王從軍， 陳 梅， 雷中勁

(1荊楚理工學(xué)院醫(yī)學(xué)院， 2荊門市第一人民醫(yī)院兒科, 湖北 荊門 448000)

川崎病(Kawasaki disease， KD)又稱皮膚黏膜淋巴結(jié)綜合征，其病因尚不清楚，是一種以全身血管炎為主要病理變化的急性發(fā)熱出疹性疾病，可以產(chǎn)生嚴(yán)重的心血管并發(fā)癥。因?yàn)樵诖ㄆ椴∈瑱z病例中發(fā)現(xiàn)損傷的血管組織中有IgA、漿細(xì)胞、單核/巨噬細(xì)胞、CD8+T 淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，一般認(rèn)為它是一種自身免疫性疾病[1]，但對(duì)川崎病患者細(xì)胞免疫和體液免疫功能異常的研究還沒有一致的結(jié)論[2-3]。本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)半定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)部分川崎病患兒外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMC)中T-bet 和GATA3 mRNA 轉(zhuǎn)錄量并同時(shí)采用三色熒光流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)川崎病患兒外周血Th1和Th2 細(xì)胞的比例，分別從轉(zhuǎn)錄水平和表達(dá)水平明確KD患兒T細(xì)胞功能狀態(tài)。

材 料 和 方 法

1 研究對(duì)象

以 2010 年3 月至 2011 年 9月入住荊門市第一人民醫(yī)院兒科的 41 例 KD 患兒為研究對(duì)象，其中男24例，女17例，年齡2月～5歲，均符合2004年美國(guó)兒科學(xué)會(huì)和心臟病學(xué)會(huì)聯(lián)合制定的KD診斷標(biāo)準(zhǔn)[4]，且回顧性診斷沒有誤診,根據(jù)彩色多普勒超聲診斷冠狀動(dòng)脈有擴(kuò)張的15例。同時(shí)選取年齡和性別相匹配的急性上呼吸道感染發(fā)熱兒童40 例為對(duì)照組。

2 儀器及試劑

Becton Dickinson流式細(xì)胞儀。刺激素為佛波酯+ionomycin+monensin(Sigma)?？贵w:細(xì)胞表面標(biāo)記抗體,CD3-TC和CD8-FITC；細(xì)胞因子抗體,IL-4-PE和IFN-γ-PE。同型對(duì)照: Mouse IgG1-PE(對(duì)應(yīng)于IL-4-PE)和Mouse IgG2-PE(對(duì)應(yīng)于IFN-γ-PE)；IntraPrep破膜劑，以上均為Pharmingen產(chǎn)品。TRIzol購(gòu)自深圳晶美公司； PCR試劑盒、DNA marker、逆轉(zhuǎn)錄酶、RPMI-1640、Taq酶及緩沖液為Promega產(chǎn)品。

3 方法

3.1PBMC的分離 用肝素抗凝管采集靜脈血至少 2 mL，采集后 4 h內(nèi)使用； 加入等體積的 Hank 平衡鹽緩沖液(HBSS, pH 7.2～7.4)稀釋血液，取與稀釋后血液等體積的淋巴細(xì)胞分層液(Ficoll 液)加入離心管中，將稀釋血液小心地加到淋巴細(xì)胞分層液上，注意保持兩者界面清晰，室溫下2 000 r/min離心 20 min； 用毛細(xì)吸管輕輕吸出單個(gè)核細(xì)胞層，加入含有 5 mL HBSS 的試管中，充分混勻, 1 500 r/min離心 10 min，棄上清后，再洗1次，棄上清，用 RPMI-1640(含 10%熱滅活 FBS)重懸單個(gè)核細(xì)胞，用臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)(應(yīng)在 95%以上)； 調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為 2×109/L，-20 ℃凍存待測(cè)。

3.2總RNA的抽提與鑒定 按照TRIzol法提取PBMC總RNA。抽提完后分別用熒光分光光度計(jì)測(cè)定A260和A280并計(jì)算比值，進(jìn)一步采取1%瓊脂糖電泳以分析RNA的純度和完整性, 見到典型3條條帶(5S、18S、28S)后行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。

3.3RT-PCR檢測(cè)目的基因mRNA的轉(zhuǎn)錄量 總RNA提取鑒定后立即逆轉(zhuǎn)錄合成 cDNA以防降解，合成的cDNA置-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆没蛑苯有蠵CR反應(yīng)。PCR反應(yīng)體系:10×PCR buffer 5 μL，10 mmol/L dNTP Mix 5 μL, RT-PCR產(chǎn)物cDNA 2 μL，上游引物 20 μmol/L,下游引物 20 μmol/L，Taq polymerase 0.25 μL，滅菌水調(diào)總反應(yīng)體積至50 μL。94 ℃預(yù)變性 5 min；94 ℃ 45 s,55 ℃ 50 s,72 ℃ 1 min，25個(gè)循環(huán)；72 ℃ 7 min。點(diǎn)取 T-bet、GATA3及 GAPDH擴(kuò)增產(chǎn)物 10 μL在 1.2%瓊脂糖凝膠板孔中,100 V電泳20 min。凝膠電泳圖像輸入Kodak Digital Science System DC40凝膠成像系統(tǒng),應(yīng)用圖像分析軟件進(jìn)行各條帶平均灰度值分析,以同時(shí)擴(kuò)增的 GAPDH為外參照,用轉(zhuǎn)錄因子/GAPDH的比值表示轉(zhuǎn)錄因子相對(duì)表達(dá)量。各對(duì)引物見表1。

