謝家楠，郭建軍, 金道超

(貴州山地農(nóng)業(yè)病蟲害重點實驗室，貴州大學(xué)昆蟲研究所，貴陽 550025)

白背飛虱ISSR-PCR反應(yīng)體系構(gòu)建的正交設(shè)計優(yōu)化

謝家楠，郭建軍, 金道超*

(貴州山地農(nóng)業(yè)病蟲害重點實驗室，貴州大學(xué)昆蟲研究所，貴陽 550025)

白背飛虱是水稻重要害蟲之一。研究采用L16(45)正交設(shè)計優(yōu)化試驗，構(gòu)建了白背飛虱ISSR最優(yōu)反應(yīng)體系，并對引物退火溫度和反應(yīng)循環(huán)次數(shù)進行了優(yōu)化。結(jié)果表明：白背飛虱ISSR-PCR最優(yōu)反應(yīng)體系為2 μL 10×PCR Buffer(10mmol/L Tris-HCl;50mmol/L KCl),1.5 mmol/L Mg2+,0.25 mmol/L dNTPs，0.9 μmol/L引物，1UTaqPolymerase和50ng 模板DNA，ddH2O補充至20μL。本研究采用的10條引物的最佳退火溫度在51.0～54.0℃間，以引物相應(yīng)最優(yōu)退火溫度和40次反應(yīng)循環(huán)可獲得較好的白背飛虱ISSR-PCR結(jié)果。

白背飛虱； 正交設(shè)計； ISSR

ISSR(inter-simple sequence repeat)標(biāo)記是一種基于微衛(wèi)星基礎(chǔ)的分子技術(shù)[1]，其用小段重復(fù)序列加2～4個隨機核苷酸為引物，PCR擴增模板DNA重復(fù)序列間基因片段，采用聚丙烯酰胺或瓊脂糖凝膠電泳分析擴增獲得的條帶，研究其基因多態(tài)性。該技術(shù)較SSR技術(shù)引物開發(fā)簡單、通用性好；較RAPD技術(shù)信息量大、多態(tài)性高；精確度幾乎可與RFLP相媲美，具有良好的穩(wěn)定性和檢測方便等特性[2]，已廣泛用于地理種群遺傳多樣性研究[3-5]。在ISSR標(biāo)記的實際應(yīng)用中需首先優(yōu)化PCR反應(yīng)體系，才能獲得可靠的試驗結(jié)果。

白背飛虱[Sogatellafurcifera(Horváth)]屬半翅目(Hemiptera)飛虱科(Delphacidae)[6]，是廣布性重要水稻害蟲[7]；自20世紀(jì)50年代后期水稻種植制度改制以來，白背飛虱為害逐年擴大，特別在近年因其暴發(fā)為害造成水稻大量減產(chǎn)甚至絕收的情況屢見不鮮[8]。在此背景下，展開了稻飛虱的廣泛研究[9-12]，但對白背飛虱ISSR-PCR體系系統(tǒng)優(yōu)化研究尚未見報道。

本研究采用正交設(shè)計法對白背飛虱ISSR-PCR體系進行了優(yōu)化研究，分析了Mg2+濃度、TaqDNA聚合酶量、dNTPs濃度、模板DNA量和Primer濃度對白背飛虱ISSR-PCR體系的影響，獲得了白背飛虱ISSR-PCR反應(yīng)的最優(yōu)體系，為白背飛虱的遺傳多樣性分析和分子生態(tài)學(xué)研究提供了有益借鑒。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

樣本：白背飛虱成蟲，經(jīng)飼養(yǎng)去寄生和饑餓處理。

引物：英屬哥倫比亞大學(xué)(UBC)生物技術(shù)實驗室開發(fā)，委托上海生物工程公司合成。

試劑：dNTPs、TaqDNA聚合酶、10×PCR buffer、MgCl2為寶生物工程有限公司產(chǎn)品。

1.2 基因組DNA提取

白背飛虱基因組DNA提取采用SDS法[13]并略加修改。BIO-RAD SmartSpec plus核酸蛋白測定儀檢測DNA濃度和質(zhì)量。瓊脂糖凝膠電泳條帶無雜帶及彌散、A260/A280值1.8左右的基因組DNA-20℃保存。

1.3 ISSR-PCR體系正交設(shè)計

為獲得白背飛虱最優(yōu)ISSR-PCR反應(yīng)體系，使用正交設(shè)計助手II軟件對Mg2+濃度、TaqDNA聚合酶量、dNTPs濃度、模板DNA量和引物濃度5個因素4個水平選用L16(45)正交優(yōu)化表做正交優(yōu)化試驗(表1、表2)，試驗重復(fù)3次。反應(yīng)體系包括上述5個成分外，添加2 μL的10×PCR Buffer(10mmol/L Tris-HCl;50mmol/L KCl),最后ddH2O補充至20μL。

表1白背飛虱ISSR-PCR體系因素水平設(shè)計

Table1FactorsandlevelsofISSR-PCRreactionforS.furcifera

水平Level因素FactorMg2+濃度/mmol·L-1Mg2+dNTPs濃度/mmol·L-1dNTPs引物濃度/μmol·L-1PrimerTaqDNA聚合酶量/UTaqDNApolymeraseDNA模板量/ngDNAtemplate11．50．150．30．61021．80．200．60．83032．10．250．91．05042．40．301．21．270

