韓 劍, 羅 明*, 徐金虹, 王同仁, 張祥林

(1. 新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院, 烏魯木齊 830052； 2. 新疆阿瓦提縣農(nóng)技推廣中心,阿瓦提 843200；3. 新疆出入境檢驗(yàn)檢疫局,烏魯木齊 830063)

棗瘋病植原體TaqMan探針實(shí)時熒光定量PCR檢測方法的建立

韓 劍1, 羅 明1*, 徐金虹2, 王同仁2, 張祥林3

(1. 新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院, 烏魯木齊 830052； 2. 新疆阿瓦提縣農(nóng)技推廣中心,阿瓦提 843200；3. 新疆出入境檢驗(yàn)檢疫局,烏魯木齊 830063)

根據(jù)棗瘋病植原體16S rDNA基因保守區(qū)域設(shè)計(jì)、合成特異性引物和TaqMan探針,以構(gòu)建的重組質(zhì)粒作為陽性標(biāo)準(zhǔn)品,建立并優(yōu)化了對棗瘋病植原體的TaqMan實(shí)時熒光定量PCR檢測方法。對優(yōu)化后的方法進(jìn)行靈敏度、特異性及穩(wěn)定性評價,制作了標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果顯示,制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線有極好的線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)(r2)達(dá)到0.998,建立的實(shí)時熒光定量PCR檢測方法能夠特異性地檢測棗瘋病植原體,能檢測到60拷貝的質(zhì)粒DNA。本研究建立的實(shí)時熒光定量PCR檢測方法靈敏度、特異性、重復(fù)性好,不僅能夠?qū)崿F(xiàn)對棗瘋病植原體的快速檢測,而且為實(shí)現(xiàn)從病原定量水平上對棗瘋病病情分級奠定了基礎(chǔ)。

棗瘋病植原體； TaqMan探針； 實(shí)時熒光定量PCR； 檢測

棗瘋病(jujube witches’ broom, JWB)是由植原體引起的、在棗樹生產(chǎn)中具毀滅性危害的病害[1]。棗瘋病植原體主要通過人工嫁接、根蘗和葉蟬類昆蟲介體等方式傳播,病原寄生于植株維管束韌皮部內(nèi),樹體一旦感病,終身帶菌并隨著苗木擴(kuò)散和遠(yuǎn)距離傳播,具有分布廣、傳播速度快、致死率高等特點(diǎn)。棗瘋病在國內(nèi)幾乎遍布于各大棗樹栽培區(qū),局部地區(qū)暴發(fā)成災(zāi),棗園瀕臨毀滅。每年因棗瘋病而死的樹高達(dá)千萬株,直接經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)數(shù)億元,嚴(yán)重阻礙了紅棗產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[2-3]。棗瘋病防治是世界性的難題,多數(shù)棗樹品種對其敏感。盡管藥劑處理、控制傳病介體等方法具有一定減輕和延緩發(fā)病的作用,但無法根除[4]。要從根本上解決棗瘋病的防治問題必須采取有效的預(yù)防措施,嚴(yán)格對苗木進(jìn)行檢疫檢驗(yàn)和脫毒處理,采用健康苗木和接穗建立無病苗木繁育體系,從源頭上杜絕病原,而建立和應(yīng)用先進(jìn)的病原檢測技術(shù)是棗樹無病苗木生產(chǎn)的核心所在。

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展,PCR技術(shù)已廣泛應(yīng)用于植原體的檢測鑒定[5-7]。目前,根據(jù)植原體16S rDNA、核糖體蛋白質(zhì)(rp)、延伸因子(tuf)等基因序列設(shè)計(jì)引物,通過常規(guī)PCR或巢式PCR擴(kuò)增是檢測植原體較常用的手段。但在實(shí)際應(yīng)用過程中,PCR產(chǎn)物需經(jīng)電泳、染色劑溴化乙錠染色后才能判斷擴(kuò)增結(jié)果,存在著操作步驟繁瑣,易于造成交叉污染,降低檢測靈敏度的問題。近年發(fā)展起來的TaqMan探針實(shí)時熒光PCR技術(shù)是在常規(guī)PCR反應(yīng)體系中添加了一條標(biāo)記了2個熒光基團(tuán)的探針,即TaqMan探針。與常規(guī)PCR定性檢測相比,該法具有更加靈敏、簡便、高效、穩(wěn)定和定量化等優(yōu)點(diǎn)[8]。本研究應(yīng)用TaqMan探針實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)建立了針對棗瘋病植原體高特異性檢測方法,并應(yīng)用于田間檢測,驗(yàn)證了該方法的靈敏度及特異性,實(shí)現(xiàn)了從病原定量水平上對棗瘋病病情的分級。

