唐 成, 陳 露, 安敏敏, 孟 丹, 楊立明, 羅玉明

(1.淮安市高新技術創(chuàng)新中心, 江蘇 淮安 223301;2.淮陰師范學院 生命科學學院 江蘇省環(huán)洪澤湖生態(tài)農業(yè)生物技術重點實驗室, 江蘇 淮安 223300;3.南京師范大學 生命科學學院, 江蘇 南京 210046)

水稻幼苗葉片應答稻瘟病侵染的差異蛋白譜分析

唐 成1, 陳 露2,3, 安敏敏2, 孟 丹2, 楊立明2, 羅玉明2

(1.淮安市高新技術創(chuàng)新中心, 江蘇 淮安 223301;2.淮陰師范學院 生命科學學院 江蘇省環(huán)洪澤湖生態(tài)農業(yè)生物技術重點實驗室, 江蘇 淮安 223300;3.南京師范大學 生命科學學院, 江蘇 南京 210046)

為了探討水稻感病基因型種質響應稻瘟病侵染的蛋白質表達譜的變化規(guī)律和作用途徑,以水稻感稻瘟病種質日本晴為材料,采用接種稻瘟病菌分生抱子懸浮液,24,48和72 h后提取葉片蛋白質,采用iTRAQ蛋白質組學技術研究稻瘟病脅迫下水稻葉片蛋白質組的變化．結果表明,稻瘟病侵染誘導了水稻幼苗葉片內涉及氧化還原平衡、防御、信號傳導、糖和能量代謝、氨基酸代謝、光合作用,以及蛋白質代謝等代謝途徑相關的53個蛋白質的表達量發(fā)生了改變．GO分析表明稻瘟病主要調控了植株體內細胞內平衡、代謝過程和蛋白質代謝等生物學過程．稻瘟病侵染激活了活性氧代謝、防御,以及熱休克蛋白等相關的途徑,而抑制了蛋白質生物合成過程．結合這些差異表達蛋白的豐度變化結合它們可能的功能,描繪了水稻應答稻瘟病侵染的蛋白質代謝網絡,有助于在蛋白質水平上了解其應答過程．

水稻稻瘟病; 差異表達蛋白質; 代謝途徑; iTRAQ技術

0 引言

關于水稻抗稻瘟病相關的蛋白質組學研究報道目前尚不多見．Kim 等人[1]以萌發(fā)的稻瘟病菌分生孢子及附著胞正在形成時的分生孢子為實驗材料進行的,結果鑒定了5個新的稻瘟病菌差異表達蛋白,并且進一步研究了差異表達蛋白在附著胞形成過程中的作用．謝娟等[2]發(fā)現稻瘟病菌侵染后抗性品種出現了一個表達量非常大的新蛋白．通過分析感抗品種對稻瘟病菌不同的生理學反應可以推測,這個新蛋白與其他表達量增加的蛋白點一樣與水稻受稻瘟病菌侵染后引起的應答反應相關,是稻瘟病菌侵染后由無毒基因誘導產生的新的功能性蛋白．朱永生等[3]研究了水稻葉鞘接種親和與非親和稻瘟病菌株不同時間的蛋白質表達差異,結果表明,接種親和與非親和菌株后,水稻葉片具有相似的也有不同的蛋白質表達差異．并且這些差異無論是在各個處理時間之間內還是在各個處理之間都存在一定的規(guī)律性．縱向的比較分析表明,由非親和反應誘導產生的抗性蛋白質在數量與表達量上均要高于由親和反應誘導產生的蛋白質．上述以雙向電泳結合質譜技術的蛋白組學研究有助于在蛋白質水平上了解水稻水稻稻瘟病抗性的分子機制．目前,基于液相色譜-質譜技術的蛋白質組學技術的快速發(fā)展和應用為開展植物重要性狀的分子機制的研究提供了一種新的平臺．該技術在蛋白質分離的數目和定量的準確性等方面具有更大的優(yōu)勢[4]．

本文利用基于同位素相對標記與絕對定量技術(iTRAQ)的蛋白質組學方法分析了水稻感病種質日本晴幼苗葉片在受稻瘟病菌侵染后的差異蛋白質表達譜的變化,發(fā)掘出稻瘟病誘導的蛋白質變化規(guī)律,同時通過生物信息學技術分析了上述差異表達蛋白的生物學過程、分子功能和細胞定位,并對上述稻瘟病應答蛋白參與的分子網絡進行了發(fā)掘．

