì)細(xì)胞TNF-α、IL-1β和iNOS mRNA表達(dá)水平增高，結(jié)合檢測(cè)到該組膠質(zhì)細(xì)胞IκBα表達(dá)減弱，p65亞單位表達(dá)增多，推測(cè)與NF-κB活化刺激相關(guān)炎癥因子表達(dá)增加有關(guān)[14]。收集各組細(xì)胞培養(yǎng)上清后，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)GRK5基因沉默刺激膠質(zhì)細(xì)胞分泌TNF-α增多，表明GRK5基因沉默誘發(fā)了炎癥反應(yīng)，而炎癥反應(yīng)也可加劇AS活化、激活NF-κB，從而進(jìn)一步分泌炎癥因子。本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)GRK5基因沉默刺激膠質(zhì)細(xì)胞分泌NO增多，且酶活性檢測(cè)結(jié)果顯示，SOD活性降低。SOD是自由基清除酶,GRK5基因沉默后SOD活性下降，也反映出膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)源性抗氧化能力下降，結(jié)合檢測(cè)到細(xì)胞內(nèi)iNOS mRNA表達(dá)增多，表明GRK5基因沉默誘發(fā)了氧化應(yīng)激反應(yīng)，可能與AS活化或NF-κB活性增強(qiáng)相關(guān)。研究顯示，活化的星形膠質(zhì)細(xì)胞可誘導(dǎo)iNOS表達(dá)增多,產(chǎn)生的一氧化氮導(dǎo)致過亞硝酸鹽生成和氧化應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致神經(jīng)元損傷和凋亡[15]。亦有研究報(bào)道，NF-κB可通過上調(diào)環(huán)氧化酶2增加有害自由基的產(chǎn)生[16]。Caspase家族是調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵成員, 它的級(jí)聯(lián)激活引發(fā)細(xì)胞發(fā)生凋亡特異改變, 并最終崩解。Caspase-3是caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)中最關(guān)鍵的效應(yīng)蛋白酶, 通常以酶原的形式存在, 激活后通過酶解其特異性底物, 使細(xì)胞發(fā)生凋亡[17]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)GRK5基因沉默后活性caspase-3表達(dá)增多，NF-κB抑制使得活性caspase-3表達(dá)顯著減少。而GRK5基因沉默聯(lián)合NAC抑制組活化caspase-3的表達(dá)明顯低于GRK5 siRNA組，與對(duì)照組無明顯差異, 但是仍然顯著高于NF-κB抑制組。提示星形膠質(zhì)細(xì)胞GRK5基因正常表達(dá)可能通過抑制caspase-3的活化而發(fā)揮抗凋亡作用。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，GRK5基因沉默可能通過刺激NF-κB表達(dá)增多引起星形膠質(zhì)細(xì)胞活化。推測(cè)GRK5的正常表達(dá)可通過抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞活化發(fā)揮抗炎癥反應(yīng)、抗氧化作用。星形膠質(zhì)細(xì)胞在神經(jīng)變性病的發(fā)病機(jī)制中有著不可忽視的作用,如何調(diào)控膠質(zhì)細(xì)胞的功能使其向保護(hù)神經(jīng)元的方向發(fā)展值得深入探索。

[參 考 文 獻(xiàn)]

[1] Ridet JL, Malhotra SK, Privat A, et al. Reactive astrocytes: cellular and molecular cues to biological function[J]. Trends Neurosci, 1997, 20(12): 570-577.

[2] 陳 賽，蔡詩(shī)達(dá)，張 楚，等. TRPM2通道在星形膠質(zhì)細(xì)胞氨中毒中的作用[J]. 中國(guó)病理生理雜志, 2013, 29(6):1039-1045.

[3] Emerit J, Edeas M, Bricaire F. Neurodegenerative diseases and oxidative stress[J].Biomed Pharmaother, 2004, 58(1): 39- 46.

[4] 劉付寧，紀(jì)風(fēng)濤，何惠燕，等. 右美托咪定對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷后星形膠質(zhì)細(xì)胞的影響[J].中國(guó)病理生理雜志, 2012, 28(10):1751-1755.

[5] Mattson MP, Camandola S. NF-κB in neuronal plasticity and neurodegenerative disorders[J]. J Clin Invest,2001, 107(3):247-254.

[6] Schwaninger M, Sallmann S, Petersen N, et al. Bradykinin induces interleukin-6 expression in astrocytes through activation of nuclear factor-κB[J]. J Neurochem, 1999, 73(4):1461-1466.

[7] Daigle TL, Caron MG. Elimination of GRK2 from cholinergic neurons reduces behavioral sensitivity to muscarinic receptor activation[J]. J Neurosci, 2012, 32(33):11461-11466.

[8] Sorriento D, Ciccarelli M, Santulli G, et al. The G-protein-coupled receptor kinase 5 inhibits NFκB transcriptio-nal activity by inducing nuclear accumulation of IκBα[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2008, 105(46):17818-17823.

[9] 常 利，張博愛，賈延劼，等. P2Y1受體介導(dǎo)Aβ25-35所致大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞活化[J]. 中國(guó)病理生理雜志, 2011, 27(1): 67-71.

[10] Islam KN, Koch WJ. Involvement of nuclear factor κB (NF-κB) signaling pathway in regulation of cardiac G protein-coupled receptor kinase 5 (GRK5) expression[J]. J Biol Chem, 2012, 287(16):12771-12778.

[11] Kuchibhotla KV, Lattarulo CR, Hyman BT, et al. Synchronous hyperactivity and intercellular calcium waves in astrocytes in Alzheimer mice[J]. Science, 2009, 323(5918): 1211-1215.

[12] Suo Z, Cox AA, Bartelli N, et al. GRK5 deficiency leads to early Alzheimer-like pathology and working memory impairment[J]. Neurobiol Aging, 2007, 28(12):1873-1888.

[13] Sofroniew MV. Molecular dissection of reactive astrogliosis and glial scar formation[J]. Trends Neurosci, 2009,32(12):638-647.

[14] Shen HM, Pervaiz S. TNF receptor superfamily-induced cell death: redox-dependent execution[J]. FASEB J, 2006, 20(10):1589-1598.

[15] Saha RN, Pahan K. Signals for the induction of nitric oxide synthase in astrocytes[J]. Neurochem Int, 2006, 49(2):154-163.

[16] Lio D, Annoni G, Licastro F, et al. Tumor necrosis factor-alpha -308A/G polymorphism is associated with age at onset of Alzheimer’s disease[J]. Mech Ageing Dev, 2006,127(6):567-571.

[17] Yang X, Stennicke HR, Wang B, et al. Granzyme B mimics apical caspases. Description of a unified pathway for trans-activation of executioner caspase-3 and -7[J]. J Biol Chem, 1998, 273(51):34278-34283.