1 材料與方法

1.1 供試材料

2009年8月至2012年7月在新疆阿克蘇、喀什等地區(qū)棗樹栽培區(qū)調(diào)查,采集到表現(xiàn)為叢枝、小葉、黃化等癥狀的棗瘋病疑似植株,樣品保存于4 ℃冰箱和液氮中。同時采集健康植株枝葉作為對照。泡桐叢枝病植原體、葡萄金黃化植原體及翠菊黃化植原體由新疆出入境檢驗(yàn)檢疫局提供。

1.2 試劑及儀器

PGM-T載體、質(zhì)粒小提試劑盒及RealMasterMix(Probe)購自天根生化科技有限公司。主要儀器：實(shí)時熒光PCR儀(Roche Lightcycle 2.0),ND-1 000核酸/蛋白檢測儀(Nano Drop公司)。

1.3 棗樹葉片總DNA提取

采用植物基因組提取試劑盒(Plant Genomic DNA Kit,TIANGEN)提取棗樹葉片總DNA。

1.4 重組質(zhì)粒的構(gòu)建和定量

以提取的總DNA為模板,利用引物[9]R16mF2: 5′-CATGCAAGTCGAACGGA-3′,和R16mR1: 5′-CTTAACCCCAATCATCGA-3′擴(kuò)增棗瘋病植原體16S rDNA基因片段,擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)回收、純化,克隆于PGM-T載體上,提純含棗瘋病植原體16S rDNA的質(zhì)粒作為質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品,用核酸蛋白紫外分析儀測定A260,計(jì)算其質(zhì)量濃度和拷貝數(shù),-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 實(shí)時熒光定量PCR檢測方法的建立及優(yōu)化

1.5.1 引物及探針設(shè)計(jì)

在GenBank中搜集已公布的植原體及有代表性細(xì)菌的16S rDNA核酸序列,利用Omiga軟件對上述序列進(jìn)行比較及一致性分析,找出棗瘋病植原體與其他植原體的基因差異位點(diǎn)。用軟件Beacon Designer 7.0篩選出一對引物JWB primer-F/JWB primer-R,引物對經(jīng)在線序列同源性分析,確定為棗瘋病植原體的特異性引物對,并在該引物對的擴(kuò)增區(qū)域設(shè)定一條熒光TaqMan探針JWB-probe(表1)。引物和探針由北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成,探針5′端標(biāo)記報(bào)告熒光染料為6-carboxyfluorescein(FAM),3′端標(biāo)記淬滅熒光染料為tetramethycarboxyrhodamine (TAMRA)。

表1實(shí)時熒光定量PCR的引物及探針序列

Table1SequenceofprimersandTaqManprobeforreal-timefluorescentquantitativePCR

名稱Name序列(5′?3′)Sequences擴(kuò)增目的片段長度/bpAmplifiedfragmentlengthJWBprimer?FTGGTGAGGTAAAGGCTTAJWBprimer?RCTCCCGTAGGAGTTTGG98JWB?probeFAM?TGGTGAGGT?AAAGGCTTA?TAMRA

1.5.2 實(shí)時熒光定量PCR反應(yīng)條件

反應(yīng)體系(20 μL)：2.5×realMasterMix 8.0 μL,上游引物JWB primer-F (10 μmol/L) 0.5 μL,下游引物JWB primer-R (10 μmol/L) 0.5 μL,探針JWB-probe(10 μmol/L) 0.5 μL,20×probe enhancer solution 1.0 μL,模板1.0 μL,ddH2O 8.5 μL。反應(yīng)程序：95 ℃ 2 min；95 ℃ 15 s,60 ℃ 30 s,68 ℃ 1 min,40個循環(huán);68 ℃收集熒光信號。