表1 T-bet、GATA3、GAPDH PCR引物序列

3.4流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Th1和Th2細(xì)胞 取 600 μL PBMC(2×109cells/L)于試管中，加入 10 μL 1 mg/L 佛波酯工作液 + 8 μL 50 mg/L ionomycin 工作液 + 6.8 μL 0.1 g/L monensin 工作液混勻，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng) 4～6 h?；靹蚣?xì)胞，加入 20 μL CD3-TC 和 20 μL CD8-FITC,室溫下避光孵育 15 min。將細(xì)胞分成4 管，每管加入 100 μL PBMC,編號(hào)為 A1、A2、A3和A4；每管中加入 100 μL Fix&Perm 中的 Reagent A(固定液)，室溫避光孵育15 min；每管中加入 3 mL PBS，1 200 r/min 離心 5 min，棄除上清；每管中加入 100 μL Fix&Perm 中的 Reagent B，同時(shí)各管中分別加入相應(yīng)的抗體各 10 μL (A1: Mouse IgG1-PE;A2: IFN-γ-PE;A3: Rat IgG1-PE;A4: IL-4-PE)；室溫下避光孵育15 min。每管中加入3 mL PBS，1 200 r/min 離心5 min，棄除上清；取0.5 mL PBS重懸細(xì)胞，上機(jī)檢測(cè)，每一樣品檢測(cè) 20 000個(gè)細(xì)胞。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)， T-bet mRNA、GATA3 mRNA 分別與Th1、Th2細(xì)胞間的相關(guān)性采用Spearman相關(guān)分析法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 KD患兒與對(duì)照組患兒外周血淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子 T-bet及GATA3轉(zhuǎn)錄水平

由圖1和表2可見，KD患兒外周血淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子T-bet和GATA3 mRNA的水平均顯著低于對(duì)照組。

Figure 1. The electrophoretogram of T-bet, GATA3 and GAPDH mRNA in peripheral blood in KD group and control gorup.1: DNA marker; 3: T-bet mRNA of KD group; 4: T-bet mRNA of control group; 5: GATA3 mRNA of KD group; 6: GATA3 mRNA of control group; 7: GAPDH mRNA of KD group; 8: GAPDH mRNA of control group.

表2 KD組與對(duì)照組T-bet mRNA和GATA3 mRNA的 RT-PCR檢測(cè)結(jié)果

2 KD患兒外周血淋巴細(xì)胞亞群 Th1和Th2細(xì)胞百分率的變化

用 CD3 和 CD8反設(shè)CD4細(xì)胞，即 CD3+CD8-的細(xì)胞被認(rèn)為是 CD3+CD4+的細(xì)胞。以散點(diǎn)圖IFN-γ和IL-4染色陽(yáng)性分別表示Th1和Th2細(xì)胞，見圖2。用Cells Quest軟件獲取并分析數(shù)據(jù)，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示KD患兒外周血淋巴細(xì)胞亞群Th1和Th2細(xì)胞的百分率顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，Th1/Th2的比值與對(duì)照組相比無(wú)顯著差異(P>0.05)，見表3。

Figure 2. Detection of Th1 and Th2 cells in peripheral blood by flowcytometry method in KD group and control gorup.A: Th1 cells in flow cytometry graph of KD group; B: Th2 cells in flow cytometry graph of KD group; C: Th1 cells in flow cytometry graph of control group; D: Th2 cells in flow cytometry graph of control group.

表3 KD組與對(duì)照組Th1和Th2細(xì)胞流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果

3 T-bet mRNA與Th1細(xì)胞、GATA3 mRNA與Th2細(xì)胞間的相關(guān)分析

對(duì)全部81例研究對(duì)象T-bet和GATA3 mRNA半定量值與Th1、Th2細(xì)胞百分比分別進(jìn)行Spearman相關(guān)分析，結(jié)果顯示T-bet mRNA轉(zhuǎn)錄量與Th1細(xì)胞比例呈正相關(guān)(r=0.69，P<0.05)，GATA3 mRNA轉(zhuǎn)錄量與Th2細(xì)胞比例呈正相關(guān)(r=0.65，P<0.05)，見圖3。

Figure 3. The correlations between T-bet mRNA and Th1 cells (A), and between GATA3 mRNA and Th2 cells (B).

