陳世健, 胡建華, 劉 韜

(1湖北民族學(xué)院附屬民大醫(yī)院心內(nèi)科， 湖北 恩施 445000； 2武漢大學(xué)人民醫(yī)院心內(nèi)科, 湖北 武漢 430060)

糖尿病(diabetes mellitus，DM)患者在疾病進(jìn)展的終末期易發(fā)生多種心血管并發(fā)癥，這些心血管并發(fā)癥在很大程度上增加了DM患者致死率和致殘率[1-2]。對糖尿病患者心血管并發(fā)癥的預(yù)防和治療一直是心血管病研究的重要課題。本研究采用一次性鏈脲佐菌素腹腔注射制備大鼠DM模型，觀察參松養(yǎng)心膠囊(Shensongyangxin capsule，SSYX)對DM模型大鼠電生理特性及結(jié)構(gòu)功能變化的影響，為SSYX防治DM的心血管并發(fā)癥提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 動物DM模型制備及分組

雄性SD大鼠45只，體重250～300 g，由武漢大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動物中心提供。動物隨機(jī)分為對照組(CTL組，n=15)、DM組(n=15)和SSYX組(n=15)。DM組和SSYX組采用一次性腹腔注射鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ; 60 mg/kg)制備糖尿病模型，CTL組則給予腹腔注射生理鹽水(1 mL/kg)。大鼠禁食12 h，不禁水，第2天將2%的STZ溶液(溶于檸檬酸緩沖液，pH 4.5, 0.05 mol/L),每只大鼠按65 mg/kg劑量腹腔一次性快速注射[3-4]，注射完1 h后給予食物和充足的水；72 h后尾靜脈采血檢測血糖以評價造模結(jié)果，血糖在16.7 mmol/L以上的大鼠視作造模成功[3-4]，納入本研究。DM造模成功后立即開始藥物干預(yù)，參照文獻(xiàn)[5]SSYX組連續(xù)6周給予SSYX灌胃 (1 g·kg-1·d-1)治療，DM組和CTL組則給予生理鹽水灌胃(2 mL·kg-1·d-1)。

2 主要方法

2.1血漿內(nèi)皮素1(endothelin-1,ET-1)水平的檢測 對3組動物分別于藥物干預(yù)前、干預(yù)后第1、2、4及6周檢測血漿的ET-1水平。大鼠眼球內(nèi)眥靜脈采血1 mL，置于含乙二胺四乙酸的抗凝管，室溫放置1 h后，3 000 r/min離心10 min，分離血漿，置于EP管內(nèi)，置于-80 ℃冰箱保存待用。采用放射免疫法檢測血漿ET-1水平，ET-1檢測試劑盒購自Assaypro，按試劑盒上的說明進(jìn)行具體操作。

2.2心臟超聲檢查 完成藥物干預(yù)后，對所有動物行超聲心動圖檢查評價心功能。大鼠以3%戊巴比妥鈉溶液(60 mg/kg; Sigma)行腹腔注射麻醉，胸部脫毛后仰臥位固定，連接肢體導(dǎo)聯(lián)心電圖，使用心臟超聲診斷系統(tǒng)(Vivid 7型，GE)行心臟超聲檢查，S4線控探頭，圖像深度調(diào)制3.0～5.0 cm，頻率為7.5 MHz，盡量減少扇掃角度。通過M型超聲獲得左室后壁厚度(left ventricular posterior wall dimension, LVPWD)；在心尖四腔心切面測量左室舒張末期內(nèi)徑(left ventricular end-diastolic diameter, LVEDD)及左室收縮末期內(nèi)徑(left ventricular end-systolic diameter, LVESD)；左室射血分?jǐn)?shù)(left ventricular ejection fraction, LVEF)及左室短軸縮短率(left ventricular fractional shortening, LVFS)根據(jù)改良的Simpon公式計算獲得。

2.3體表心電圖的記錄 在3組動物完成藥物干預(yù)后進(jìn)行體表心電圖的記錄。以3%戊巴比妥鈉溶液(60 mg/kg)行腹腔注射麻醉，隨后將大鼠固定于實(shí)驗(yàn)動物臺上，通過溫控電熱毯將動物體溫維持在37 ℃，采用16導(dǎo)電生理系統(tǒng)(埃德公司，澳大利亞)記錄30 min模擬肢體II導(dǎo)聯(lián)心電圖，同時使用Chart 7.0 軟件對心電圖進(jìn)行分析。測量心電圖心率、RR間期、QRS波寬度、QT間期、QTc等指標(biāo)。QTc計算采用公式[6]：QTc = QT/(RR/100)1/2。

