包松蓮 李志國 張建云 鄭書星

(中國林業(yè)科學(xué)研究院資源昆蟲研究所，昆明，650224) (湖北鐘祥市林業(yè)局)

塔拉(Caesalpinia spinosa Kuntze，Tara)，屬于蘇木科(云實(shí)科)(Caesalpiniaceae)，云實(shí)屬(Caesalpinia L.)。常綠，具刺灌木或小喬木，原產(chǎn)南美洲，秘魯?shù)乃Y源居世界各國之首，約占世界產(chǎn)量的80%［1］。我國無塔拉的自然分布，20世紀(jì)90年代初，中國林業(yè)科學(xué)研究院資源昆蟲研究所從秘魯引進(jìn)，首先在云南易門縣繁育成功，并推廣至四川、貴州、廣西、海南等省區(qū)。經(jīng)過10 a多的探索發(fā)展，我國南方的干熱、干暖河谷地區(qū)已有廣泛栽培［2－3］，所產(chǎn)塔拉豆莢的單寧含量在55%以上，多糖達(dá) 25%以上［4－5］，能生產(chǎn)上百種廣泛用于醫(yī)藥、化工、食品添加劑等的產(chǎn)品，和原產(chǎn)地所產(chǎn)質(zhì)量不相上下，是一種珍貴的經(jīng)濟(jì)樹種。由于其較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和云南省的獨(dú)特地理氣候，塔拉在云南有較大的發(fā)展?jié)摿?，研究引種的塔拉資源的遺傳多樣性可以對其發(fā)展空間提供依據(jù)。

20世紀(jì)80年代以前，林木遺傳育種多采用形態(tài)標(biāo)記、細(xì)胞學(xué)標(biāo)記、生化標(biāo)記和同工酶標(biāo)記等，這些標(biāo)記都是基因表達(dá)型標(biāo)記，不僅可利用的位點(diǎn)少，而且易受環(huán)境條件的影響。80年代開始，先后提出和使用了RFLP、RAPD、AFLP和SSR等DNA分子標(biāo)記技術(shù)，這些技術(shù)都各有優(yōu)缺點(diǎn)。而ISSR標(biāo)記技術(shù)結(jié)合了RAPD標(biāo)記技術(shù)和SSR標(biāo)記技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)［6］。本研究采用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)研究塔拉遺傳多樣性，旨在探討其DNA分子水平的變異和遺傳多樣性，從分子水平上為塔拉的種質(zhì)資源收集和育種提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

分別于昆明采集4個(gè)單株(KM1、KM2、KM3、KM4)、易門十街 7 個(gè)單株(M1、M2、M3、S1、S2、X1、X2)、易門占馬田基地 18 個(gè)單株(ZZ1、ZZ2、ZZ4、ZZ5、ZL、Z5、Z7、Z8、Z9、Z10、Z11、Z12、Z15、Z21、Z22、Z24、Z26、Z1－20)、易門小綠汁 7 個(gè)單株(L1、L5、L6、L8、L9、L11、L14)、景東 30 個(gè)單株(J1、J2、J3、J4、J5、J6、J7、J8、J9、J10、J11、J12、J13、J14、J15、J16、J17、J18、J19、J20、J21、J22、J23、J24、J30、J32、J33、J38、JK1、JK2)，采集入選單株的新鮮綠葉，帶回實(shí)驗(yàn)室備用。采集地詳細(xì)資料見表1。

儀器和試劑:GeneAmp?PCR system 9700型擴(kuò)增儀(MJR公司，美國);GONGDS8000(UVP公司)凝膠成像系統(tǒng);新型植物基因組DNA抽提試劑盒(UNIQ－10柱式)、引物(試劑盒和引物均為上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司生產(chǎn))，DNA染料，PCR反應(yīng)體系的各種試劑，瓊脂，電泳儀。

表1 采集地點(diǎn)的基本情況

DNA的提取:取適量新鮮葉片于液氮快速研磨，并應(yīng)用新型植物基因組DNA抽提試劑盒(UNIQ－10柱式)提取基因組DNA備用。1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測所提取DNA質(zhì)量。

ISSR－PCR擴(kuò)增及檢測:經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)從104對引物中篩選出11對多態(tài)性明顯、條帶清晰、反應(yīng)穩(wěn)定的ISSR引物。

反應(yīng)體系為 25 μL:基因組 DNA50 ng，PCR Buffer(10 mmol·L－1Tris－HCl(pH=8.3)，2 mmol·L－1的 MgCl2，0.2 mmol·L－1dNTP，0.2 mmol·L－1反應(yīng)引物，1 U Taq酶，用去離子水補(bǔ)足總體積。擴(kuò)增程序設(shè)定為:94℃預(yù)變性5 min;35個(gè)循環(huán)(94℃變性 30 s，48.5～52.5 ℃退火 45 s，72 ℃延伸 105 s);72℃延伸10 min。擴(kuò)增反應(yīng)在GeneAmp?PCR system 9700型擴(kuò)增儀上進(jìn)行。擴(kuò)增產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖膠(每100 mL加入8 μL GoldViewTM DNA 染料，或者電泳結(jié)束后用EB染色10 min)電泳分離，電泳緩沖液是1×TBE，電壓120 V電泳50 min，電泳結(jié)束后用GONGDS8000(UVP公司)凝膠成像系統(tǒng)拍照記錄。