1.5.3 實(shí)時熒光定量PCR反應(yīng)體系引物對及探針濃度的優(yōu)化

對反應(yīng)體系中的引物、探針濃度分別進(jìn)行優(yōu)化。將引物對濃度從0.1～1.0 μmol/L以0.1 μmol/L依次遞增,探針濃度從0.05～0.5 μmol/L以0.05 μmol/L依次遞增,其他條件均不變,通過ΔRn與循環(huán)數(shù)關(guān)系的曲線圖確定ΔRn值最大且Ct值最小的最佳引物濃度和探針濃度。

1.6 實(shí)時熒光定量PCR的靈敏度試驗(yàn)及標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

將構(gòu)建的棗瘋病植原體質(zhì)粒進(jìn)行10倍系列稀釋,并以此作為標(biāo)準(zhǔn)陽性模板,利用優(yōu)化得到的最佳反應(yīng)體系進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR檢測。檢測結(jié)束后通過ΔRn與循環(huán)數(shù)關(guān)系的曲線圖確定TaqMan探針的檢測靈敏度,并根據(jù)得到的動力學(xué)曲線,得出相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。

1.7 實(shí)時熒光定量PCR的特異性驗(yàn)證

分別提取棗瘋病植原體(16SrⅤ組),葡萄金黃化植原體(16SrⅤ組),泡桐叢枝植原體(16SrⅠ組),翠菊黃化植原體(16SrⅠ組)以及田間采集及實(shí)驗(yàn)室保存的健康棗樹基因組DNA作為模板,進(jìn)行棗瘋病植原體實(shí)時熒光定量PCR檢測的特異性試驗(yàn)。

1.8 實(shí)時熒光定量PCR重復(fù)性試驗(yàn)

對3種不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒(反應(yīng)初始體系中含6.09×104、6.09×105和6.09×106拷貝/μL)利用得到的優(yōu)化反應(yīng)體系重復(fù)檢測3次。計(jì)算循環(huán)閾值(Ct)的平均值、標(biāo)準(zhǔn)差(SD)和變異系數(shù)(CV)來評價該方法的穩(wěn)定性。變異系數(shù)(CV)=測定結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)差與其平均值的百分比。

1.9 田間樣品的適用性檢測

從新疆紅棗產(chǎn)區(qū)采集不同表觀癥狀、不同病級的枝條樣品,采用本研究建立的實(shí)時熒光定量PCR體系進(jìn)行檢測,并利用建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線對樣品中的植原體含量定量分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 實(shí)時熒光PCR體系優(yōu)化

對反應(yīng)體系中的引物、探針濃度進(jìn)行篩選優(yōu)化,以獲得ΔRn值最大,Ct值最小的最佳擴(kuò)增反應(yīng)體系。

如圖1所示,引物對濃度配比在0.1～1.0 μmol/L范圍內(nèi),擴(kuò)增曲線的ΔRn值先隨引物濃度的升高而升高,當(dāng)濃度為0.5 μmol/L時,可獲得最大ΔRn值和較小的Ct值,之后ΔRn值隨引物濃度升高而降低。最終確定最佳引物對濃度為0.5 μmol/L。

探針濃度試驗(yàn)結(jié)果表明(圖2),隨著探針濃度遞增,ΔRn依次增加,在0.4 μmol/L時,ΔRn值達(dá)到最大,但是相對應(yīng)的曲線不平滑。之后ΔRn值隨著探針濃度的遞增而降低,說明探針過量,無足夠的PCR產(chǎn)物與探針結(jié)合。經(jīng)過多次重復(fù)試驗(yàn),并從經(jīng)濟(jì)節(jié)約的角度考慮,選擇0.25 μmol/L為最佳反應(yīng)用量。

圖1 引物對濃度優(yōu)化

圖2 探針濃度優(yōu)化

2.2 靈敏度試驗(yàn)