2.4離體電生理研究 動物麻醉后開胸，隨后立即取出心臟連接于Langendorff心臟灌流裝置(專利號為200820191402.4)，經(jīng)主動脈逆行灌流，所有動物均給予普通Tyrode’s液灌流，灌流液保持37 ℃恒溫，灌流速度10～12 mL/min，從取出心臟到實(shí)現(xiàn)灌流在2 min內(nèi)完成。具體操作步驟及灌流液要求參照文獻(xiàn)[7-8]。

2.5記錄單相動作電位(monophasic action potential,MAP) 將刺激電極置于左室前游離壁(left anterior free wall,LAF)心外膜行基礎(chǔ)周長為300 ms的S1S1刺激(脈寬2 ms,刺激強(qiáng)度為舒張期起搏閾值的2倍)，記錄電極置于刺激電極周圍1～2 cm處，記錄MAP。待MAP圖形穩(wěn)定后選擇5個連續(xù)的MAP波形，應(yīng)用Chart 7.0軟件測量20%、50%及90%單相動作電位時程(MAPD20、MAPD50及MAPD90)。

2.6測量有效不應(yīng)期(effective refractory period, ERP) 刺激電極置于LAF行程控電刺激，記錄電極置于刺激電極周圍1～2 cm測定ERP。在連續(xù)發(fā)放8個起搏刺激波S1后發(fā)放早搏刺激波S2(S1S1=300 ms，S1S2=300 ms，刺激強(qiáng)度為舒張期起搏閾值的2倍)，S1S2間期自300 ms開始每次減少20 ms直至S1S2=100 ms，隨后以每次減少10 ms的幅度降低S1S2間期，如S2能誘發(fā)出動作電位，則繼續(xù)降低S1S2間期10 ms；如S2不能誘發(fā)出動作電位，則將S1S2增加10 ms，然后以-1 ms反掃直至S2不能誘發(fā)出動作電位。此時的S1S2間期即基礎(chǔ)周長為300 ms時LAF的VERP。

2.7室性心律失常(ventricular arrhythmia，VA)的誘發(fā) 行Burst刺激誘發(fā)VA，將刺激電極置于LAF，給予50 Hz持續(xù)時間2 s的Train刺激，總刺激時間小于2 min。VA持續(xù)時間超過2 s即記為VA可誘發(fā)，超過30 s即記為持續(xù)性VA[9]。

2.8Masson染色評價心肌纖維化 離體電生理實(shí)驗(yàn)完成后，剪除心臟周圍結(jié)締組織和血管，濾紙吸干水分，取左室心肌組織，立即將心臟置于10%中性甲醛溶液中固定，8～12 h后行乙醇梯度脫水，并常規(guī)石蠟包埋切片，行Masson染色。光鏡下心肌細(xì)胞呈紅色，膠原纖維呈藍(lán)綠色，觀察心肌細(xì)胞及膠原纖維染色情況，拍照并電腦存儲。采用Image Pro-Plus 4.5 軟件對心肌纖維化分析，以心肌間質(zhì)膠原容積百分比(collagen volume fraction, CVF)對心肌纖維化進(jìn)行定量。每組各取6個心臟進(jìn)行Masson染色評價心肌纖維化。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

使用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件分析，正態(tài)分布計量資料多組間比較用單因素方差分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示；計數(shù)資料采用2檢驗(yàn)，結(jié)果以率和構(gòu)成比表示，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 動物一般情況

DM組和SSYX組的所有動物在造模72 h后隨機(jī)血糖均大于16.7 mmol/L，全部納入本次研究。在給予普通飼料和充足飲水喂養(yǎng)6周后，DM組死亡2只和SSYX組死亡1只動物，最終納入本研究的動物只數(shù)為：CTL組15只，DM組13只，SSYX組14只。

2 各組大鼠血漿ET-1水平動態(tài)變化

DM組大鼠血漿ET-1水平呈時間依賴性升高，明顯高于其它2組，提示DM大鼠的ET-1在血液中的濃度隨著病變程度的加重而升高。SSYX干預(yù)后ET-1水平有明顯下降，但依然高于CTL組，見圖1。

Figure 1. The plasma levels of ET-1 in the rats with different treatments for 6 weeks.Mean±SD.**P<0.01 vs CTL; ##P<0.01 vs DM.

