柳悄然， 張?jiān)谠疲?于曉明， 潘祥林， 王涓冬， 劉軍莉

(1山東大學(xué)醫(yī)學(xué)院，山東 濟(jì)南 250012；山東大學(xué)第二醫(yī)院 2腫瘤防治中心， 3臨床分子實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250033)

肺癌嚴(yán)重危害人類(lèi)健康，發(fā)病率及死亡率高，目前的治療方法副作用大，效果不理想，需要探索高效低毒的藥物。冬凌草甲素是從冬凌草中提取的一種四環(huán)二萜類(lèi)化合物，具有抗炎、抗菌、降壓、抗腫瘤等多種藥理作用[1-2]。研究顯示，冬凌草甲素通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制血管生成等多種機(jī)制發(fā)揮抗腫瘤作用[3]，但關(guān)于冬凌草甲素對(duì)肺癌細(xì)胞的侵襲和遷移的作用研究較少，本文就此進(jìn)行研究，以進(jìn)一步揭示冬凌草甲素抗腫瘤作用機(jī)制，為肺癌治療探索有效的方法。

材 料 和 方 法

1 儀器及材料

CO2培養(yǎng)箱(Format)；恒溫離心機(jī)(Heraeus)；酶標(biāo)儀(Bio-Rad)，垂直電泳裝置(Bio-Rad)。NCI-H460細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞研究所；冬凌草甲素購(gòu)自上海詩(shī)丹德生物技術(shù)有限公司(純度≥98%)；RPMI-1640購(gòu)自Gibco；MTT及二甲基亞砜購(gòu)自Sigma；兔抗鼠IgG抗體、鼠抗人β-actin、基質(zhì)金屬蛋白酶2(matrix metalloproteinase 2，MMP-2)和MMP-9抗體購(gòu)自Santa Cruz；細(xì)胞培養(yǎng)板購(gòu)自Corning；Boyden Chamber購(gòu)自Millipore；Western-blot Luminol(ECL)試劑盒購(gòu)自Santa Cruz。

2 方法

2.1NCI-H460細(xì)胞的生長(zhǎng)觀察 NCI-H460肺癌細(xì)胞株在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。胰酶消化，將細(xì)胞接種于12孔培養(yǎng)板，每孔1×105細(xì)胞，分為高劑量(high-dose,HD)組、中劑量(middle-dose,MD)組、低劑量(low-dose,LD)組和對(duì)照(normal,N)組，前3組為實(shí)驗(yàn)組，分別用含40、20和10 μmol/L冬凌草甲素的RPMI-1640細(xì)胞液培養(yǎng)，N組用不含冬凌草甲素的RPMI-1640液培養(yǎng)，連續(xù)培養(yǎng)7 d。每24 h每組取3孔細(xì)胞，用胰酶消化，用0.2%臺(tái)盼藍(lán)染色，以血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，以每組細(xì)胞數(shù)的平均值繪制生長(zhǎng)曲線(xiàn)。

2.2NCI-H460細(xì)胞增殖檢測(cè) 將4組NCI-H460細(xì)胞用胰酶消化，稀釋細(xì)胞為1×107/L，接種于96孔培養(yǎng)板，每組3復(fù)孔，每孔1×103細(xì)胞，終體積200 μL，37 ℃培養(yǎng)24 h、48 h及72 h后，加入MTT 100 μg/well，培養(yǎng)4 h，離心，棄上清，加入DMSO振蕩10 min，用酶標(biāo)儀于570 nm測(cè)吸光度(A)。重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率：細(xì)胞增殖抑制率(%)=(對(duì)照組A值-實(shí)驗(yàn)組A值)/對(duì)照組A值×100%。