以所構(gòu)建的棗瘋病植原體質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品(濃度測定為280 ng/μL,對應(yīng)為6.09×1010拷貝/μL)的10倍系列稀釋液作為標(biāo)準(zhǔn)陽性模板進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR和常規(guī)PCR檢測。結(jié)果顯示(圖3)：實(shí)時熒光PCR反應(yīng)可檢測模板濃度的下限為6.09×10 拷貝/μL(2.8 fg/μL)。

以標(biāo)準(zhǔn)陽性模板不同濃度的對數(shù)值為橫坐標(biāo),循環(huán)數(shù)為縱坐標(biāo)作圖,得到標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖3)。結(jié)果顯示,標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率為-3.354,擴(kuò)增效率>90%,Ct值和質(zhì)?？截悢?shù)的對數(shù)值之間具有良好的相關(guān)性(r2=0.998)。因此根據(jù)未知樣品的Ct值和回歸方程,即可對起始模板的拷貝數(shù)精確定量。

圖3 實(shí)時熒光PCR靈敏度

2.3 特異性驗(yàn)證

以提取的相同濃度的棗瘋病植原體、葡萄金黃化植原體、泡桐叢枝植原體,翠菊黃化植原體總DNA為模板,用本研究設(shè)計(jì)合成的引物(JWB primer-F/JWB primer-R)和探針(JWB-probe)進(jìn)行實(shí)時熒光PCR檢測驗(yàn)證其特異性。結(jié)果顯示(圖4),除棗瘋病植原體DNA有熒光信號產(chǎn)生外,其余植原體均未收集到熒光信號。說明本檢測體系所用的引物及探針直接針對棗瘋病植原體檢測,而與棗瘋病植原體同屬榆樹黃化組(16SrⅤ組)的葡萄金黃化植原體,屬于植原體翠菊黃化組(16SrⅠ組)的泡桐叢枝植原體、翠菊黃化植原體以及健康棗樹均未檢測到熒光信號增加,可見引物及探針具有很強(qiáng)的特異性。

圖4 實(shí)時熒光PCR特異性

2.4 實(shí)時熒光PCR的重復(fù)性

重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果顯示(表2),各重復(fù)試驗(yàn)的Ct值誤差均不到1個循環(huán),且Ct值變異系數(shù)均小于5%。證明本研究建立的實(shí)時熒光PCR體系重復(fù)性好,從而保證了不同樣品間檢測結(jié)果的可靠性和穩(wěn)定性。

表2實(shí)時熒光PCR的重復(fù)性檢測

Table2Repetitiondetectionbythereal-timePCR

質(zhì)粒/拷貝·μL-1Plasmid樣品Ct值TheCtvaluesofthesamplesCt1Ct2Ct3Ct平均值TheaveragevalueofCtSDCV/%6．09×10615．2315．2515．9315．470．402．56．09×10518．6719．0518．7218．810．211．16．09×10422．0422．5322．1222．230．261．2

2.5 田間樣品的適用性檢測

對田間采集病株樣品分別采用常規(guī)PCR和實(shí)時熒光定量PCR檢測。常規(guī)PCR對發(fā)病癥狀為2級、3級病株的檢測結(jié)果為陽性反應(yīng),無癥狀(0級)病株檢測結(jié)果為陰性。而實(shí)時熒光定量PCR檢測,病情為2級、3級以及無癥狀(0級)病株檢測結(jié)果均為陽性反應(yīng),其Ct值依次為20.77、14.39、24.56。通過建立的棗瘋病植原體熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算出病情級別為2級、3級的棗樹枝葉中植原體16S rDNA片段拷貝數(shù)分別為1.66×105個/g 鮮重和 1.32×107個/g 鮮重,而無明顯癥狀(0級)的枝葉中植原體16S rDNA片段拷貝數(shù)達(dá)到1.23×104個/g 鮮重。結(jié)果證明,實(shí)時熒光定量PCR檢測提高了檢測靈敏度,能檢測出侵染初期處于隱癥狀態(tài)的樣品中棗瘋病植原體的存在。

