焦宏偉， 張 璐， 劉 東， 趙寶華

(河北師范大學生命科學學院，石家莊 050024)

牡丹皮、黃連、大黃提取物對松材線蟲生理代謝的影響

焦宏偉， 張 璐， 劉 東*， 趙寶華*

(河北師范大學生命科學學院，石家莊 050024)

對3種中草藥黃連、牡丹皮、大黃的乙醇提取物毒殺松材線蟲作用機制進行了初步研究。測定了其對線蟲體內(nèi)總糖和蛋白含量的影響，處理前后線蟲體內(nèi)超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、過氧化物酶(POD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)和乙酰膽堿酯酶(AChE)酶活性變化和丙二醛(MDA)含量變化，處理前后SOD、CAT、GSH-Px和AChE表達量變化； 并用松枝水培試驗測定3種提取物對松材線蟲病害的防控效果。結果表明，提取物處理后線蟲體內(nèi)總糖及蛋白含量顯著下降，線蟲體內(nèi)糖及蛋白質(zhì)的代謝受到干擾；線蟲體內(nèi)SOD、CAT、GSH-Px酶活性提高，POD活性顯著下降，MDA含量升高，表明線蟲體內(nèi)氧化與抗氧化作用失衡，細胞功能受到極大影響；AChE活性被抑制，表明線蟲的神經(jīng)系統(tǒng)受到破壞，SOD、CAT、GSH-Px和POD表達量與酶活性變化基本一致。松枝水培試驗表明中藥提取物能夠有效控制松材線蟲病害發(fā)生。綜上，3種提取物引起的松材線蟲體內(nèi)眾多生理指標的改變是造成線蟲死亡的主要原因。

中草藥提取物； 松材線蟲； 生理代謝

松材線蟲病是通過松墨天牛攜帶松材線蟲(Bursaphelenchusxylophilus，Steiner & Buhrer)在松樹間相互傳播而引起的一種特大毀滅性病害[1-2]。松材線蟲寄生在松樹體內(nèi)取食營養(yǎng)而導致樹木萎蔫并迅速枯死，因其蔓延迅速，防治難度極大，引起疫區(qū)的恐慌而被稱為“松樹癌癥”，“無煙的森林火災”[3-4]。此病自1905年被發(fā)現(xiàn)、1934年被報道以來，已廣泛分布于全世界多個國家[5]。目前對松材線蟲病的防治多采用化學防治、輪作及抗病品種的選育，但效果均不太理想，且存在眾多弊端[6]。目前使用的化學殺線蟲劑多為高毒性、高殘留，與環(huán)境相容性差，對土壤微生物、植物、水源和大氣層造成嚴重污染或破壞，而且在植物體內(nèi)殘留的藥物會直接危害人類健康[7-9]。因此，開發(fā)環(huán)境友好型、對人類和生態(tài)環(huán)境安全的殺松材線蟲劑成為重要研究課題[10]。目前對松材線蟲病防治的研究逐漸傾向于從天然植物中尋找更有效、更安全的殺線蟲活性物質(zhì)。植物源農(nóng)藥具有毒性較低、與環(huán)境相容性好、無殘留、害蟲不易產(chǎn)生抗性等特點，符合綠色環(huán)保的要求，因此越來越受到人們的重視[11]。國外在利用植物提取物防治植物寄生線蟲方面的研究較多，目前已發(fā)現(xiàn)多種植物來源的殺松材線蟲物質(zhì)[12-15]。近些年在我國，植物殺線蟲劑的研究也逐漸成為了熱點[16-17]。翁群芳、鐘國華等采用28種植物提取物進行殺線蟲試驗，發(fā)現(xiàn)多種具有殺線活性的物質(zhì)，并對其生理活性和生理效應進行了測定[18-19]。巨云為等利用萬壽菊、亞菊和銀杏的提取物進行殺線蟲試驗，獲得明顯效果，并且經(jīng)毒性測試發(fā)現(xiàn)從萬壽菊中提取出的135種餾分中24種對松材線蟲具有毒殺活性[20]。松材線蟲的防治從生態(tài)學和生產(chǎn)實踐出發(fā)也需要高效、安全、低毒的植物源殺線劑。目前研究主要集中在殺線蟲植物的調(diào)查以及殺線活性篩選等方面，但有關殺線蟲機理方面還不是很清楚，有待進一步研究[21-22]。作者在前期進行的具有殺松材線蟲活性中草藥的篩選與研究中發(fā)現(xiàn)，牡丹皮、黃連、大黃提取物對松材線蟲及其蟲卵具有良好的毒殺活性。本研究初步確定了3種中草藥對松材線蟲生理代謝的影響，為松材線蟲病的有效防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 植物材料與松材線蟲

