孫 湛， 鞏雪俐， 冉新建， 馬 琪， 龍 梅△

(新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 1機(jī)能中心實(shí)驗(yàn)室， 2病理生理學(xué)教研室，新疆 烏魯木齊 830054)

腦血管疾病(cerebrovascular disease, CVD)是指由于各種腦血管病變所引起的腦部病變，發(fā)病率和致殘率很高，給患者和家庭帶來痛苦和沉重的負(fù)擔(dān)，其治療關(guān)鍵是改善缺血區(qū)的血供，挽救瀕死的神經(jīng)元。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)能夠促進(jìn)半暗帶血管新生,有效改善半暗帶血供，從而挽救瀕死神經(jīng)元，故已成為治療缺血性腦損傷的研究熱點(diǎn)。慢病毒載體尤其適用于干細(xì)胞，具有目的基因可整合到染色體上，穩(wěn)定表達(dá)時(shí)間較長(zhǎng)，不易引發(fā)宿主免疫反應(yīng)等諸多優(yōu)點(diǎn)。

富半胱氨酸蛋白61(cysteine-rich 61，Cyr61/CCN1)是即刻早期基因編碼的富半胱氨酸蛋白，是近年發(fā)現(xiàn)的一種分泌型基質(zhì)信號(hào)蛋白[1]，能上調(diào)多種生長(zhǎng)因子的表達(dá)，如VEGF及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子等；能促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞黏附、增殖和遷移，調(diào)節(jié)血管生成[2]。本研究通過設(shè)計(jì)并構(gòu)建出攜帶有含增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescent protein，EGFP)及大鼠CCN1目的基因的慢病毒表達(dá)載體，觀察外源性CCN1能否促進(jìn)BMSCs的生長(zhǎng)和遷移，為BMSCs移植治療缺血性腦損傷提供理論基礎(chǔ)。

材 料 和 方 法

1 動(dòng)物和材料

6～8周齡雄性Wistar大鼠1只，體質(zhì)量120 g，由新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

STBL3感受態(tài)細(xì)胞、基因過表達(dá)慢病毒載體、慢病毒轉(zhuǎn)染試劑和293T細(xì)胞為輝駿生物公司產(chǎn)品；高純度質(zhì)粒提取試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒、總RNA提取試劑盒和Quant一步法RT-PCR試劑盒為北京天根生化科技有限公司產(chǎn)品；限制性核酸內(nèi)切酶為Ferentas產(chǎn)品；PrimeScript反轉(zhuǎn)錄酶、PCR擴(kuò)增試劑盒和DL2000 DNA marker為大連TaKaRa產(chǎn)品；T4 DNA連接試劑盒為Promega產(chǎn)品；KOD Plus DNA聚合酶為Toyobo產(chǎn)品；低糖DMEM和胎牛血清為Gibco產(chǎn)品；Cyr61/CCN1 Ⅰ抗為Santa Cruz產(chǎn)品；MTT為博士德產(chǎn)品；其余試劑為國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口化學(xué)純或分析純。

2 方法

2.1載體的構(gòu)建和鑒定 根據(jù)大鼠CCN1 mRNA序列(NCBI GenBank，基因編號(hào)：NM_031327.2)，全基因合成CCN1基因(CDS區(qū)域序列)并基因測(cè)序驗(yàn)證。引物由上海生工合成，上游引物5’-GCGGAATTCTGCGCGCCACAATGAGCTC-3’，劃線部分為EcoR I酶切位點(diǎn)；下游引物5’-GACGGATCCCCTTTAGTCCCTGAACTTGTG-3’，劃線部分為BamH I酶切位點(diǎn)。將全基因合成的CCN1構(gòu)建至過表達(dá)載體CAG-MCS-EF1-copGFP，并轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞DH5α，氨芐青霉素篩選培養(yǎng)，平板分別挑取4個(gè)克隆，用過表達(dá)載體通用引物進(jìn)行菌落PCR篩選。篩選得到的陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序，以驗(yàn)證重組克隆中插入片段序列是否與CDS區(qū)域的基因序列一致。選取符合預(yù)期大小擴(kuò)增片段，送測(cè)序驗(yàn)證。