數(shù)據(jù)分析:根據(jù)電泳圖譜中DNA條帶的有無，將ISSR擴(kuò)增結(jié)果轉(zhuǎn)化為二元數(shù)據(jù)(有帶的計(jì)為1，無帶的計(jì)為0)。應(yīng)用POPGEN 32軟件計(jì)算等位基因數(shù)(Na)、有效等位基因數(shù)(Ne)、Nei’s基因多樣性指數(shù)(H)、Shannon多樣性指數(shù)(I)等;并用UPGMA方法對樣品進(jìn)行聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 塔拉的ISSR多態(tài)性

從114個(gè)引物中，篩選出11個(gè)條帶清晰、重復(fù)性好的引物(表2);圖1為引物Y71擴(kuò)增樣品的電泳圖。11條引物共擴(kuò)增出74條帶，位點(diǎn)范圍在250～2 000 bp;平均每個(gè)引物擴(kuò)增出6.73條譜帶，其中5.55條為多態(tài)性條帶，多態(tài)性百分率為82.65%。引物Y107擴(kuò)增出10條譜帶，引物Y30擴(kuò)增出9條譜帶，并且多態(tài)性達(dá)到 100%，其余 Y71、Y111、Y109，雖然擴(kuò)增的條帶不是很多，但多態(tài)性均達(dá)到了100%。引物Y11和Y9擴(kuò)增的引物多態(tài)性最低，僅50%。

表2 篩選獲得的引物及譜帶數(shù)量

由篩選出的11個(gè)引物擴(kuò)增結(jié)果分析，含(CgA)n、(Ag)n核苷酸重復(fù)序列的引物擴(kuò)增重復(fù)性好、多態(tài)性高，可適用于塔拉的遺傳多樣性分析。

2.2 塔拉的遺傳多樣性分析

基于ISSR分子標(biāo)記所揭示的多態(tài)性，經(jīng)軟件計(jì)算得到塔拉試驗(yàn)群體的遺傳多樣性情況(表3)。分析可知，66個(gè)塔拉材料的總位點(diǎn)數(shù)為74，有效位點(diǎn)數(shù)為65，多態(tài)位點(diǎn)百分?jǐn)?shù)達(dá)到87.84%;其中，試驗(yàn)樣本的平均等位基因數(shù)值為 1.878 4±0.329 1，平均有效位點(diǎn)數(shù)值為 1.426 3±0.342 0，Nei’s基因多樣性指數(shù)值為 0.257 6±0.177 3，Shannon 多樣性指數(shù)值為0.394 7±0.241 6。表明所采集的塔拉群體的遺傳多樣性較高，存在較豐富的遺傳變異，這與對塔拉的表型性狀多樣性分析取得相類似的結(jié)果［7］。

表3 塔拉各多態(tài)位點(diǎn)的遺傳多樣性指數(shù)

圖1 引物Y71擴(kuò)增圖譜

圖2 基于ISSR分子標(biāo)記的塔拉樣本UPGMA聚類圖

2.3 塔拉的遺傳距離和聚類分析

根據(jù)ISSR引物擴(kuò)增結(jié)果，計(jì)算出66個(gè)試驗(yàn)樣本的遺傳相似系數(shù)和遺傳距離。供試材料間的遺傳相似系數(shù)為 0.46～0.99，平均值為 0.78，遺傳距離為0.01～0.64，平均值 0.22。J33 和 J38、L11 和 L14、Z9和Z11、L8和Z15、Z7和Z24之間的遺傳距離最小，親緣關(guān)系最近;KM1和X2之間的遺傳距離最大，親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。

基于樣本間的遺傳相似系數(shù)用UPGMA方法進(jìn)行聚類分析(圖2)。從圖2可以看出，在0.749的遺傳距離上將66份材料分為6大類:Ⅰ類，KM1、KM2、KM3、KM4 和 M2;Ⅱ類，S2、J12、J3、J13、J14、M3、ZL、Z7、Z24、Z26、L5、Z10、Z1－20、ZZ1、Z9、Z11、J30、S1、J33、J38、J1、J10、J2、J15、J6、J7、J8、J9、J11、J16、J18、J20、L8、Z15、L11、L14、Z12、ZZ4、Z5、ZZ2、ZZ5、J21、J22、J23、JK1、X1、JK2、Z22、J5;Ⅲ類，J4、J32;Ⅳ類，M1、J17、J24、J19、Z8、Z21;Ⅴ類，X2;Ⅵ類，L1、L9、L6。