供試中草藥：牡丹皮(Cortex Moutan Radicis)、黃連(Coptis Chinensis Franch)和大黃(Radix et Rhizoma Rhei)購買于河北省石家莊市錦繡大地藥業(yè)公司。

供試線蟲：松材線蟲(Bursaphelenchusxylophilus)，由河北師范大學動物學實驗室提供。松材線蟲用以PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)的多毛孢菌(Cordycepssinensis)飼養(yǎng)(26 ℃),至線蟲長滿平板，置于4 ℃保存。使用時先將含有線蟲的培養(yǎng)基挑出，放入貝氏漏斗中，無菌水沖洗，將流出液濃縮配制成50 條/μL的線蟲液。

1.2 中藥活性成分的分離與提取

乙醇粗提物的提取：分別稱取3種中草藥細粉末各200 g，加入95%乙醇室溫下進行浸泡處理，乙醇浸液2 d更換1次。將連續(xù)浸泡提取3次后的提取液先用400目網(wǎng)篩過濾1次，然后再對提取液進行抽濾以去除殘渣。70 ℃回流、提取24 h，使用旋轉蒸發(fā)儀對提取液進行減壓濃縮，得到黏稠狀提取物，放4 ℃冰箱中備用。

1.3 供試線蟲處理方法

采用浸漬處理法測定3種提取物對松材線蟲的毒力[23]。準確稱取3種中藥粗提物適量，統(tǒng)一配制成濃度為100 g/L的溶液。在1.5 mL 離心管中放入濃度為 10 g/L的3種提取物1 mL，以及100 μL 松材線蟲液(約5 000 條),同時以無菌水處理為對照，每處理重復4次, 置于26 ℃培養(yǎng)箱中處理24 h。

1.4 線蟲體內(nèi)總糖及蛋白含量測定

將浸漬處理后的線蟲于2 000 r/min離心5 min，去除浸漬液后，沉淀用無菌水反復沖洗、離心(3 500 r/min，4 min)3 次。用1.5 mL 低溫預冷的勻漿介質(zhì)對線蟲進行勻漿，低溫離心(5 000 r/min，15 min)取上清，得到10 %的組織勻漿液。總糖含量測定采用蒽酮法；蛋白質(zhì)含量測定采用Bradford法進行測定，利用紫外分光光度計在波長為595 nm處測量吸光值(A595)。

1.5 線蟲體內(nèi)保護性酶酶活性測定

本研究采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的超氧化物歧化酶(SOD)測試盒、過氧化物酶(POD)測試盒、過氧化氫酶(CAT)測試盒和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)測試盒，按照說明書要求進行測定。

1.6 乙酰膽堿酯酶(AChE) 活性測定

采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的測試盒，參照說明書要求進行測定。

1.7 丙二醛(MDA)含量測定

采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的丙二醛(MDA)測定試劑盒，采用硫代巴比妥反應(TBA)染色法進行。

1.8 松材線蟲體內(nèi)相關酶的Western blot檢測

SOD、CAT、GSH-Px和AChE的4種兔抗人多克隆抗體與辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG均購自Proteintech Group。首先按照1.4所述方法得到經(jīng)過3種提取物處理的松材線蟲蟲體蛋白，將蛋白樣品進行SDS-PAGE后，電轉印至PVDF膜上，加入4種一抗和標記二抗，以四甲基聯(lián)苯胺(TMB)為生色底物顯色，進行蛋白印記分析。