2.2過表達(dá)慢病毒的包裝 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞293T細(xì)胞，按照6× 106個(gè)細(xì)胞數(shù)接種于10 cm培養(yǎng)皿中。轉(zhuǎn)染前2 h將培養(yǎng)基更換為不含雙抗DMEM+10%FBS培養(yǎng)基，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 h。將包裝質(zhì)粒和構(gòu)建好的慢病毒表達(dá)載體在生理鹽水中混合，并加入轉(zhuǎn)染試劑，孵化20 min后緩慢均勻滴入培養(yǎng)皿中并混勻，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)8 h。倒去含有轉(zhuǎn)染混合物的培養(yǎng)基，PBS洗滌，更換含有100 mL/L小牛血清的新鮮培養(yǎng)基，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染48～72 h后，在倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞發(fā)光(綠色熒光)情況，待確認(rèn)轉(zhuǎn)染成功后，反復(fù)凍融細(xì)胞收集上清液，3 000～4 000 r/min離心15 min，用0.45 μm微孔濾器過濾去除所有的細(xì)胞及碎片，濃縮得到高濃度的慢病毒濃縮液，-80 ℃保存。

2.3孔稀釋法測(cè)定病毒滴度 滴度測(cè)定前1 d，為培養(yǎng)好的293T細(xì)胞換液，并將其接種至96孔板中，每孔的細(xì)胞數(shù)目約為(0.3～1.0)×104個(gè)，培養(yǎng)基體積為100 μL/well。將10 μL病毒上清按梯度稀釋10～106倍，將稀釋好的病毒液100 μL依次加到細(xì)胞孔中，繼續(xù)放入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。48 h后，每孔分別加入新鮮培養(yǎng)基100 μL。96 h后觀察熒光表達(dá)情況，數(shù)出最后2個(gè)含有熒光細(xì)胞的孔中的熒光細(xì)胞個(gè)數(shù)；病毒原液的滴度值=熒光細(xì)胞個(gè)數(shù)/稀釋后的病毒量。

2.4大鼠BMSCs分離及培養(yǎng) 采用貼壁篩選法獲取大鼠BMSCs，將Wistar大鼠斷頸處死，無菌條件下剪取四肢骨骼，用低糖DMEM反復(fù)沖洗大鼠四肢骨髓腔，將含有骨髓細(xì)胞的培養(yǎng)液1 500 r/min離心10 min，棄去上清，用含10%FBS的DMEM低糖培養(yǎng)基重懸并接種于培養(yǎng)皿中。在37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。接種培養(yǎng)約24 h后換液，棄去未貼壁細(xì)胞。以后隔天換液，連續(xù)3次后改為每周換液2次。每天觀察細(xì)胞形態(tài)并作記錄。原代培養(yǎng)的細(xì)胞鋪滿整個(gè)培養(yǎng)瓶底面約80%時(shí)，即可用0.125%胰酶將貼壁細(xì)胞消化分離，然后按照1∶2比例傳代接種培養(yǎng)，以此獲得大鼠BMSCs，采用第3代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.5CCN1慢病毒轉(zhuǎn)染大鼠BMSCs 將第3代大鼠BMSCs進(jìn)行胰酶消化，將細(xì)胞懸液(細(xì)胞數(shù)約為4×105)接種在24孔培養(yǎng)板中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞融合度達(dá)到約80%后，將Lenti-GFP-CCN1按感染復(fù)數(shù)(MOI)=1×106v.g./cell加入DMEM培養(yǎng)基中，同時(shí)加入4～8 mg/L polybrene增強(qiáng)轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染BMSCs 96 h后觀察GFP基因的表達(dá)情況。