1 材料與方法

1.1 水稻幼苗培養(yǎng)和稻瘟病菌侵染

實驗選用的水稻材料為感病種質日本晴,在智能人工氣候箱中用1/2 Hoagland營養(yǎng)液培養(yǎng),晝/夜溫度分別為28℃和26℃,相對濕度為 70%～80%．當幼苗長至1葉1心時,進行噴霧接種處理．所接種的稻瘟病病菌菌株為淮安本地的稻瘟病菌混合生理小種．對照材料是在水稻幼苗的葉片上均勻噴霧接種緩沖液,接菌處理株則是在葉片上噴霧接種．在接種后的第24,48和72 h取樣．每個樣品設置3個重復．

1.2 蛋白質的提取

水稻幼苗葉片在液氮中研磨,按照1:10(W/V)加入裂解液(7 mol/L尿素,2 mol/L硫脲,4%CHAPS),渦旋混勻．室溫下超聲60 s,浸提30 min．然后在10℃下，14 000 rpm,離心1 h,小心取出上清液,并用Bio-Rad 蛋白定量試劑盒進行定量．上清液分裝后凍存于-80℃．

1.3 蛋白質酶解和iTRAQ標記

取200 μg蛋白溶液置于離心管中,加入4 μL還原試劑,60℃反應1 h,加入2 μL半胱氨酸-阻斷劑,室溫10 min．將還原烷基化后的蛋白溶液加入超濾管中,12 000 rpm離心20 min,棄掉收集管底部溶液．加入iTRAQ試劑盒中的溶解液100 μL,12 000 rpm離心20 min,棄掉收集管底部溶液,重復3次,更換新的收集管,在超濾管中加入胰蛋白酶,總量4 μg(與蛋白質量比1:50),體積50 μL,37℃反應過夜．12 000 rpm離心20 min,酶解消化后的肽段溶液離心于收集管底部．再加入50 μL溶解液,12 000 rpm離心20 min,與上步合并,收集酶解后的樣品．

從冰箱中取出iTRAQ試劑,平衡到室溫,將iTRAQ試劑離心至管底．向每管iTRAQ試劑中加入150 μL異丙醇,渦旋振蕩,離心至管底．取50 μL樣品,將iTRAQ試劑填加到樣品中,渦旋振蕩,離心至管底,室溫反應2 h．然后加入100 μL水終止反應．其中對照樣品、24，48和72 h的樣品分別用113、114、115和116進行標記．

1.4 酶解肽段的分離、LC-MS/MS質譜分析和蛋白質鑒定

酶解肽段的分離、LC-MS/MS質譜分析和蛋白質鑒定參考zhu等[5]人的方法,并作簡要修改,混合標記后的樣品用50 μL流動相A(98%H2O,2%乙腈,pH 10)溶解,14 000 rpm離心20 min,取上清液待用．取50 μL準備好的樣本進樣．用流動相B(98%乙腈,2% H2O,pH 10),洗脫,流速為0.7 mL/min．根據紫外監(jiān)測情況,將RP分離得到的組份合并為10個,合并時采用30 μL 2% ACN,0.1% FA,加入第一個離心管,渦旋振蕩并離心后,轉入第二個離心管,依次直至合并組份最后一管．上述分級后的多肽樣品經12 000 rpm離心10 min,吸取上清液進行LC分離和MS/MS(AB Sciex TripleTOFTM5600)分析．質譜數據用ProteinPilot 4.0軟件檢索本地化的水稻蛋白質數據庫．

1.5 差異表達蛋白的生物信息學分析

使用Pfam數據庫[6]和InterPro數據庫[7]進行差異蛋白的功能分類．對于注釋為未知或假定的蛋白的身份,在NCBI蛋白質數據庫中進行同源蛋白檢索．使用iProClass Gene Ontology進行差異表達蛋白質所參與的生物學過程、涉及的分子功能和細胞內定位的分析．

2 結果與分析

2.1 稻瘟病侵染后水稻幼苗葉片表型和稻瘟病浸染應答蛋白質表達譜的變化

在形態(tài)性狀方面,稻瘟病菌浸染后15天后水稻幼苗葉片出現了明顯的變化,葉片上出現了明顯的病斑,日本晴幼苗葉片表現出感病的表型．這與Ribot等[8]和Carrillo等[9]的報道類似,表明水稻材料日本晴是稻瘟病感病種質．