3 各組大鼠超聲檢測結(jié)果

與CTL組相比，DM組的LVEF、LVFS及E/A均明顯減小(均P<0.01)，而LVEDD、LVESD及LVPWD則明顯增大(均P<0.01)，表明DM組動物的心臟收縮及舒張功能均較CTL組明顯下降，且心臟結(jié)構(gòu)重構(gòu)明顯。與DM組相比，SSYX組大鼠的LVEF、LVFS及E/A較DM組明顯增大，而LVEDD、LVESD及LVPWD則較DM組明顯減小(均P<0.01)。雖然CTL組和SSYX組的上述超聲指標(biāo)在組間比較仍存在統(tǒng)計學(xué)差異(均P<0.05)，但與DM組相比，SSYX組的超聲指標(biāo)更接近CTL組，表明用SSYX治療可以改善DM大鼠的心功能及減輕心臟結(jié)構(gòu)的重構(gòu)，見表1。

表1 3組動物藥物干預(yù)6周后的超聲指標(biāo)比較

4 各組動物心電圖的結(jié)果

與CTL組相比，DM組的心率減慢，RR間期、QRS波寬度、QT間期及QTc均延長(均P<0.01)；SSYX組的RR間期、QRS波寬度、QT間期及QTc雖較CTL組延長(均P<0.05)，但明顯短于DM組(均P<0.01)，此外，SSYX組的心率雖較CTL組減慢但快于DM組(均P<0.05)，見表2。

表2 各組動物心電圖指標(biāo)的比較

5 各組動物離體電生理研究結(jié)果的比較

與CTL組相比，DM組的VERP、MAPD20、MAPD50、MAPD90及VA誘發(fā)率均增大(均P<0.05)；與CTL組相比，SSYX組的VERP、MAPD20、MAPD50、MAPD90及VA誘發(fā)率均增大(均P<0.05)；與DM組相比，SSYX組的VERP、MAPD20、MAPD50、MAPD90及VA誘發(fā)率均減小(均P<0.01)，見圖2及表3。

Figure 2. The examples of monophasic action potential and ventricular arrhythmia (VA) in the rats with different treatments.

表3 各組動物離體電生理指標(biāo)的比較

*P<0.05,**P<0.01vsCTL;#P<0.05,##P<0.01vsDM.

6 各組動物Masson染色及心肌膠原纖維定量分析結(jié)果

CTL組的心肌纖維呈束狀分布，排列整齊、致密，斷裂不明顯，膠原纖維堆積少；DM組的心肌纖維呈現(xiàn)進(jìn)行性排列紊亂、增粗甚至斷裂，肌纖維間隙明顯增寬，并可見大量異常膠原纖維堆積；SSYX組上述現(xiàn)象均明顯減輕，心肌間質(zhì)膠原減少。在隨后進(jìn)行的心肌膠原纖維定量分析中我們發(fā)現(xiàn)，DM組的心肌間質(zhì)CVF顯著高于CTL組(17.76±5.21vs4.76±1.23)，而SSYX組的心肌間質(zhì)CVF雖高于CTL組(10.23±3.45vs4.76±1.23,P<0.01)，但較DM組明顯減少(10.23±3.45vs17.76±5.21,P<0.01)，見圖3。以上結(jié)果說明SSYX治療能明顯改善DM引起的心肌膠原重構(gòu)，減輕心肌纖維化程度。

Figure 3. The results of myocardial Masson staining in the rats with different treatments (×400).Mean±SD.n=6.** P<0.01 vs CTL; ##P<0.01 vs DM.

