趙 越 韓東洺 尹紹鵬 孫鳳陽 胡 穎 盧 宏 由香玲

(東北林業(yè)大學(xué)，哈爾濱，150040)

三七(Panax notoginseng(Burk.)FH.Chen)為五加科人參屬植物，是我國(guó)傳統(tǒng)名貴中藥材，含有皂苷類物質(zhì)、黃酮、多糖類等多種活性成分。其中人參皂苷類抗氧化活性的特點(diǎn)已被應(yīng)用到緩解衰老以及衰老性疾病防治方面的食品和化妝品等領(lǐng)域，因?yàn)榛钚匝踝杂苫芍苯踊蜷g接損傷DNA，導(dǎo)致DNA鏈斷裂和染色體斷裂，誘導(dǎo)很多疾病的發(fā)生［1－3］。很多研究顯示，三七多糖也具有增強(qiáng)免疫的功能［4－6］。

近年來，應(yīng)用植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)有用次級(jí)代謝產(chǎn)物日益引人注目，紫草細(xì)胞、人參細(xì)胞、紅豆杉細(xì)胞等已實(shí)現(xiàn)了產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)［7］。三七由于自然生長(zhǎng)及栽培地區(qū)非常狹窄，產(chǎn)量很有限。利用植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)對(duì)其進(jìn)行規(guī)?；囵B(yǎng)生產(chǎn)有效成分，具有非常重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。三七細(xì)胞培養(yǎng)處于實(shí)驗(yàn)室研究階段，Zhong等初步研究了高密度培養(yǎng)細(xì)胞生產(chǎn)人參皂苷及三七多糖的技術(shù)［8－9］，但是有關(guān)培養(yǎng)材料中三七皂苷類物質(zhì)清除自由基活性方面及多糖的累積量如何，目前未查到相關(guān)報(bào)道。筆者在研究體細(xì)胞胚發(fā)生的基礎(chǔ)上，考查不同發(fā)育時(shí)期體細(xì)胞胚中三七皂苷清除DPPH自由基活性及多糖累積量，進(jìn)一步大規(guī)模培養(yǎng)篩選合適的外植體及培養(yǎng)方法。

1 材料與方法

1.1 三七不同發(fā)育時(shí)期體細(xì)胞胚的獲得

在前期試驗(yàn)中已成功建立了三七體胚發(fā)生再生體系［10］，并且獲得了大量的胚性愈傷組織(見圖1a)。將胚性愈傷移入體細(xì)胞胚發(fā)生培養(yǎng)基上誘導(dǎo)體胚發(fā)生，4周后愈傷組織上生長(zhǎng)出大量前期體胚(球形胚和心形胚，見圖1b);然后進(jìn)行繼代，體細(xì)胞胚繼續(xù)萌發(fā)，4周后大部分發(fā)育到后期體細(xì)胞胚(魚雷胚和子葉體胚，見圖1c);子葉胚繼續(xù)萌發(fā)生長(zhǎng)8周后，該胚苗根部隆起變粗(見圖1d)。收集上述各時(shí)期的樣品于烘箱中60℃烘干，對(duì)其多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)及抗氧化活性進(jìn)行分析。

為了能更清楚地說明不同發(fā)育時(shí)期體細(xì)胞胚中的多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)及抗氧化活性狀況，同時(shí)分析了栽培3 a的三七根中多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.2 不同發(fā)育時(shí)期三七體細(xì)胞胚中的多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定

收集的材料中多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測(cè)定采用蒽酮比色法進(jìn)行。糖類遇濃硫酸發(fā)生脫水，形成糠醛及其衍生物，該衍生物可與蒽酮發(fā)生反應(yīng)，呈藍(lán)綠色。該方法快速簡(jiǎn)便，具體步驟參考姜曼花的方法［11］。

1.2.1 樣品中多糖的提取

三七的胚性愈傷組織、前期體胚、后期體胚、體胚苗以及栽培根粉末各1.0 g，置于10 mL離心管中，分別加入4 mL蒸餾水，在100℃水浴中提取4 h，7 000 r/mim離心10 min，收集上清液。在上清液中緩慢加入體積為上清液3倍的95%乙醇，邊加邊攪動(dòng)，于4℃條件下靜置12～24 h后取出，9 000 r/mim離心10 min，將上清液棄去，收集沉淀，乙醇揮干后即為所提多糖。提取所得的多糖加10 mL蒸餾水溶解，即得供試樣品溶液。