用iTRAQ方法檢測稻瘟病侵染水稻幼苗葉片引起的差異表達的蛋白質,通過比較稻瘟病侵染后的幼苗葉片與對照材料的蛋白質表達量的相對變化,檢測到53個蛋白質在稻瘟病菌侵染前后表現出2倍以上的變化(p<0.05)(表1)．稻瘟病侵染引起了水稻幼苗葉片蛋白質表達豐度的上調或下調,根據差異表達蛋白的豐度變化趨勢,差異蛋白的變化譜大致可以分為三類,類I為受稻瘟病菌侵染蛋白質表達豐度上調的類群,類II為受稻瘟病菌侵染蛋白質表達豐度上調后再下調的類群,類III為受稻瘟病菌侵染蛋白質表達豐度下調的類群(圖1)．這種趨勢與在轉錄水平上檢測到的情況有部分類似[10]．

表1 水稻應答稻瘟病侵染的差異表達蛋白質

圖1 稻瘟病菌侵染水稻葉片后差異表達蛋白質的聚類分析

2.2 差異表達蛋白的鑒定和功能分類

響應稻瘟病侵染的53個差異表達的蛋白質在植物蛋白質數據庫中進行同源比對,50個蛋白質具有明確的功能,3個蛋白質被注釋為未知的蛋白(表1)．基于水稻幼苗葉片的代謝與功能特征,這些蛋白質分為主要的9個類群,包括防御/抗性蛋白、氧化還原、信號轉導、光合作用、糖代謝、能量代謝、蛋白質合成、蛋白質折疊與組裝、氨基酸代謝,以及未知蛋白(圖2)．其中所占比重最大的三個功能類群是防御/抗性蛋白、氧化還原和信號轉導,說明稻瘟病侵染引起了水稻幼苗葉片的自身防御系統(tǒng)的響應,以及對侵害的一種反應．

圖2 稻瘟病菌侵染水稻葉片后差異表達蛋白質的功能分類

2.3 差異表達蛋白的GO分析

為了進一步了解稻瘟病誘導的差異表達蛋白質的功能,對差異表達的蛋白質進行了生物學過程、分子功能和細胞內定位的分析．稻瘟病調控的差異蛋白質主要涉及到細胞內平衡、代謝過程、脅迫應答和蛋白質修飾等生物學過程,同時也調控了光合作用、次生代謝、細胞生長和翻譯等過程(圖3A)．至于差異蛋白質的分子功能分類方面,結合活性(包括RNA結合活性、蛋白質結合活性和碳水化合物結合活性等)是最主要的一族,同時也涉及到水解酶活性、激酶活性、調控因子活性和結構分子活性等(圖3B)．另外,這些差異表達蛋白質的細胞定位主要在細胞核、細胞質、質體和線粒體等部位(圖3C)．上述結果表明稻瘟病侵染誘導了水稻幼苗葉片內多個生物學過程,涉及到多樣化的分子功能和細胞內區(qū)域．這種情況與Bagnaresi等人[10]在轉錄水平上獲得稻瘟病誘導的早期應答的差異表達基因結果類似．

圖3 稻瘟病菌侵染水稻葉片后差異表達蛋白質的GO分析

2.4 差異表達蛋白涉及到葉片的抗氧化系統(tǒng)的應答

響應稻瘟病菌侵染的差異表達的蛋白質中有26個蛋白質是與葉片抗氧化反應相關,這些蛋白質可以分成4類,包括脅迫防御、氧化還原平衡,信號傳導和氨基酸代謝(表1)[11]．在7個脅迫防御類的差異蛋白中,5個蛋白質(胰蛋白酶抑制劑,DREPP2蛋白,病程相關蛋白Bet v I,profilin A 蛋白,類索馬甜蛋白)在稻瘟病菌侵染的葉片中的豐度增加,2個蛋白質(半胱氨酸蛋白酶抑制劑,TPR結構域蛋白)的豐度降低(表1)．其中,病程相關蛋白Bet v I和類索馬甜蛋白是植物體內的主要病程相關蛋白,受病原菌侵染后增強表達[12,13]．植物受到生物脅迫后,組織細胞內的活性氧代謝和氧化還原平衡會受到影響,并進而通過該途徑傳遞脅迫的信號[14]．涉及氧化還原平衡的6個差異表達的蛋白質,包括氧爆發(fā)增強子蛋白,核氧化還原蛋白1-1,過氧化物酶,硫氧還蛋白M,過氧化氫酶前體等,在稻瘟病菌侵染后表達量都增加,表明水稻葉片感稻瘟病后,葉片內的活性氧代謝被激活,并使活性氧的含量增加,進而加重了對葉片的傷害．