討 論

DM患者在疾病的進(jìn)展過程中可出現(xiàn)心功能不全的表現(xiàn)，早期以心臟舒張功能障礙為特點(diǎn)，隨后可合并心臟收縮功能障礙，這種并非由冠心病、高血壓或瓣膜性心臟病導(dǎo)致的心力衰竭常被稱為糖尿病心肌病[10-11]。鑒于DM可導(dǎo)致患者發(fā)生多種心血管病并發(fā)癥，而這些并發(fā)癥往往是患者死亡的重要原因，因此尋求預(yù)防和治療這些心血管病并發(fā)癥的藥物顯得尤為重要。SSYX是祖國醫(yī)學(xué)中依據(jù)絡(luò)病學(xué)理論研制而成的一種復(fù)方制劑。既往研究發(fā)現(xiàn)，SSYX在慢性心力衰竭模型中具有改善心功能及抑制電重構(gòu)的作用[12]。據(jù)此我們推測SSYX對DM或許也具有上述作用，為驗(yàn)證這一猜測我們開展了本次實(shí)驗(yàn)。

本研究采用大劑量STZ腹腔注射制備DM大鼠模型，利用了STZ具有選擇性破壞胰島β細(xì)胞引起胰島素分泌減少，進(jìn)而導(dǎo)致血糖升高和糖尿病發(fā)生的作用。在本研究中，未經(jīng)藥物干預(yù)的DM大鼠經(jīng)6周喂養(yǎng)后出現(xiàn)心臟收縮和舒張功能均發(fā)生障礙、心肌間質(zhì)膠原蛋白堆積、QT間期和APD均延長及室性心律失常誘發(fā)率增加的改變。而在給予SSYX干預(yù)的DM大鼠中，我們發(fā)現(xiàn)SSYX能顯著改善DM大鼠心功能、降低心肌纖維化程度及抑制電重構(gòu)及室性心律失常的發(fā)生。針對SSYX發(fā)揮上述作用的機(jī)制我們推測與其降低DM大鼠血漿ET-1水平有關(guān)。高血糖可導(dǎo)致心肌發(fā)生缺血缺氧[13-15]，而心肌缺血缺氧又可導(dǎo)致ET-1持續(xù)分泌[16]。既往研究在DM患者和DM動物模型中均發(fā)現(xiàn)血漿ET-1水平持續(xù)升高及心肌組織ET受體表達(dá)的增加[17-19]。這些研究還證實(shí)升高的ET-1水平與DM動物心肌結(jié)構(gòu)重構(gòu)與電重構(gòu)的發(fā)生及心功能下降密切相關(guān)，而ET-1受體阻滯劑卻對這些改變具有治療作用[17-22]。在本研究中，我們同樣觀察到隨著DM的進(jìn)展，DM組大鼠血漿ET-1水平呈現(xiàn)明顯升高的趨勢，而在給予SSYX干預(yù)后，SSYX組的DM大鼠血漿ET-1水平較DM組顯著下降，SSYX降低DM大鼠血漿ET-1水平作用可能發(fā)揮與ET-1受體阻滯劑相似的作用。此外，SSYX治療降低DM大鼠血漿ET-1水平具體機(jī)制可能與SSYX具有擴(kuò)張冠狀動脈，增加血流，從而改善心肌缺血缺氧的作用有關(guān)[23-24]。

總之，SSYX具有減輕DM大鼠心室電重構(gòu)和結(jié)構(gòu)重構(gòu)及改善心功能的作用，其機(jī)制可能與SSYX降低DM大鼠血漿ET-1水平有關(guān)。

[參 考 文 獻(xiàn)]

[1] Gallego M, Alday A, Urrutia J, et al. Transient outward potassium channel regulation in healthy and diabetic hearts [J]. Can J Physiol Pharmacol, 2009, 87(2):77-83.

[2] Battiprolu PK, Cillette TG, Wang ZV, et al. Diabetic cardiomyopathy: mechanisms and therapeutic targets[J]. Drug Discov Today Dis Mech, 2010, 7(2):e135-e143.

[3] 金可可，林艷紅，王萬鐵，等. 血糖波動對糖尿病大鼠腎小球內(nèi)皮細(xì)胞和腎小管上皮細(xì)胞凋亡的影響[J]. 中國病理生理雜志, 2007, 23(3):570-573.

[4] Tsch?pe C, Walther T, K?niger J, et al. Prevention of cardiac fibrosis and left ventricular dysfunction in diabetic cardiomyopathy in rats by transgenic expression of the human tissue kallikrein gene[J]. FASEB J, 2004, 18(7):828-835.

[5] 楊 軍，周先令，褚 春，等. 參松養(yǎng)心膠囊改善心力衰竭大鼠QT離散度及縫隙連接蛋白43的表達(dá)[J]. 中國動脈硬化雜志, 2011,19(3):197-201.

[6] Zhang Z, He YX, Dipika T, et al. Functional roles of Cav1.3(1D) calcium channels in atria insights gained from gene- targeted null mutant mice[J]. Circulation, 2005, 112(13):1936-1944.