1.2.2 最大吸收波長(zhǎng)的確定

以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品，配置質(zhì)量濃度為200 mg/L的葡萄糖母液。取2個(gè)10 mL離心管，一個(gè)不加母液，加入蒸餾水1.0 mL;另一個(gè)加入母液、蒸餾水各0.5 mL。2試管中再分別加入8.0 mL蒽酮試劑，搖勻。沸水浴中加熱10 min后取出迅速放在冰水中冷卻至室溫，搖勻。在500～700 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描(以空白管作對(duì)照)，確定最大吸收波長(zhǎng)為630 nm。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以葡萄糖溶液為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程為:y=0.030 0+0.005 0x，相關(guān)系數(shù) r=0.996 2，線性范圍為 0～0.2 mg。

1.2.4 樣品中多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定

吸取各樣品供試溶液1.0 mL于10 mL離心管中，按標(biāo)準(zhǔn)曲線制備的方法測(cè)定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)。平行操作3次，結(jié)果取平均值。

1.3 不同發(fā)育時(shí)期三七體細(xì)胞胚中的抗氧化活性分析

抗氧化活性以清除DPPH自由基能力的大小表示，清除率越大，抗氧化活性就越強(qiáng)，該方法被廣泛應(yīng)用于清除自由基物質(zhì)活性研究。DPPH自由基含有單電子，在517 nm波長(zhǎng)處有一強(qiáng)吸收，其乙醇溶液呈深紫色。

1.3.1 樣品溶液的制備

精密稱取(60±1)℃干燥至恒質(zhì)量的實(shí)驗(yàn)室組織培養(yǎng)的三七胚性愈傷組織、前期體胚、后期體胚、體胚苗以及栽培三七根粉末各0.5 g，以5 mL 75%乙醇浸泡過夜，次日以75%乙醇室溫超聲提取3次，5 mL/次，每次提取 30 min，合并提取液，以 0.45 μm 微孔濾膜濾過，75%乙醇定容至25.0 mL。80℃水浴減壓蒸干溶劑后，以75%乙醇復(fù)溶，并定容至8.0 mL。栽培三七根提取物定容至 2.0 mL，搖勻，以0.45 μm微孔濾膜濾過，即得供試樣品溶液。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品

以維生素C(Vc)為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品。精密稱取0.001 0 g Vc粉末，以75%乙醇溶解并且定容至10 mL，配成質(zhì)量濃度為0.1 g/L的Vc溶液，作為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照液。

1.3.3 皂苷粗提物對(duì)DPPH自由基的清除測(cè)定

抗氧化活性的分析用文獻(xiàn)［12］的方法。

清除率=((Ab－Aa)/Ab)×100%。

式中:Aa為待測(cè)樣品，即100 μL Vc或樣品供試液與1 mL DPPH自由基溶液和1.4 mL 75%乙醇溶液混合的吸光度;Ab為空白對(duì)照，即1 mL DPPH自由基溶液和1.4 mL 75%乙醇溶液混合的吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析方法

采用 Excel、SPSS(version 17.0)軟件處理數(shù)據(jù)，運(yùn)用ANOVA分析法中的鄧肯多重比較法(P＜0.05)對(duì)同一批取樣后的數(shù)據(jù)進(jìn)行多重比較分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 三七體細(xì)胞胚發(fā)生

按照已建立的三七體細(xì)胞胚發(fā)生及其植株再生體系，獲得的實(shí)驗(yàn)材料見圖1。

2.2 不同發(fā)育時(shí)期三七體細(xì)胞胚中的多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)

測(cè)定不同發(fā)育時(shí)期三七體胚中多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)，并對(duì)其進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果見表1。不同發(fā)育時(shí)期的體胚中多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)差異顯著，從大到小依次為后期體胚、前期體胚、體胚苗、胚性愈傷組織;最高的是后期體胚，為16.44 mg/g;最低的為胚性愈傷組織，為12.24 mg/g。該實(shí)驗(yàn)也對(duì)栽培3 a三七根中的多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)進(jìn)行了分析，結(jié)果為58.74 mg/g。后期體胚中多糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)占總栽培的27.99%，其培養(yǎng)時(shí)間較短，說明后期體細(xì)胞胚中多糖的含量相當(dāng)可觀。

表1 三七不同發(fā)育時(shí)期體胚中多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)