2.6Western blotting檢測(cè)大鼠BMSCs中CCN1蛋白的表達(dá) Lenti-GFP和Lenti-GFP-CCN1感染BMSCs，收集細(xì)胞上清液，Lenti-GFP感染細(xì)胞為陰性對(duì)照，未處理為空白對(duì)照，Western blotting法檢測(cè)CCN1蛋白表達(dá)。BCA法測(cè)定樣本的蛋白濃度，制備電泳凝膠，進(jìn)行SDS-PAGE。電泳結(jié)束后進(jìn)行膜處理、轉(zhuǎn)膜。5% 脫脂奶粉4 ℃封閉過夜；加入Ⅰ抗4 ℃過夜；PBS洗膜3次，每次10 min；加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的Ⅱ抗(稀釋度1∶6 000)，室溫孵育1 h棄Ⅱ抗，PBS室溫振搖洗膜3次，每次10 min。加入顯色液，避光顯色至出現(xiàn)條帶時(shí)放入雙蒸水中終止反應(yīng)。

2.7CCN1對(duì)BMSCs生長(zhǎng)的影響 采用MTT比色實(shí)驗(yàn)。收集BMSCs細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1×108/L，按100 μL/well接種于96孔板中，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)8 h后加入Lenti-GFP，Lenti-GFP-CNN1感染BMSCs 96 h后，滴加2 g/L MTT(50 μL/well)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸出孔內(nèi)培養(yǎng)液后，加入DMSO液(150 μL/well)，將培養(yǎng)板置于微孔板振蕩器上振蕩10 min，使結(jié)晶溶解，在570 nm波長(zhǎng)測(cè)定吸光度(A)值，每個(gè)濃度重復(fù)5孔。

2.8劃痕愈合實(shí)驗(yàn)檢測(cè)BMSCs遷移 對(duì)照孔和實(shí)驗(yàn)孔分別以Lenti-GFP和Lenti-GFP-CNN1感染BMSCs，48 h 后更換為含 0.5%胎牛血清的培養(yǎng)液并做劃痕標(biāo)記，顯微鏡下記錄不同時(shí)點(diǎn)細(xì)胞向劃痕遷移情況。按公式計(jì)算該劃痕不同時(shí)點(diǎn)的愈合速率。愈合速率(%)=(初始劃痕寬度值-相應(yīng)點(diǎn)劃痕寬度值) /初始劃痕寬度值×100%。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)，組間兩兩比較采用最小顯著性差異法(LSD法)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 CCN1基因克隆PCR產(chǎn)物凝膠電泳結(jié)果

PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析，基因片段的大小為1 140 bp，與預(yù)期一致，見圖1。

Figure 1. Amplification of the gene fragment of CCN1 by PCR.M: DNA marker; 1: CCN1 PCR product.

2 CCN1慢病毒轉(zhuǎn)染BMSCs

Lenti-GFP-CCN1轉(zhuǎn)染BMSCs，在倒置熒光顯微鏡下觀察,染24 h時(shí)可以觀察到部分綠色熒光，轉(zhuǎn)染96 h時(shí)，GFP表達(dá)明顯增加，見圖2。

Figure 2. The cell transfected efficiency at different time points (×100). A: 24 h; B: 48 h; C: 96 h.

3 Lenti-GFP-CCN1轉(zhuǎn)染BMSCs

Lenti-GFP和Lenti-GFP-CCN1轉(zhuǎn)染BMSCs，收集細(xì)胞上清液，Lenti-GFP轉(zhuǎn)染細(xì)胞為陰性對(duì)照，未處理為空白對(duì)照，Western blotting法檢測(cè)表明CCN1成功重組到慢病毒中，見圖3。

Figure 3. Expression of CCN1 in BMSCs transfected with Lenti-GFP-CCN1.Lane 1: non-transfection group; Lane 2: negative control group (transfected with Lenti-GFP); Lane 3: transfection group (transfected with Lenti-GFP-CCN1).

4 CCN1對(duì)BMSCs細(xì)胞存活率的影響

MTT比色結(jié)果顯示，Lenti-GFP-CCN1轉(zhuǎn)染BMSCs后4 d，細(xì)胞存活率較空白組及Lenti-GFP組增加，但差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖4，表明CCN1對(duì)正常細(xì)胞存活率沒有顯著影響。

Figure 4. Effect of CCN1 on proliferation of BMSCs.Mean±SD.n=5.