3 討論

植原體的分離培養(yǎng)至今尚未獲得成功。由于植原體在植株體內(nèi)含量低,又不像病毒易于提純,檢測難度大。長期以來,植原體的檢測主要依靠生物學(xué)測定(表觀癥狀、嫁接傳病)、電鏡觀察、組織化學(xué)、血清學(xué)等方法[10-12],存在靈敏度低、特異性差、周期長和操作繁瑣等不足,已不能滿足現(xiàn)代生產(chǎn)的需要。最近十幾年,隨著分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展,植原體檢測技術(shù)才得到了重大突破。普通PCR、巢氏PCR和免疫捕獲PCR等技術(shù)應(yīng)用使植原體檢測靈敏度有了顯著提高。但這些方法過程繁雜,操作步驟多,效率低,而且需要PCR后處理,如瓊脂糖凝膠電泳和溴化乙錠染色,不僅費(fèi)時費(fèi)力又易造成污染和假陽性,影響對結(jié)果的正確判斷,降低了檢測的靈敏度。本研究建立的棗瘋病植原體TaqMan探針實(shí)時熒光PCR檢測靈敏度達(dá)到60 拷貝/μL。整個過程采用完全閉管檢測,根據(jù)擴(kuò)增曲線直接判斷結(jié)果,省去了對PCR產(chǎn)物電泳、染色等繁瑣的步驟,避免了可能造成的PCR產(chǎn)物交叉污染。且能在1 h內(nèi)完成過程,大大提高了檢測效率。

廖曉蘭等[13]首次將實(shí)時熒光PCR技術(shù)用于植原體的檢測,設(shè)計(jì)并合成了植原體廣譜熒光探針和針對椰子致死黃化組(16SrⅣ組)、蘋果叢生組(16SrⅩ 組)和榆樹黃化組(16SrⅤ組)植原體的組特異性熒光探針,成功地檢測了9種植原體。侯立華等[14]設(shè)計(jì)合成了榆樹黃化組(16SrⅤ組)探針對棗瘋病植原體拷貝數(shù)進(jìn)行了定量檢測,靈敏度達(dá)到了85 拷貝/μL。已報(bào)道這些方法是針對植原體16SrⅤ組設(shè)計(jì)的引物和探針,用于檢測植原體16SrⅤ組的成員,實(shí)現(xiàn)植原體組間的特異性檢測。16SrⅤ組劃分為3個亞組[15],包括榆樹黃化(16SrⅤ-A)棗瘋病(16SrⅤ-B)、葡萄金黃化(16SrⅤ-C)等多種重要的植原體。研究發(fā)現(xiàn),16SrⅤ組內(nèi)的植原體菌株間序列差異很小(<1.2%),要對不同亞組植原體進(jìn)行區(qū)分和鑒定較為困難[16]。本研究在對植原體大量基因信息進(jìn)行分析比較的基礎(chǔ)上,設(shè)計(jì)了針對棗瘋病植原體特異性的探針及引物。特異性檢測結(jié)果表明,對本研究中從新疆獲得的多個棗瘋病菌株均可產(chǎn)生明顯的增強(qiáng)熒光信號,而隸屬于同組但不同亞組的葡萄金黃化植原體和不同組(16SrⅠ組)的泡桐叢枝植原體、翠菊黃化植原體均未檢測到熒光信號增加,可見設(shè)計(jì)的探針及引物具有較好的特異性,提高了棗瘋病植原體檢測的針對性和檢測效率。但由于植原體標(biāo)樣來源的限制,特異性檢測供試的植原體種類較少,且只涉及植原體的2個組。因此,需進(jìn)一步廣泛收集菌株,擴(kuò)大檢測范圍以進(jìn)一步驗(yàn)證其特異性。