圖1 不同發(fā)育時(shí)期的體細(xì)胞胚及栽培三七根

2.3 不同發(fā)育時(shí)期三七體細(xì)胞胚皂苷粗提物對(duì)DPPH自由基的清除作用

不同發(fā)育時(shí)期三七體細(xì)胞胚中的皂苷粗提物對(duì)DPPH自由基清除作用、數(shù)據(jù)分析統(tǒng)計(jì)見圖2?？梢钥闯?Vc和各時(shí)期體細(xì)胞胚中的皂苷對(duì)DPPH自由基的清除作用趨勢(shì)一致，都是在一定范圍內(nèi)隨著質(zhì)量濃度的增大清除能力增加，達(dá)到一定的質(zhì)量濃度后，清除作用趨于平穩(wěn)。但Vc清除自由基的速率更快，而三七體胚材料皂苷粗提物的清除速率很慢，在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)清除作用才能達(dá)到平穩(wěn)。王晶等認(rèn)為:此特性在聯(lián)合用藥中有利于人參皂苷抗自由基作用的緩慢釋放［13］。

常用清除率為50%對(duì)應(yīng)的樣品質(zhì)量濃度，即稱為此樣品的半數(shù)抑制質(zhì)量濃度(IC50)，用來表示樣品清除DPPH自由基的能力大小。IC50值越低，表明其抗氧化、清除自由基的能力越強(qiáng)。將上述Vc和各不同三七材料粗提物對(duì)DPPH自由基清除作用用IC50方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析(見表2)?？梢姡cVc相比，栽培三七皂苷粗提物和培養(yǎng)的各不同發(fā)育時(shí)期材料皂苷粗提物對(duì)自由基的清除能力都較弱。這與許多研究人參、西洋參、三七皂苷對(duì)DPPH自由基清除作用的結(jié)論相同:人參皂苷對(duì)DPPH自由基具有一定的清除能力，是一種較弱的自由基清除劑［1－2，13］。

圖2 Vc及三七不同發(fā)育時(shí)期體胚對(duì)DPPH自由基的清除作用

表2 三七不同發(fā)育時(shí)期體胚及栽培三七根皂苷粗提物與Vc的IC50

不同發(fā)育時(shí)期體細(xì)胞胚皂苷粗提物對(duì)DPPH自由基的清除作用有較顯著差異，從強(qiáng)到弱順序?yàn)?胚性愈傷組織、體胚苗、栽培三七根、前期體胚、后期體胚。胚性愈傷組織皂苷粗提物的清除能力最強(qiáng)，IC50值為3.670 g·L－1;最弱的為后期體胚皂苷粗提物，IC50值達(dá) 8.116 g·L－1。栽培三七皂苷粗提物對(duì)DPPH自由基的清除作用與體細(xì)胞胚苗的接近，低于胚性愈傷組織皂苷粗提物。因此，三七體胚的培養(yǎng)材料在抗氧化活性方面要優(yōu)于栽培三七。

3 結(jié)論與討論

不同發(fā)育時(shí)期的體胚中多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的差異可能與胚性細(xì)胞的生長(zhǎng)和發(fā)育相關(guān)，胚性細(xì)胞在后期體胚階段生長(zhǎng)更旺盛，需要大量糖類來維持旺盛的代謝;而到體細(xì)胞胚苗階段，生長(zhǎng)較緩慢，糖類合成降低;也可能與培養(yǎng)條件有關(guān)。本研究獲得了多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高的后期體細(xì)胞胚材料，需進(jìn)一步對(duì)其生長(zhǎng)速率進(jìn)行研究，以期短時(shí)間內(nèi)獲得更多三七多糖。

不同發(fā)育時(shí)期體胚的皂苷粗提物對(duì)DPPH自由基的清除作用與栽培三七根的相似，都較Vc弱且作用緩慢，有利于皂苷藥效的緩釋作用。三七不同發(fā)育時(shí)期體細(xì)胞材料中，胚性愈傷組織皂苷的粗提物對(duì)DPPH自由基的清除作用最強(qiáng)，強(qiáng)于栽培三七根皂苷粗提物的作用。而在前期的研究中，三七不同發(fā)育時(shí)期體細(xì)胞材料胚性愈傷組織中皂苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)最低?？赡艿脑蚴牵狙芯克玫脑碥沾痔嵛锊捎梦寮涌浦参镌碥仗崛〉姆椒?，用75%乙醇為溶劑，該粗提物中可能同時(shí)含有很多其他活性物質(zhì)，如黃酮類、酚類等，它們對(duì)自由基的清除作用相比皂苷類要強(qiáng)很多，因此，出現(xiàn)皂苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)與自由基清除作用不一致的結(jié)果。4～6年生刺老芽根提取物對(duì)DPPH自由基清除能力的研究也顯示，4 a的清除能力高于6 a的，而與皂苷的累積量不一致［14］。丁克祥等認(rèn)為:一般植物提取物中的抗氧化物有黃酮類、酚類、皂苷類、多糖類等，其含量和組成決定了抗氧化性的大?。?5］。幼嫩組織清除自由基的能力一般高于老的部分，例如黃素梅等在研究幾種香蕉廢棄物清除DPPH自由基過程中發(fā)現(xiàn):各種材料清除DPPH自由基的能力最強(qiáng)的是最幼嫩部分，即嫩苞片［16］。