1.9 松枝水培試驗

采集1～2 年生，胸徑約30 cm 健康馬尾松(PinusmassonianaLamb.)松枝，參照文獻[24]方法進行松枝水培試驗。

用清水分別將制備所得3 種中藥提取物配制成250 μg/mL溶液，準確取250 mL 藥液裝入500 mL三角瓶中，將大小基本一致的供試健康松枝插入藥液中。瓶口用保鮮膜密封。采用截枝套管法接種線蟲：選取離體松枝側枝，在離主枝約5 cm 處削去枝梢，使截面朝上，在截面基部纏繞少許脫脂棉，套上長度約8 cm 的乳膠管，用細繩扎緊乳膠管基部，從管口注入線蟲懸浮液，接種量1 000 條/枝。然后用濕潤的脫脂棉塞住管口，以維持乳膠管內(nèi)濕度，便于線蟲侵入。分別設“提取物水培枝+線蟲”、“水培枝+線蟲”和“水培枝”對照試驗3組。每處理重復3次。

接入松材線蟲后每10 d 觀察松枝外部癥狀，松枝病情分級標準如下：0 級，松枝正常，針葉綠色；1 級，1/4 以下針葉發(fā)黃；2 級，1/4～3/4 針葉發(fā)黃；3 級，3/4 以上針葉發(fā)黃，1/2 以下針葉枯萎；4 級，1/2 以上針葉枯萎，松枝瀕死或死亡。按下式計算病情指數(shù)，比較各處理病害嚴重程度。其中Xi為各病級的松枝數(shù)，ai為各病級，amax為最高病級4[19]。

病情指數(shù)=Σ(Xi×ai) / Σ(Xi×amax)×100。

1.10 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

采用SPSS 16.0 for Windows 和 Excel 軟件進行統(tǒng)計，所得數(shù)據(jù)均用平均數(shù)±標準誤差表示，用Duncan新復極差法比較差異顯著性(P<0.05)；比值計算為處理值/對照值。

2 結果與分析

2.1 對松材線蟲體內(nèi)總糖及總蛋白含量的影響

3種提取物對松材線蟲體內(nèi)總糖及總蛋白含量影響的測定結果見表1。經(jīng)處理后，松材線蟲體內(nèi)總糖含量相比對照明顯降低，大黃處理組甚至降低了50 %左右；總蛋白含量相比對照水平降低更加明顯，黃連處理組甚至降低了80 %。這表明3種提取物嚴重干擾了線蟲體內(nèi)的糖代謝和蛋白代謝，造成線蟲體內(nèi)總糖及總蛋白含量的顯著降低，這可能是造成線蟲死亡的重要原因。

表1 3種提取物對松材線蟲體內(nèi)總糖及總蛋白含量的影響Table 1 Effects of the extracts of three TCM herbs on the contents of total sugar and protein in B.xylophilus

2.2 提取物對松材線蟲體內(nèi)保護性酶活性的影響

線蟲體內(nèi)的超氧化物歧化酶(SOD)，過氧化物酶(POD)和過氧化氫酶(CAT)能夠清除自由氧自由基，從而保持體內(nèi)的活性氧濃度平衡。因此檢測線蟲體內(nèi)3種酶的活性可以間接反映體內(nèi)氧自由基水平。

3種提取物對松材線蟲體內(nèi)保護性酶活性影響的測定結果見表2。經(jīng)提取物處理后，線蟲體內(nèi)保護性酶活性均有明顯變化，與對照水平相比：SOD與CAT酶活性提高，黃連提取物處理后的效果最為明顯。這表明3種提取物處理能夠明顯影響線蟲體內(nèi)氧自由基代謝，提高氧自由基含量，從而造成線蟲體內(nèi)保護性酶活性提高。而POD酶活力則明顯降低，牡丹皮處理組甚至降低了90%左右。POD酶活力的降低使得線蟲體內(nèi)保護系統(tǒng)失去作用，從而使得活性氧濃度失衡，造成蟲體損傷。