2.3NCI-H460細(xì)胞的侵襲實(shí)驗(yàn) 將4組NCI-H460細(xì)胞干預(yù)培養(yǎng)24 h，胰酶消化，制成單細(xì)胞懸液，進(jìn)行Boyden chamber侵襲試驗(yàn)，檢測(cè)細(xì)胞的侵襲能力。下室加含10%胎牛血清的培養(yǎng)基，上室內(nèi)接種2×105細(xì)胞，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)72 h后計(jì)數(shù)穿透濾膜的細(xì)胞數(shù)，表示腫瘤細(xì)胞的侵襲能力。倒置顯微鏡下每孔隨機(jī)選擇5個(gè)200倍顯微鏡視野，統(tǒng)計(jì)視野中的細(xì)胞總數(shù)，計(jì)算3復(fù)孔的平均值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.4劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)NCI-H460細(xì)胞的遷移能力 將4組處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的NCI-H460細(xì)胞用胰酶消化，用PBS洗2遍，重懸細(xì)胞，稀釋細(xì)胞濃度為2×108/L，按每孔1 mL接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每組6復(fù)孔，接種后24 h，用200 μL移液槍頭在培養(yǎng)板底部做“一”字形劃痕，沿劃痕邊緣等間距做3個(gè)標(biāo)記作為觀察點(diǎn)，用PBS洗去劃落的細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，倒置顯微鏡下測(cè)量細(xì)胞遷移的距離，計(jì)算細(xì)胞遷移的平均速率。計(jì)數(shù)每孔劃痕處3個(gè)視野的遷移細(xì)胞數(shù)，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2.5Western blotting檢測(cè)MMP-2和MMP-9的表達(dá) 用胰酶消化收集4組細(xì)胞，將每組細(xì)胞1×106個(gè)裂解，提取蛋白,并測(cè)定蛋白濃度；進(jìn)行SDS-PAGE，將蛋白電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，室溫封閉1 h，加入鼠抗人β-actin、MMP-2和MMP-9抗體，再加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的兔抗鼠IgG抗體，進(jìn)行ECL反應(yīng)顯影并曝光，在Bio-Rad凝膠成像儀中觀察，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。用Quality One軟件分析條帶相對(duì)A值(靶蛋白A/β-actinA)，比較蛋白表達(dá)水平。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，用SPSS 17.0軟件分析。多組資料間的比較用方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 NCI-H460細(xì)胞生長(zhǎng)情況

倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞外形，與N組比較，用冬凌草甲素干預(yù)的NCI-H460細(xì)胞變圓，貼壁延緩，伸展差，懸浮細(xì)胞增多，細(xì)胞密度降低，HD組變化更明顯。細(xì)胞計(jì)數(shù)顯示，4組細(xì)胞數(shù)量間有顯著差異，HD組

Figure 1. Growth curves of NCI-H460 lung cancer cells cultured with 40, 20 and 10 μmol/L of oridonin (HD, MD and LD groups), or without oridonin (N group). Mean±SD. n=3.

2 MTT方法檢測(cè)NCI-H460細(xì)胞增殖

4組細(xì)胞在48 h(P<0.01)及72 h(P<0.01)時(shí)測(cè)定A值均有顯著差異，與N組相比，實(shí)驗(yàn)組A值均降低，HD組

Figure 2. The cell proliferation in experimental groups (HD, MD and LD) and N group was determined by MTT assay.Mean±SD.n=3. **P<0.01 vs experimental groups.

3 NCI-H460細(xì)胞的侵襲能力

細(xì)胞體外侵襲實(shí)驗(yàn)顯示，4組細(xì)胞穿透濾膜的細(xì)胞數(shù)均有顯著差異(P<0.01)，與N組(53.67±6.68)相比，HD組(26.67±5.16)、MD組(36.17±5.08)和LD組(44.33±5.50)穿透細(xì)胞數(shù)明顯減少，表明經(jīng)冬凌草甲素處理的NCI-H460細(xì)胞侵襲能力減弱。

4 NCI-H460細(xì)胞的遷移能力

將4組NCI-H460細(xì)胞做劃痕實(shí)驗(yàn)，計(jì)算細(xì)胞遷移的平均速率及遷移細(xì)胞數(shù)。結(jié)果4組細(xì)胞的平均遷移速率(P<0.01)及遷移細(xì)胞數(shù)(P<0.01)有顯著差異，見(jiàn)表1，N組均高于實(shí)驗(yàn)組，在實(shí)驗(yàn)組中，HD組平均遷移速率及遷移細(xì)胞數(shù)最低。