綜上所述，與大田栽培3 a的三七根相比，三七體胚培養(yǎng)材料中的多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)在生長(zhǎng)時(shí)間上很可觀。體胚培養(yǎng)材料與大田栽培3 a的三七根皂苷粗提物在抗氧化活性——清除DPPH自由基方面，有相似的緩慢特性，且前者材料中胚性愈傷組織對(duì)DPPH自由基的清除作用要優(yōu)于后者。因此，三七體胚培養(yǎng)材料是進(jìn)行規(guī)?；囵B(yǎng)生產(chǎn)有效成分的很好材料。

［1］ 王雪梅，戴云，張建勝，等.分光光度法測(cè)定三七皂苷清除活性氧自由基的研究［J］.云南中醫(yī)中藥雜志，2006，27(6):41－42.

［2］ 劉滿紅，楊明惠，劉曉芳，等.紫外輻射誘發(fā)自由基體系及抗氧化活性的研究［J］.化學(xué)世界，2008，14(1):14－16.

［3］ Salem Y H，Du lchavsky S A，Dutta S.Effect of inhibition of Lipid peroxidation on myocardial oxidant damage［J］.The Journal Surgical Reserch，1994，56(6):606－610.

［4］ Gao H，Wang F，Lien E，et al.Immunostimulating polysaccharides from Panax notoginseng［J］.Pharmaceutical Reserch，1996，13(8):1996－1200.

［5］ 陳新霞，顧呈華，楊明晶，等.三七多糖對(duì)小鼠免疫功能調(diào)節(jié)的研究［J］.江蘇預(yù)防醫(yī)學(xué)，2007，18(3):10－12.

［6］ 崔秀明，徐珞珊，王強(qiáng)，等.三七糖類成分的含量及其變化［J］.現(xiàn)代中藥研究與實(shí)踐，2003(7):21－24.

［7］ 高文遠(yuǎn)，賈偉，段宏泉，等.藥用植物發(fā)酵培養(yǎng)的工業(yè)化探討［J］.中國(guó)中藥雜志，2003，28(5):385－390.

［8］ Zhong J J，Yu J T，Yoshida T.Recent advances in plant cell cultures in bioreactors［J］.World Journal Microbiology Biotechnology，1995，11(4):461－467.

［9］ Zhong J J，Yoshida T.High density cultivation of Perilla frutescens cell suspensions for anthocyanin production:effects of sucrose concentration and inoculumsize［J］.Enzyme Microbial Technology，1995，17(12):1073－1079.

［10］ You X L，Tan X，Dai J L，et al.Large-scale somatic embryogenesis and regeneration of Panax Notoginseng［J］.Plant Cell，Tissue and Organ Culture，2012，108(2):333－338.

［11］ 姜曼花，邱細(xì)敏，劉勝姿，等.白背三七多糖的提取純化及含量測(cè)定［J］.時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2008，19(9):2147－2149.

［12］ Zhao H F，Chen W F，Lu J，et al.Phenolic profiles and antioxidant activities of commercial beers［J］.Food Chemistry，2010，119(3):1150－1158.

［13］ 王晶，劉春明，白鶴龍，等.中藥中皂苷類化合物的抗氧化活性評(píng)價(jià)研究［J］.時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2010，21(6):1485－1487.

［14］ 龐永，白雪梅，姜成哲，等.刺老芽根提取物對(duì)DPPH自由基的清除能力及抑菌作用［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38(11):5844－5845.

［15］ 丁克祥，劉衛(wèi)國(guó).抗衰老實(shí)驗(yàn)與基礎(chǔ)研究［M］.北京:原子能出版社，1995.

［16］ 黃素梅，韋紹龍，韋弟，等.幾種香蕉廢棄物清除DPPH自由基的作用［J］.北方園藝，2012(15):5－8.