表2 3種提取物對松材線蟲體內(nèi)保護性酶活性的影響Table 2 Effects of the extracts of three TCM herbs on the activity of protective enzymes in B.xylophilus

2.3 對線蟲體內(nèi)神經(jīng)靶標酶及GSH-Px活性的影響

乙酰膽堿酯酶(AChE)是神經(jīng)傳導中的一種關鍵酶，在神經(jīng)傳導中起關鍵作用。谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)是機體內(nèi)廣泛存在的一種重要的分解過氧化物的酶，它特異地催化還原型谷胱甘肽(GSH)對過氧化物的還原反應。經(jīng)中藥提取物處理后，GSH-Px酶活顯著升高，為對照的2倍左右，表明提取物使線蟲體內(nèi)產(chǎn)生大量有毒的過氧化物代謝物，對線蟲細胞造成損傷，結果見表3。

表3 3種提取物對乙酰膽堿酯酶與谷胱甘肽過氧化物酶活性的影響Table 3 Effects of the extracts of three TCM herbson the activity of AChE and GSH-Px in B.xylophilus

2.4 對松材線蟲體內(nèi)相關酶表達量的影響

3種提取物對松材線蟲體內(nèi)酶表達量的影響測定結果見圖1。共檢測了4種酶的蛋白表達情況。經(jīng)Western-blot檢測得到圖譜，線蟲體內(nèi)3種保護性酶， GSH-Px、CAT和SOD的表達量均明顯提高，AchE表達量明顯降低，結果與酶活測定結果基本保持一致。

2.5 對松材線蟲體內(nèi)丙二醛含量的影響

丙二醛(MDA)是氧自由基引起的脂質(zhì)過氧化物的降解終產(chǎn)物，具有強烈的氧化作用，能引起細胞的損傷、老化和死亡。因此檢測MDA含量可間接反映線蟲體內(nèi)氧自由基的水平。3種提取物對線蟲體內(nèi)MDA含量影響的測定結果見表4。經(jīng)提取物處理后，線蟲體內(nèi)MDA含量明顯升高，黃連組甚至提高至對照水平的5倍。這表明提取物能夠影響線蟲體內(nèi)氧自由基代謝，MDA的含量顯著提高，引起線蟲細胞的損傷。

圖1 中藥提取物對松材線蟲體內(nèi)多種酶基因表達量的影響Fig.1 Effects of the extracts of three TCM herbs on gene expression of the enzymes in B.xylophilus

表4 3種提取物對線蟲體內(nèi)丙二醛含量的影響Table 4 Effects of the extracts of three TCMherbs on the concentration of MDA in B.xylophilus

2.6 松枝水培試驗結果

松枝水培試驗結果表明，3種中藥提取物250 μg/mL(無菌水配制)處理后40 d 內(nèi)松枝均不發(fā)病,病情指數(shù)為0，與水培枝(CK)的病情指數(shù)相同?！八嘀?線蟲”處理組 10 d 后開始出現(xiàn)針葉失水病情，處理13～15 d后，松枝尖端迅速變紅，萎蔫，15 d時病情指數(shù)達到70，30 d后松枝全部變成紅褐色，萎蔫壞死，病情指數(shù)為100，與翁群芳等[18-19]報道的現(xiàn)象相似。結果表明 3 種中藥提取物能夠明顯阻止及延緩松材線蟲引起的松樹萎蔫病的發(fā)生與發(fā)展。結果見表 5 所示。

表5 3種提取物松枝水培試驗處理對松材線蟲的控制作用Table 5 Effects of the extracts of three TCM herbsagainst B.xylophilus in water-potted pine branches

