沈 凱， 陳 芬， 林卓明， 陳士良， 袁國裕， 劉曉光△

(溫州醫(yī)科大學(xué)附屬舟山醫(yī)院 1心血管內(nèi)科, 2細(xì)胞分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，浙江 舟山 316004)

血管重塑是指血管內(nèi)徑和血管壁厚度的適應(yīng)性變化，是高血壓病顯著病理特征和并發(fā)癥產(chǎn)生的主要原因[1]。研究發(fā)現(xiàn)病理狀態(tài)下血管外膜可產(chǎn)生大量活性氧(reactive oxygen species, ROS)，通過自分泌、旁分泌作用參與血管重塑發(fā)生。而過氧化氫酶(catalase, CAT)在清除ROS中發(fā)揮重要作用，病理情況下，CAT表達(dá)和活性受到抑制，機(jī)體的氧化-抗氧化系統(tǒng)的平衡遭到破壞，大量ROS蓄積就導(dǎo)致病理性血管重塑[2]。

血管緊張素II (angiotensin II, Ang II)是引起高血壓性血管重塑的重要介質(zhì)，研究表明細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2(extracellular regulated protein kinase 1/2, ERK1/2)信號(hào)通路在Ang II誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用，通過下調(diào)血管成纖維細(xì)胞內(nèi)CAT的表達(dá)和活性，導(dǎo)致H2O2大量蓄積、細(xì)胞發(fā)生表型轉(zhuǎn)化[3-4]。本文通過對(duì)大鼠高血壓模型的研究顯示Ang II通過ERK1/2通路調(diào)節(jié)CAT表達(dá)，從而在高血壓大鼠模型動(dòng)脈外膜成纖維細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化中發(fā)揮了作用，為高血壓血管重塑的防治提供新的理論依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1主要試劑和材料 150～200 g清潔級(jí)SD大鼠購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。Alzet微泵(型號(hào)2002)。血管緊張素Ⅱ、CAT抗體(鼠來源)和α-actin抗體購自Sigma。ERK1/2抑制劑PD98059購自碧云天公司。DMEM高糖培養(yǎng)基及胎牛血清購自Gibco。小動(dòng)物無創(chuàng)尾動(dòng)脈血壓測量儀(Softron BP98A)。

1.2動(dòng)物分組 SD大鼠150～200 g 18只，隨機(jī)分為3組，每組6只，分為未處理組(對(duì)照組)、Ang II灌注組(500 ng·kg-1·min-1)和生理鹽水對(duì)照組。

2 主要方法

2.1動(dòng)物模型制備 SD大鼠用10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，背部埋入預(yù)置AngⅡ或生理鹽水的微量泵，逐次縫合皮下及皮膚。連續(xù)灌注14 d，分別在0、3、7和14 d利用Softron BP98A 尾動(dòng)脈血壓測量儀測定安靜狀態(tài)下的大鼠尾動(dòng)脈收縮壓。每次測量至少5次，取平均值。

2.2細(xì)胞培養(yǎng) 處死大鼠后，取胸主動(dòng)脈，放入盛有DMEM 的培養(yǎng)皿中。仔細(xì)分離血管周圍結(jié)締組織，縱向剖開血管。在另一培養(yǎng)皿中放少量培養(yǎng)液，仔細(xì)分離內(nèi)膜、中膜和外膜。在另一培養(yǎng)皿中滴加1滴胎牛血清，將外膜剪成大約1 mm×1 mm×1 mm大小的組織塊。添加含20%胎牛血清的 DMEM 培養(yǎng)液，放置 5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。5～7 d后細(xì)胞 80%～90%融合時(shí)用0.25%胰蛋白酶消化，傳代。取4～7代用于實(shí)驗(yàn)。分別用4種方法進(jìn)行培養(yǎng):(1) 不特殊處理培養(yǎng)24 h；(2) 單純Ang II(10-7mmol/L)培養(yǎng)24 h；(3) PD98059(10-5mmol/L)培養(yǎng)24 h；(4)Ang II+PD98059(10-5mmol/L)培養(yǎng)24 h。

2.3血管形態(tài)學(xué)檢測 在Ang II灌注后14 d行4%多聚甲醛灌注，取頸動(dòng)脈常規(guī)固定、石蠟包埋制備石蠟切片。之后分別行HE染色檢測血管形態(tài)學(xué)改變。

2.4Western blotting 培養(yǎng)的血管外膜成纖維細(xì)胞按上述分組后干預(yù)24 h，提取細(xì)胞總蛋白后進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜。5%脫脂牛奶封閉2 h，Ⅰ抗(CAT：1∶1 000；β-actin：1∶5 000) 4 ℃孵育過夜，第2天復(fù)溫后加HRP標(biāo)記的Ⅱ抗孵育1 h，之后用ECL發(fā)光液顯影。利用Gelpro32軟件進(jìn)行定量分析。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)用SPSS 16.0軟件包分析。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間兩兩比較用單因素方差分析檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 各組大鼠尾動(dòng)脈收縮壓變化情況

分別于Ang II灌注之前及灌注后3 d、7 d、14 d測量大鼠尾動(dòng)脈血壓。在灌注之前，各實(shí)驗(yàn)組大鼠的尾動(dòng)脈收縮壓無顯著差異。灌注3 d后Ang II灌注組其尾動(dòng)脈收縮壓水平持續(xù)升高，而對(duì)照組及生理鹽水組收縮壓未有明顯改變，Ang II灌注組與其余2組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,P<0.01)，見表1。

表1 各組大鼠的血壓變化情況

2 SD大鼠頸動(dòng)脈形態(tài)學(xué)變化情況

在灌注14 d后用HE染色檢測各組大鼠頸動(dòng)脈中膜厚度。Ang II灌注后能夠使頸動(dòng)脈中膜厚度顯著增厚，與對(duì)照組及生理鹽水組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),見圖1。這表明Ang II能夠顯著促進(jìn)血管重塑的發(fā)生。

Figure 1. HE staining of carotid and determination of media thickness (×100). A: control group; B: saline group; C: Ang II group.Mean±SD.n=3. **P<0.01 vs control.