5 CCN1對(duì)細(xì)胞遷移能力的影響

劃痕損傷4 d后，與空白組及Lenti-GFP 組細(xì)胞相比，Lenti-GFP-CCN1轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞更趨于愈合，CCN1明顯增強(qiáng)了BMSCs的遷移能力，見表1。

表1 CCN1對(duì)大鼠BMSCs細(xì)胞劃痕愈合程度的影響

討 論

腦血管病是發(fā)病率和致殘率很高的疾病,其治療關(guān)鍵是改善缺血區(qū)的血供，挽救瀕死的神經(jīng)元。干細(xì)胞能夠促進(jìn)半暗帶血管新生,有效改善半暗帶血供，從而挽救瀕死神經(jīng)元，故已成為治療缺血性腦損傷的研究熱點(diǎn)[3-5]。然而，缺血損傷區(qū)大量的氧自由基能明顯抑制BMSCs與損傷區(qū)的血管內(nèi)皮細(xì)胞及細(xì)胞外基質(zhì)的黏附，導(dǎo)致BMSCs“失巢性凋亡”并限制其促進(jìn)血管新生的作用[6]。失巢凋亡是由于細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)和其它細(xì)胞失去接觸而誘導(dǎo)的一種程序化死亡形式，發(fā)生在BMSCs在移植到缺血半暗帶的起始階段。因此，只有能夠與細(xì)胞外基質(zhì)黏附，具有抗失巢凋亡能力的BMSCs才能在脈管系統(tǒng)中生存下來，才能發(fā)揮治療作用。

Cyr61/CCN1是即刻早期基因編碼的富半胱氨酸蛋白，它與細(xì)胞表面和細(xì)胞外基質(zhì)有關(guān)，是一種基質(zhì)相關(guān)蛋白，可與肝素和多種細(xì)胞整合素相互作用，受多種因素調(diào)節(jié)，如生長(zhǎng)因子、 激素、 藥物等?？山閷?dǎo)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、 細(xì)胞黏附、 遷移和趨向性，促進(jìn)細(xì)胞存活和血管形成?；|(zhì)信號(hào)蛋白CCN1可能在調(diào)控內(nèi)皮祖細(xì)胞增殖、分化，參與血管發(fā)生中扮演重要角色。在成體血管組織中，CCN1幾乎在所有血管細(xì)胞包括內(nèi)皮、平滑肌和纖維細(xì)胞等都有表達(dá)，誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移是CCN1促進(jìn)血管生成的直接作用[7-8]。

慢病毒載體是在人Ⅰ型免疫缺陷病毒基礎(chǔ)上，對(duì)其特異性基因骨架進(jìn)行改造而形成的。慢病毒載體能利用自身逆轉(zhuǎn)錄酶和整合酶將自身RNA轉(zhuǎn)錄為cDNA整合到宿主細(xì)胞染色體中，使其有效表達(dá)外源基因，是當(dāng)前基因治療中載體研究的熱點(diǎn)之一，對(duì)分裂細(xì)胞核非分裂細(xì)胞均具有感染能力，能在體內(nèi)長(zhǎng)時(shí)間穩(wěn)定表達(dá)，安全性好[9]。本研究中我們構(gòu)建帶有綠色熒光蛋白的重組慢病毒Lenti-GFP-CCN1，通過倒置熒光顯微鏡觀察，重組慢病毒隨著感染BMSCs時(shí)間的延長(zhǎng)，其感染效率也會(huì)隨之增高，96 h時(shí)達(dá)到最高。分別用重組慢病毒Lenti-GFP-CCN1和Lenti-GFP感染細(xì)胞，應(yīng)用MTT比色法檢測(cè)吸光度值，各組間吸光度值未見顯著差異，表明外源性CCN1對(duì)正常細(xì)胞的存活率沒有明顯影響。另外，我們通過劃痕愈合實(shí)驗(yàn)證實(shí)外源性的CCN1可以促進(jìn)大鼠BMSCs細(xì)胞劃痕的愈合。綜上分析，CCN1修飾BMSCs后可以促進(jìn)BMSCs的生長(zhǎng)與遷移，為外源性CCN1促進(jìn)BMSCs的遷移作用及其機(jī)制研究奠定了基礎(chǔ)，并可望為缺血性腦病的基因治療奠定基礎(chǔ)。

[參 考 文 獻(xiàn)]

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