3 討論

目前國內(nèi)外對于黃連、牡丹皮、大黃等中草藥的研究主要集中于醫(yī)藥領域，而對其在農(nóng)林業(yè)害蟲防治方面的研究鮮見報道。在前期研究中，作者對36種中草藥殺線蟲活性進行篩選，確定了3種中藥乙醇提取物對松材線蟲及蟲卵的毒殺活性[25]。為了進一步揭示中藥提取物對松材線蟲的生理活性和作用機制，我們進行了深入研究。

松材線蟲常以灰霉菌(Botrytiscinerea)、小長喙霉(Ophiostomaminus)和長喙殼菌(Ceratocystisspp.)等真菌的菌絲為食[26]，這就表明一種理想的殺松材線蟲藥物應當具備抑真菌和殺線蟲雙重活性。但目前為止還沒有一種此類雙功能殺線蟲劑投入使用。雖然一些化合物如酒石酸莫侖太爾(morantel tartrate)、阿維菌素(abamectin)和甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽(emamectin benzoate)已被用于防治松材線蟲病[27-29]，但是由于它們水溶性差、防治效果不理想以及成本過高等問題，使用并不廣泛。因此一種理想的松材線蟲病防治藥物應當易溶于水、具備抑真菌與殺線蟲雙重活性，這樣不僅對線蟲有毒殺作用并且能夠殺滅線蟲的食物來源真菌[30]。根據(jù)這一研究思路，Oh等建立了一種高通量篩選方法，篩選到具有殺線活性的206種活性化合物，其中一種編號HWY-4213，化學名為“1-n-undecyl-2-[2-fluorphenyl]methyl-3,4-dihydro-6,7-dimethoxy-isoquinolinium chloride”的小檗堿衍生物具有良好的毒殺松材線蟲和抑真菌活性[31]。黃連中的小檗堿是黃連的主要活性物質(zhì)，含量高達5.20%～7.69%，因此我們確認黃連中的小檗堿是黃連的主要殺線活性物質(zhì)。

糖類的重要作用是為生物體提供生命活動所需要的能量，目前早已證明線蟲體內(nèi)含有多種糖類物質(zhì)[32]，總糖含量的降低表明線蟲的營養(yǎng)情況正在逐步惡化。有文章報道選取牛心樸子中活性物質(zhì)處理線蟲后，造成線蟲總糖含量的下降，影響了線蟲的新陳代謝[33]。

松材線蟲體表有一層由脂質(zhì)蛋白組成的角質(zhì)層，可起到防御細菌或有害物質(zhì)入侵、阻止水分蒸發(fā)等作用從而保護線蟲[32]。經(jīng)中藥提取物處理后的死亡線蟲體表出現(xiàn)囊泡狀結構(如圖2a所示)、內(nèi)部組織收縮、體壁分離等癥狀(如圖2b所示)，這很可能是由于中藥提取物抑制線蟲體內(nèi)蛋白質(zhì)的產(chǎn)生或者破壞蛋白特定結構，進而影響線蟲體內(nèi)脂質(zhì)蛋白角質(zhì)層的正常功能，使內(nèi)含物外泄，最終導致線蟲死亡。

圖2 松材線蟲組織結構形態(tài)改變示意圖Fig.2 Morphological changes of B.xylophilus

自由基具有很強的生物活性，很容易與生物大分子反應，直接損害或者通過一系列氧化鏈式反應引起廣泛的生物結構破壞，導致細胞凋亡[34]。本研究發(fā)現(xiàn)，SOD、POD、CAT的活性以及MDA的含量可間接反映松材線蟲體內(nèi)氧自由基水平。經(jīng)3種提取物處理后，線蟲體內(nèi)SOD和CAT活性與表達量及MDA含量均明顯提高，這表明線蟲體內(nèi)存在著大量的氧自由基，而POD的活性卻被抑制，這可能會使線蟲體內(nèi)氧化與抗氧化作用失衡，細胞的功能受到極大影響，最終導致線蟲死亡。