植物受到病原菌侵染后,會激發(fā)細胞內的信號途徑以傳導脅迫的作用．特別是受體類激酶,往往是是植物感受病原菌侵染,傳遞脅迫信號的主要途徑．在稻瘟病菌侵染后檢測到SRP受體類蛋白,果糖激酶,磷酸核酮糖激酶表達豐度降低,而磷酸果糖激酶β亞基,類受體蛋白激酶,2-丁酮激酶受稻瘟病誘導豐度增加．由此表明,水稻感染稻瘟病后啟動了不同的信號途徑以傳導機體的免疫應答．另外,與氨基酸代謝相關的蛋白質在稻瘟病菌侵染后表現出表達豐度的變化,包括類抗真菌蛋白、天冬氨酸合成酶、色氨酸合成酶1、S-腺苷甲硫氨酸合成酶2、苯丙氨酸解氨酶．上述這些結果顯示差異表達蛋白質的豐度變化與總體的抗氧化防御應答之間的關系在水稻葉片抗稻瘟病中發(fā)揮著重要作用．

2.5 差異表達蛋白涉及到光合過程、能量代謝和蛋白質代謝

稻瘟病菌侵染誘導了與光合作用相關蛋白質的表達變化．光系統(tǒng)I反應中心亞基II、原葉綠素酸脂還原酶B在稻瘟病菌侵染后豐度降低,暗示著葉綠體結構受到傷害;而轉位酶SECY亞基、細胞色素b5還原酶的豐度增加,說明機體在光合過程受到抑制時,為了滿足體內對能量的需求,光電子傳遞過程的應激性反應的提高．另外,稻瘟病菌侵染過程中,涉及到糖代謝和能量代謝的蛋白質的豐度明顯增強(表1),表明機體需要消耗更多能量以應對稻瘟病的傷害．

另外,稻瘟病菌侵染也誘導了與蛋白質生物合成、蛋白質折疊和修飾等過程的改變．其中涉及到與蛋白質生物合成相關的蛋白質的表達譜在稻瘟病菌侵染后豐度降低,表明水稻葉片感稻瘟病后抑制了蛋白質的合成．而涉及到蛋白質折疊和修飾類的蛋白質群的豐度卻明顯增強,暗示著稻瘟病誘導了水稻葉片內更多的蛋白質變化,需要折疊和修飾類的蛋白質進行調控,進而增強了這類蛋白的表達．

3 結論

稻瘟病菌侵染感病基因型的水稻種質后,誘導了水稻葉片內強烈的應激反應,特別是涉及到氧化還原平衡的蛋白質群的表達譜變化和抗氧化防御類的蛋白質的增強表達．同時,稻瘟病菌侵染也誘導了光合過程的蛋白質的豐度改變,以及代謝類蛋白質變化．這些結果描述了水稻葉片對稻瘟病的應答策略,以及葉片內發(fā)生的一系列事件．

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[責任編輯：蔣海龍]

Proteomic Analysis Reveals an Intimate Protein Pathways
Provoked by Blast in Rice Seedling Leaves

TANG Cheng1, CHEN Lu2,3, AN Min-min2, MENG Dan2, YANG Li-ming2, LUO Yu-ming2

(1.Hi-tech Innovation Center in Huaian City, Huaian Jiangsu 223301, China)(2.Jiangsu Key Laboratory for Eco-Agricultural and Biotechnology Around Hongze Lake/School of Life Sciences, Huaiyin Normal University, Huaian Jiangsu 223300, China)(3.School of Life Science, Nanjing Normal University, Nanjing Jiangsu 210046, China)

To investigate the responses of rice seedlings to blast infection, changes in protein expression were analyzed using a comparative proteomics approach. After infection of blast for 24h, 48h and 72h on two weeks old rice seedlings, 53 differentially expressed proteins were detected. These identified proteins are involved in different biochemical responses and metabolic processes with obvious functional tendencies toward redox homeostasis, defense, signal transduction, protein metabolism, photosynthesis, carbohydrate/energy metabolism, and amino acid metabolism. Gene Ontology analysis reveals primary metabolism, redox homeostasis and protein metabolism are the most highly affected biological processes by rice blast infection. The abundance changes of these proteins, together with their putative functions produce an protein pathways in response to blast infection at the protein level in rice seedling leaves. Such a protein network may contribute to further understand the possible strategy of cellular activities occurring in rice seedling leaves responding to blast infectioin.

rice blast; differentially expressed proteins; metabolic pathways; iTRAQ

2014-06-06

江蘇省農業(yè)科技自主創(chuàng)新基金項目(CX[12]3048); 淮安市農業(yè)科技支撐計劃項目(SN130127); 江蘇省高校優(yōu)秀科技創(chuàng)新團隊資助項目

唐成(1982-),男,江蘇沭陽人,農藝師,碩士,研究方向為水稻品質與分子機理研究. E-mail: yumingluo@163.com

S184; S511

A

1671-6876(2014)04-0322-07