3 Ang II通過ERK1/2通路調(diào)控CAT表達(dá)及促進(jìn)表型轉(zhuǎn)化

4種方法培養(yǎng)外膜成纖維細(xì)胞24 h后用Western blotting檢測CAT，發(fā)現(xiàn)單純Ang II培養(yǎng)中外膜成纖維細(xì)胞CAT蛋白明顯高于未特殊處理的對(duì)照培養(yǎng)組(P<0.05)。給予ERK1/2信號(hào)抑制劑PD98059后，外膜成纖維細(xì)胞CAT蛋白明顯高于單純Ang II培養(yǎng)(圖2)，同時(shí)也降低了α-actin的表達(dá)(圖3)，這表明Ang II通過ERK1/2信號(hào)通路下調(diào)抗氧化酶CAT的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)成纖維細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)化。

討 論

既往關(guān)于血管重塑的研究主要集中于血管內(nèi)膜的內(nèi)皮細(xì)胞和中膜的血管平滑肌細(xì)胞，卻忽略了血管外膜改變?cè)谥厮苄纬芍械淖饔?，但越來越多的研究證明血管外膜在各種血管重塑過程中發(fā)揮著重要作用[5]，Schulze-Bauer等[6]在研究人類血管外膜的力學(xué)特征時(shí)發(fā)現(xiàn)血管外膜對(duì)血管的塑形起重要作用。血管外膜受到損傷等因素刺激時(shí)能夠釋放多種血管活性物質(zhì)(IL-6、MCP-1等)刺激細(xì)胞增殖、遷移等病理變化[7]。

Figure 2. The expression of CAT was regulated by Ang II through ERK1/2 pathway.Mean±SD.n=3. *P<0.05 vs Ang II.

Figure 3. The expression of α-actin was regulated by Ang II through ERK1/2 pathway.Mean±SD.n=6. *P<0.05 vs Ang II.

Ang II有2個(gè)受體，即血管緊張素II 1型受體(angiotensin II type 1 receptor, AT1R)和血管緊張素II 2型受體(angiotensin II type 2 receptor, AT2R)，Ang II可通過作用于AT1R受體使血管平滑肌細(xì)胞蛋白激酶C 2α亞類和ERK1/2表達(dá)增高，Gorin等[8]發(fā)現(xiàn)在AngⅡ通過AT1受體誘導(dǎo)的系膜細(xì)胞增殖與肥大中，ERK1/2起了非常重要的作用。另外，外膜成纖維細(xì)胞也是產(chǎn)生ROS主要位點(diǎn)之一[2]。ROS是Ang II 等各種病理要素引起血管病變的重要病理生理機(jī)制。Nakamura等[9]的研究顯示抗氧化劑可減弱Ang II引起的血管細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化，并證明Ang II引起細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的部分原因是產(chǎn)生ROS。后證明Ang II通過NAPD/NAPDH氧化酶導(dǎo)致超氧化物的產(chǎn)生[10]。ROS作為信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的重要環(huán)節(jié)，進(jìn)一步可激活MAPK途徑和上調(diào)IL-6而導(dǎo)致細(xì)胞轉(zhuǎn)型[11]。但既往研究主要從ROS的產(chǎn)生及氧化酶方面對(duì)Ang II等誘導(dǎo)的細(xì)胞轉(zhuǎn)型進(jìn)行了探討。很少有從機(jī)體抗氧化系統(tǒng)的角度進(jìn)行分析，而本研究正是著眼于Ang II通過ERK1/2信號(hào)通路介導(dǎo)調(diào)控CAT的表達(dá)在高血壓血管重塑中的作用。本研究結(jié)果表明，在Ang II刺激下大鼠收縮壓和血管中膜厚度明顯增加，說明血管發(fā)生形態(tài)改變。而且Ang II能磷酸化ERK1/2下調(diào)CAT并促進(jìn)外膜成纖維細(xì)胞α-actin的升高，表達(dá)外膜成纖維細(xì)胞在向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化，進(jìn)而促進(jìn)血管重塑的發(fā)生。此外，給以ERK1/2信號(hào)通路抑制劑PD98059后能夠阻斷Ang II誘導(dǎo)的CAT下調(diào)及外膜成纖維細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)化，證實(shí)Ang II是可通過ERK1/2信號(hào)通路介導(dǎo)調(diào)控CAT的表達(dá)變化及細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化，提示恢復(fù)抗氧化系統(tǒng)的表達(dá)能夠顯著改善Ang II誘導(dǎo)的高血壓性血管重塑。

綜上所述，本研究證實(shí)過氧化氫酶CAT及ERK1/2參與了Ang II誘導(dǎo)的血管重塑過程，Ang II導(dǎo)致的氧化/抗氧化體系的失衡是導(dǎo)致血管重塑的重要原因，這為高血壓及其并發(fā)癥的防治提供了新的理論思路和潛在的治療靶點(diǎn)。

[參 考 文 獻(xiàn)]

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