研究表明，線蟲能夠產(chǎn)生2種谷胱甘肽過氧化物酶GSH-Px，一種分泌到線蟲體表，能夠清除體表有害的大分子過氧化物和脂肪酸過氧化物，保護線蟲；另一種在細胞內(nèi)，能夠清除代謝產(chǎn)生的過氧化物代謝產(chǎn)物，阻斷脂質(zhì)過氧化連鎖反應，從而起到保護細胞膜結構和功能完整的作用[35]。經(jīng)3種提取物處理后，線蟲GSH-Px活性顯著提高，表明線蟲受到了大量過氧化物及代謝產(chǎn)物的損傷。

AChE在神經(jīng)傳導中執(zhí)行著重要的功能，該酶能夠降解乙酰膽堿，終止神經(jīng)遞質(zhì)對于突觸后膜興奮刺激作用，保證神經(jīng)信號分子在生物體內(nèi)正常的傳導，是有機磷和氨基甲酸酯類殺蟲劑的作用靶標[36]，而且還是細胞凋亡的潛在標記和調(diào)節(jié)因子之一[37]。經(jīng)3種提取物處理后，松材線蟲體內(nèi)的AChE活性及表達量明顯降低，導致神經(jīng)遞質(zhì)無法正常降解，造成突觸后膜的持續(xù)興奮，最終導致線蟲死亡。這可能是中藥毒殺松材線蟲的另一重要原因。

經(jīng)3種提取物處理后，松材線蟲體內(nèi)AChE、GSH-Px、CAT和SOD的活性與其表達量呈現(xiàn)正相關性，因此我們初步推測中藥提取物作用于線蟲，使其體內(nèi)產(chǎn)生了大量的氧自由基，從而誘發(fā)線蟲體內(nèi)各種保護性酶的表達發(fā)生變化并改變其活性，最終導致線蟲死亡。在今后的研究中我們將從分子角度探究各種酶表達量變化的原因與機制,對此觀點加以驗證。

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EffectsoftheextractsofCortexMoutanRadicis,CoptisChinensisFranchandRadixetRhizomaRheionphysiologicalmetabolismofBursaphelenchusxylophilus

Jiao Hongwei, Zhang Lu, Liu Dong, Zhao Baohua

(CollegeofLifeSciences,HebeiNormalUniversity,Shijiazhuang050024,China)

The objective of this study is to identify the poisoning mechanism of the ethanol extracts of three traditional Chinese medicinal herbs, Cortex Moutan Radicis, Coptis Chinensis Franch and Radix et Rhizoma Rhei, againstBursaphelenchusxylophilus. The effects of these extracts were evaluated on the metabolism of total sugar and protein and activities of protective enzymes, superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), peroxidase (POD), glutathione peroxidase (GSH-Px), acetylcholinesterase (AChE), and the content of malondialdehyde (MDA) fromB.xylophilus. The gene expression of SOD, CAT, GSH-Px and AChE was also analyzed. The control effects of the extracts onB.xylophiluswere measured in water-potted plants. The extracts of three TCM herbs interfered with the metabolism of total sugar and protein ofB.xylophilus. The activities of SOD, CAT, and GSH-Px were improved; the activity of POD was inhibited; MDA content was increased. Oxidation and antioxidation were imbalance, which greatly affected cell functions. The activity of AChE was inhibited, and the nervous system was damaged. The level of SOD, CAT, GSH-Px and AChE was consistent with enzyme activity. The results revealed that the extracts can effectively control the pine wood nematode disease. It is concluded that the changes of some physio-biochemical indexes ofB.xylophilusinvivocaused by the extracts of three TCM herbs were the main causes of its death.

Chinese herb extract;Bursaphelenchusxylophilus; physiological metabolism

2014-01-03

：2014-05-12

河北省自然科學基金項目(C2013205103)，河北師范大學博士基金項目(L2010B10)

S 476

：ADOI：10.3969/j.issn.0529-1542.2014.06.004

* 通信作者 E-mail:劉東 liudong410@163.com；趙寶華 zhaobaohua86178@sohu.com