從聚類結(jié)果來看，昆明種植的單株處于北亞熱帶區(qū)域，是對相對寒冷地帶適應(yīng)的一種類型，所采集的4個(gè)樣本均處于這個(gè)類型;小綠汁的L1、L9和L6單獨(dú)成為一類，這和引進(jìn)渠道有很大的關(guān)系，小綠汁所采集單株和其他地方采集的單株是不同的引種批次;其余4類中，Ⅱ類占據(jù)了大部分的單株，除小綠汁的4個(gè)單株外，這些采集單株均為同一批次引進(jìn);Ⅲ類、Ⅳ類和Ⅴ類是在同一批次引種的塔拉種質(zhì)中經(jīng)過多年的引種馴化和地理適應(yīng)而分離出來的不同類型。

3 結(jié)論與討論

ISSR在對遺傳多樣性進(jìn)行分析時(shí)具有多態(tài)性高、試驗(yàn)穩(wěn)定性好、引物設(shè)計(jì)簡單等優(yōu)點(diǎn)，本文首次將該分子標(biāo)記在塔拉上應(yīng)用，對塔拉群體的遺傳變異情況進(jìn)行分析，揭示該群體具有較高的遺傳多樣性。但作為一種顯性標(biāo)記，ISSR也有一些難以克服的不足，如它不能鑒別顯性雜合與顯性純合。因此，在條件允許的情況下，應(yīng)積極開發(fā)共顯性標(biāo)記，同時(shí)結(jié)合多態(tài)性高的ISSR標(biāo)記，多種分子標(biāo)記聯(lián)合使用，將在植物遺傳多樣性分析上發(fā)揮更大的作用。

中國所引進(jìn)的塔拉，前后總計(jì)兩批次，第1次由中國林業(yè)科學(xué)研究院資源昆蟲研究所引進(jìn)種子共培育出26棵塔拉苗，云南省所推廣的塔拉全部由這26棵單株所產(chǎn)種子繁育而來;第2次由易門縣林業(yè)局引進(jìn)種子培育的塔拉苗僅僅繁育了小綠汁2.33 hm2左右的面積。因此，云南引種塔拉的遺傳基礎(chǔ)較窄;但經(jīng)過10 a多的引種馴化、各地區(qū)農(nóng)民的推廣種植以及云南各地小氣候類型多變，致使適應(yīng)不同自然條件的地理變異類型出現(xiàn)并保存。這就豐富了塔拉的遺傳基礎(chǔ)，為進(jìn)一步品種選育提供理論與實(shí)踐基礎(chǔ)。

從多態(tài)性位點(diǎn)百分率和香農(nóng)指數(shù)兩個(gè)指標(biāo)來看，塔拉的遺傳多樣性和珙桐［8］、灰氈毛忍冬［9］等物種的遺傳多樣性相近，均具有豐富的遺傳多樣性，有很大的選育空間。由于塔拉的經(jīng)濟(jì)價(jià)值較高，塔拉在云南的分布范圍很廣，從北亞熱帶的昆明到南亞熱帶的景東，海拔1 160～1 890 m，不同的生長環(huán)境使塔拉產(chǎn)生了很多的適應(yīng)性變異，可以從這些分布地區(qū)選擇特定目標(biāo)的單株，進(jìn)行有性或者無性繁殖，定向培育出符合目標(biāo)的家系或無性系;同時(shí)可考慮從國外引種，進(jìn)一步增加塔拉的種質(zhì)資源和應(yīng)用基礎(chǔ)。

［1］ 江蘇科技考察團(tuán).秘魯刺云實(shí)資源及其利用考察報(bào)告［J］.林產(chǎn)化工通訊，1992(3):31－34.

［2］ 包松蓮，夏定久，李志國.塔拉的生態(tài)適應(yīng)性及其在云南適生區(qū)域的劃分［J］.云南林業(yè)科技，2001(4):45－49.

［3］ 袁素蓉，期俊光，普鳳仙.易門縣干熱河谷地區(qū)塔拉引種試驗(yàn)［J］.云南林業(yè)科技，2001(2):41－44.

［4］ 夏定久，李志國.塔拉的工業(yè)用途與豐產(chǎn)栽培［M］.昆明:云南科技出版社，2005:35－36.

［5］ 蔣建新，朱莉偉，張衛(wèi)明，等.塔拉多糖膠的研究［J］.西南林學(xué)院學(xué)報(bào)，2003，23(4):12－16.

［6］ 周延清.DNA分子標(biāo)記技術(shù)在植物研究中的應(yīng)用［M］.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2005.

［7］ 包松蓮，李志國，張建云，等.云南塔拉林表型多樣性研究［J］.氨基酸和生物資源，2009，31(4):45－49.

［8］ 李雪萍，鄭雪，朱文琰，等.瀕危植物珙桐遺傳多樣性與遺傳結(jié)構(gòu)的 ISSR 分析［J］.廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012(6):121－123.

［9］ 王珊，周日寶，潘清平，等.利用ISSR和RAPD標(biāo)記技術(shù)分析灰氈毛忍冬種質(zhì)資源的遺傳多樣性［J］.中醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2011，17(11):65－67.