表1 NCI-H460細(xì)胞的遷移能力

5 Western blotting方法檢測(cè)NCI-H460細(xì)胞的MMP-2和MMP-9的表達(dá)

結(jié)果顯示，4組細(xì)胞均有MMP-2及MMP-9蛋白表達(dá)；以靶蛋白A/β-actinA的比值代表蛋白相對(duì)表達(dá)水平，N組表達(dá)MMP-2(1.16±0.26)及MMP-9(0.90±0.14)均高于實(shí)驗(yàn)組(P<0.01)，HD組表達(dá)MMP-2(0.29±0.09)及MMP-9(0.31±0.06)水平最低，HD組

討 論

肺癌的發(fā)病率和死亡率在全世界范圍內(nèi)持續(xù)升高，已成為惡性腫瘤死因的第一位，而大部分肺癌患者死于腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，探索有效的抑制腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的藥物具有重要意義。

冬凌草甲素是從唇形科香茶菜屬植物冬凌草中提取的二萜類(lèi)化合物，具有明顯的抗腫瘤作用，是中草藥冬凌草抗腫瘤的主要活性成分，對(duì)胃癌、肝癌、胰腺癌、乳腺癌、食管癌、鼻咽癌和結(jié)直腸癌等多種腫瘤細(xì)胞具有抑制作用[4-6]。體外研究顯示，冬凌草甲素可抑制細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，抑制核因子κB、絲裂原活化蛋白激酶、表皮生長(zhǎng)因子受體等相關(guān)信號(hào)通路防止腫瘤發(fā)生，增強(qiáng)吞噬細(xì)胞吞噬作用等[7-8]，冬凌草甲素還可阻遏細(xì)胞周期、下調(diào)端粒酶活性、抑制細(xì)胞膜鈉泵活性、逆轉(zhuǎn)多藥耐藥等[9-11]。關(guān)于冬凌草甲素對(duì)肺癌細(xì)胞作用，研究顯示它能抑制SPC-A-1細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)SPC-A-1細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)A549肺癌細(xì)胞的自吞噬作用[12]。但關(guān)于冬凌草甲素對(duì)肺癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力的影響鮮有報(bào)道。

Figure 3. The protein expression of MMP-2 and MMP-9 was determined by Western blotting. Mean±SD.n=3. **P<0.01 vs other groups.

在本項(xiàng)目中，用冬凌草甲素干預(yù)處理NCI-H460細(xì)胞，進(jìn)行體外增殖、侵襲、遷移能力觀察，結(jié)果經(jīng)冬凌草甲素干預(yù)處理的細(xì)胞生長(zhǎng)減慢，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞數(shù)量明顯低于N組，且與冬凌草甲素劑量明顯相關(guān)，HD組

侵襲和轉(zhuǎn)移是腫瘤惡性程度的重要標(biāo)志，也是導(dǎo)致肺癌患者死亡的主要原因。細(xì)胞外基質(zhì)是惡性腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移的重要組織屏障，MMP能降解細(xì)胞外基質(zhì)中的各種蛋白成分，在惡性腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮關(guān)鍵作用。其中MMP-2和MMP-9是最主要的Ⅳ型膠原酶，已證實(shí)MMP-2和MMP-9在多種腫瘤中表達(dá)，并與腫瘤細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移能力密切相關(guān)，抑制MMP-2和MMP-9的表達(dá)及活性，能抑制腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移[13]。在本實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)冬凌草甲素干預(yù)處理的NCI-H460肺癌細(xì)胞MMP-2和MMP-9表達(dá)下調(diào)，且與冬凌草甲素劑量相關(guān)，HD組最明顯，與NCI-H460細(xì)胞的侵襲、遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，表明冬凌草甲素可通過(guò)下調(diào)MMP-2和MMP-9抑制NCI-H460肺癌細(xì)胞的侵襲、遷移。

本課題通過(guò)體外研究，表明冬凌草甲素能抑制NCI-H460肺癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移能力，并抑制NCI-H460肺癌細(xì)胞表達(dá)MMP-2和MMP-9，為冬凌草甲素用于肺癌治療奠定了基礎(chǔ)。

[參 考 文 獻(xiàn)]

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