討 論

KD的病因及發(fā)病機(jī)制尚未清楚，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為本病與感染介導(dǎo)的免疫系統(tǒng)高度活化密切相關(guān)[5-6]。目前報(bào)道與川崎病發(fā)病有關(guān)的病原體有10余種，包括鏈球菌[7]、葡萄球菌[8]、支原體[9]、人類微小病毒B19[10]等。在感染等因素作用下，急性期CD4+T細(xì)胞數(shù)目增多，CD8+T細(xì)胞數(shù)目減少，CD4+T細(xì)胞表面CD40配體表達(dá)明顯增高，提示患兒細(xì)胞免疫功能紊亂[11]。但有實(shí)驗(yàn)表明川崎病急性期CD4+調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞數(shù)目減少，輔助性T 細(xì)胞Th1、Th2細(xì)胞產(chǎn)物減少，因此對(duì)于T細(xì)胞功能在兒童川崎病中的地位仍有爭(zhēng)議[12]。

T-bet是T-box轉(zhuǎn)錄因子家族中的新成員，不僅控制Th1細(xì)胞特征性細(xì)胞因子IFN-γ的表達(dá)，而且抑制Th2細(xì)胞特征性細(xì)胞因子 IL-4的產(chǎn)生，被確認(rèn)為Th1特異性轉(zhuǎn)錄因子。GATA3是一個(gè)鋅指蛋白，屬于GATA家族成員，是Th2細(xì)胞特異的轉(zhuǎn)錄因子，GATA3不僅在Th2細(xì)胞分化過(guò)程中起關(guān)鍵作用，而且它還是所有Th2型細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄所必需的，能促使正在分化或已分化的Th細(xì)胞合成Th2細(xì)胞因子[13]。既往對(duì)川崎病患兒T細(xì)胞免疫功能狀況的研究主要通過(guò)采用ELISA的辦法檢測(cè)2種Th細(xì)胞的特異性因子來(lái)間接檢測(cè)Th1和Th2細(xì)胞的數(shù)目和功能[14]，本研究通過(guò)檢測(cè)兩種T細(xì)胞亞群的特異性轉(zhuǎn)錄因子T-bet和GATA3并采用細(xì)胞內(nèi)因子標(biāo)記CD3、CD8設(shè)門的辦法用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)外周血Th1和Th2細(xì)胞,進(jìn)一步確定川崎病患兒T細(xì)胞功能狀態(tài)，結(jié)果顯示川崎病患兒急性期外周血PBMCs中T-bet mRNA和GATA3 mRNA低于對(duì)照組，提示川崎病急性期上述2種轉(zhuǎn)錄因子被不同程度抑制，而流式細(xì)胞術(shù)的檢測(cè)結(jié)果也顯示川崎病患兒外周血Th1和Th2細(xì)胞比例均較對(duì)照組顯著減少。Spearman相關(guān)分析顯示T-bet mRNA與Th1細(xì)胞比例、GATA3 mRNA與Th2細(xì)胞比例呈正相關(guān)。以上結(jié)果表明川崎病急性期PBMC中T-bet和GATA3 mRNA表達(dá)被抑制，相關(guān)表達(dá)產(chǎn)物減少，使Th細(xì)胞在向其亞群Th1、Th2轉(zhuǎn)化方面被抑制而導(dǎo)致了Th1和Th2細(xì)胞減少，提示川崎病患兒急性期T淋巴細(xì)胞并非活化而是處于抑制狀態(tài)，這和以往部分研究結(jié)果不一致。需要說(shuō)明的是我們僅檢測(cè)了川崎病急性期T淋巴細(xì)胞免疫功能狀態(tài)，并不能完全反映川崎病亞急性期和恢復(fù)期特點(diǎn)，或許在川崎病的亞急性期和恢復(fù)期細(xì)胞免疫功能狀況逐漸被激活，而部分研究者因在不同病程時(shí)間采集標(biāo)本從而造成研究結(jié)果不一致，也有可能川崎病發(fā)病時(shí)循環(huán)池淋巴細(xì)胞被抑制而周圍池被激活從而導(dǎo)致循環(huán)淋巴細(xì)胞減少，這需進(jìn)一步動(dòng)態(tài)測(cè)定川崎病各期T淋巴細(xì)胞功能狀況并對(duì)炎性血管壁局部組織中的淋巴細(xì)胞功能狀態(tài)進(jìn)行研究加以證實(shí)。另外，我們也比較了川崎病患兒組與對(duì)照組兒童的Th1/Th2比值，并沒發(fā)現(xiàn)顯著差異，因此對(duì)于川崎病細(xì)胞免疫所起的作用還需進(jìn)一步研究證實(shí)，同時(shí)對(duì)于川崎病急性期細(xì)胞免疫為什么被抑制也是需要通過(guò)進(jìn)一步研究明確。

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