棗瘋病為維管束傳導(dǎo)的系統(tǒng)感染性病害。棗樹感染植原體后,會引起樹體一系列的生理代謝紊亂,病情由輕到重演變,其可控程度也由易到難[17-18]。因此,掌握棗瘋病病情的發(fā)生、發(fā)展規(guī)律,根據(jù)病級,因樹、因園、因地制宜采取分類治理措施,對于病害的綜合防治具有重要意義。劉孟軍等[19]依據(jù)癥狀特點(diǎn),建立了從組織、病枝、病株、病園和病區(qū)等5個水平對棗瘋病病情分級的標(biāo)準(zhǔn)。但其病情分級未反映不同病級植株體內(nèi)病原累積狀況。本研究應(yīng)用建立的TaqMan探針實(shí)時熒光PCR方法,對不同癥狀病級的病樣中植原體進(jìn)行了精確定量,證明了該檢測方法可從微觀水平反映病原從初侵染到逐步積累,是對依據(jù)癥狀劃分病級的補(bǔ)充,能更加客觀、科學(xué)地反映病害發(fā)展進(jìn)程。同時,通過檢測發(fā)現(xiàn)棗園中無癥帶菌處于隱癥狀態(tài)病株普遍存在,經(jīng)過1～2年期的潛伏逐漸表現(xiàn)癥狀。

近幾年來,新疆紅棗生產(chǎn)規(guī)?？焖贁U(kuò)張和迅猛發(fā)展,僅南疆地區(qū)的棗樹栽培面積就已近30萬 hm2,成為我國最大的紅棗生產(chǎn)基地。南疆地區(qū)絕大多數(shù)為新建棗園,通過直接調(diào)入苗木和以酸棗作砧木,引入接穗進(jìn)行嫁接,并結(jié)合扦插、分株等無性繁殖方式解決苗木的供應(yīng)問題,極易引起棗瘋病的感染及傳播。2009年,筆者首次發(fā)現(xiàn)并報(bào)道了棗瘋病已在新疆南疆部分地區(qū)發(fā)生[20-21],目前尚屬個別、零星、團(tuán)簇狀分布,但個別棗園局部發(fā)生嚴(yán)重,對蓬勃發(fā)展的紅棗產(chǎn)業(yè)帶來嚴(yán)重的隱患。因此,建立快速、準(zhǔn)確的棗瘋病植原體檢測方法對于病害的早期診斷、口岸檢疫、田間流行監(jiān)測預(yù)報(bào)和指導(dǎo)病害的綜合防治提供了良好的技術(shù)支撐。

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Establishmentofreal-timefluorescentquantitativePCRmethodwithTaqManprobefordetectionofjujubewitches’broomphytoplasma

Han Jian1, Luo Ming1, Xu Jinhong2, Wang Tongren2, Zhang Xianglin3

(1.AgronomyCollege,XinjiangAgriculturalUniversity,Urumqi830052,China;2.AwatAgriculturalTechnologyExtensionCenter,Awat843200,China;3.XinjiangEntry-ExitInspectionandQuarantineBureau,Urumqi830063,China)

A set of primers and TaqMan probe specific for Jujube witches’ broom phytoplasma were designed according to the conserved region of 16S rDNA gene, and the recombinant plasmid was constructed as a standard control. A TaqMan real-time fluorescent PCR assay for quantitative detection of the pathogen was established and optimized. The evaluation assay indicated that a good linear correlation was demonstrated in the standard curve for the real-time fluorescent PCR assay, with the correlation coefficient (r2) of 0.998. The method was specific to jujube witches’ broom phytoplasma, and it can detect 60 copies/μL plasmid DNA. It not only provides a sensitive, specific and reproducible method for detection of jujube witches’ broom phytoplasma, but also lays the foundation for the grading system of the pathogen at quantitative level.

jujube witches’ broom phytoplasma; TaqMan probe; real-time fluorescent quantitative PCR; detection

2013-11-14

：2014-04-08

新疆維吾爾自治區(qū)高?？蒲杏?jì)劃項(xiàng)目(XJEDU2010S15)；新疆維吾爾自治區(qū)自然科學(xué)基金(2010211A17)；質(zhì)檢公益性行業(yè)科研專項(xiàng)(201310091)

S 41; Q939.34

：ADOI：10.3969/j.issn.0529-1542.2014.05.020

* 通信作者 E-mail:luomingxjau@sina.com