[7] 劉 韜，秦 牧，胡 河，等. 激活蛋白激酶C對心室電整復(fù)性及心室心律失常的影響[J]. 中華心血管病雜志, 2012, 40(9):780-785.

[8] 劉 韜，秦 牧，陳 陣，等. 慢性心力衰竭兔離體心室電整復(fù)性變化對室性心律失常的影響[J]. 中華心血管病雜志, 2012, 40(6):467-471.

[9] Ninio DM, Murphy KJ, Howe PR, et al. Dietary fish oil protects against stretch-induced vulnerability to atrial fibrillation in a rabbit model [J]. J Cardiovasc Electrophysiol, 2005, 16(11):1189-1194.

[10] Bell DS. Diabetic cardiomyopathy[J]. Diabetes Care, 2003, 26(10):2949-2951.

[11] Wichi R, Malfitano C, Rosa K, et al. Noninvasive and invasive evaluation of cardiac dysfunction in experimental diabetes in rodents[J]. Cardiovasc Diabetol, 2007, 6:14.

[12] 王 唏，段慧楠，胡 娟，等. 參松養(yǎng)心膠囊對心功能及心臟電生理影響的實(shí)驗(yàn)研究[J]. 中華心律失常學(xué)雜志，2012, 16(6):417-421.

[13] 任 駿. 糖尿病心肌病的基礎(chǔ)與臨床研究現(xiàn)狀[J]. 心血管病學(xué)進(jìn)展, 2001, 22(5):299-302.

[14] Joffe II,Travers KE,Perreault-Micale CL, et al. Abnormal cardiac function in the streptozotocin-induced non-insulin-dependent diabetic rat: Non-invasive assessment with doppler echocardiography and contribution of the nitric oxide pathway[J]. J Am Coll Cardiol, 1999, 34(7):2111-2119.

[15] Karamsetty MR, Klinger JR, Hill NS. Phytoestrogens restore nitric oxide mediated relaxation in isolated pulmonary arteries from chronically hypoxic rats [J]. J Pharmacol Exp Ther, 2001, 297(3):968-974.

[16] 劉 韜，秦 牧，陳 陣，等. 長期血漿內(nèi)皮素-1水平升高對異丙腎上腺素慢性致室性心律失常作用的影響[J]. 中華心律失常學(xué)雜志，2013, 17(6):449-454.

[17] Chen S, Evans T, Mukherjee K, et al. Diabetes-induced myocardial structural changes: role of endothelin-1 and its receptors[J]. J Mol Cell Cardiol, 2000, 32(9):1621-1629.

[18] Erbas T, Erbas B, Kabakci G, et al. Plasma big-endothelin levels, cardiac autonomic neuropathy, and cardiac functions in patients with insulin-dependent diabetes mellitus[J]. Clin Cardiol, 2000, 23(4):259-263.

[19] Makino A, Kamata K. Elevated plasma endothelin-1 level in streptozotocin- induced diabetic rats and responsiveness of the mesenteric arterial bed to endothelin-1[J]. Br J Pharmacol, 1998, 123(6):1065-1072.

[20] Ding Y, Zou R, Judd RL, et al. Endothelin-1 receptor blockade prevented the electrophysiological dysfunction in cardiac myocytes of streptozotocin-induced diabetic rats[J]. Endocrine, 2006, 30(1):121-127.

[21] Verma S, Arikawa E, McNeill JH. Long-term endothelin receptor blockade improves cardiovascular function in diabetes [J]. Am J Hypertens, 2001, 14(7Pt1):679-687.

[22] Hileeto D, Cukiernik M, Mukherjee S, et al. Contributions of endothelin-1 and sodium hydrogen exchanger-1 in the diabetic myocardium[J]. Diabetes Metab Res Rev, 2002, 18(5):386-394.

[23] 陳國鋒，王立成，楊 斌，等. 丹參酮Ⅱ-A磺酸鈉注射液在體外循環(huán)中對心肌缺血/再灌注損傷保護(hù)作用的研究[J].中國心血管病研究, 2009, 7(11):812-816.

[24] 沈 賢，莫曉燕，杜曉陽. 赤芍總苷對大鼠缺血損傷心肌細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用[J]. 中國藥理學(xué)通報, 2007, 23(10):1300-1305.