1.4 ISSR-PCR擴增反應(yīng)

PCR反應(yīng)在iCycler Thermal Cycler(BIO-RAD)PCR儀上進行，參數(shù)為：94 ℃變性4 min；94 ℃變性1min，退火1min，72 ℃延伸2 min，40個循環(huán)；72 ℃延伸10min。擴增產(chǎn)物2%瓊脂糖凝膠(含GoldView I核酸染料)電泳檢測，UNIVERSAL HOOD‖(BIO-RAD)凝膠成像系統(tǒng)拍照。

表2白背飛虱ISSR-PCR正交試驗設(shè)計[L16(45)]

Table2OrthogonaldesignforISSR-PCRreactionforS.furcifera[L16(45)]

水平Level因素FactorMg2+濃度/mmol·L-1Mg2+dNTPs濃度/mmol·L-1dNTPs引物濃度/μmol·L-1PrimerTaqDNA聚合酶量/UTaqDNApolymeraseDNA模板量/ngDNAtemplate11．50．150．30．61021．50．200．60．83031．50．250．91．05041．50．301．21．27051．80．150．61．07061．80．200．31．25071．80．251．20．63081．80．300．90．81092．10．150．91．230102．10．201．21．010112．10．250．30．870122．10．300．60．650132．40．151．20．850142．40．200．90．670152．40．250．61．210162．40．300．31．030

1.5 引物退火溫度及反應(yīng)循環(huán)篩選

正交優(yōu)化試驗建立白背飛虱ISSR-PCR體系，ISSR引物以Tm為基礎(chǔ)浮動10℃進行退火溫度篩選，以條帶豐富、穩(wěn)定為優(yōu)。以35、40、45次3個梯度進行ISSR-PCR反應(yīng)循環(huán)次數(shù)篩選，試驗重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 直觀分析法評分

分析白背飛虱ISSR-PCR正交試驗擴增產(chǎn)物電泳圖(圖1)，依據(jù)條帶豐富度、清晰度及背景干擾強弱做直觀分析。泳道條帶數(shù)量多、清晰度高、背景干擾低的PCR產(chǎn)物記分最高，記16，相反情況PCR產(chǎn)物記分最低，記1。圖1自左至右結(jié)果記分依次記7、9、16、10、5、6、15、14、1、2、4、11、3、12、13、8。16個處理結(jié)果取3次重復(fù)試驗記分平均值。

圖1 白背飛虱ISSR-PCR正交試驗產(chǎn)物電泳結(jié)果Fig.1 S.furcifera electrophoresis of ISSR-PCR products in the orthogonal tests

2.2 ISSR-PCR反應(yīng)影響因素分析

采用正交設(shè)計助手II軟件對試驗結(jié)果進行方差分析，F(xiàn)比值表明：白背飛虱ISSR-PCR反應(yīng)5個因素影響程度不同：dNTPs 濃度> Mg2+濃度> 引物濃度>TaqDNA聚合酶量>模板DNA量。

2.2.1 Mg2+濃度對白背飛虱ISSR-PCR反應(yīng)的影響

白背飛虱ISSR-PCR反應(yīng)Mg2+濃度指標(biāo)曲線表明(圖2)：Mg2+濃度由1.5 mmol/L至2.1mmol/L變化，擴增結(jié)果記分降低；2.1mmol/L至2.4 mmol/L，擴增結(jié)果記分上升，但較濃度1.5 mmol/L至1.8 mmol/L差。綜合表明：白背飛虱ISSR-PCR反應(yīng)Mg2+濃度1.5 mmol/L時最優(yōu)。

2.2.2 dNTPs濃度對白背飛虱ISSR-PCR反應(yīng)的影響

白背飛虱ISSR-PCR反應(yīng)dNTPs濃度指標(biāo)曲線表明(圖2)：dNTPs濃度由0.15 mmol/L至0.25 mmol/L變化，擴增結(jié)果記分上升；0.25 mmol/L至0.30mmol/L，擴增結(jié)果記分降低。白背飛虱ISSR-PCR反應(yīng)dNTPs最優(yōu)濃度為0.25 mmol/L。

圖2 白背飛虱ISSR-PCR反應(yīng)因素指標(biāo)曲線Fig.2 The ISSR-PCR factor index curve for S.furcifera

2.2.3 引物濃度對白背飛虱ISSR-PCR反應(yīng)的影響

白背飛虱ISSR-PCR反應(yīng)引物濃度指標(biāo)曲線表明(圖2)：引物濃度由0.3μmol/L至0.9 μmol/L變化，擴增結(jié)果記分上升；0.9 μmol/L至1.2 μmol/L，擴增結(jié)果記分降低。白背飛虱ISSR-PCR反應(yīng)引物最優(yōu)濃度為0.9 μmol/L。

2.2.4 Taq DNA聚合酶量對白背飛虱ISSR-PCR反應(yīng)的影響

白背飛虱ISSR-PCR反應(yīng)TaqDNA聚合酶量指標(biāo)曲線表明(圖2)：TaqDNA聚合酶量由0.6U至0.8 U、1.0U至1.2 U變化，擴增結(jié)果記分降低；0.8 U至1.0U，擴增結(jié)果記分上升。0.6U和1.0U為記分值兩個變化高峰值。綜合TaqDNA聚合酶F比值分析表明：白背飛虱ISSR-PCR反應(yīng)TaqDNA聚合酶量1.0U時最優(yōu)。

2.2.5 模板DNA量對白背飛虱ISSR-PCR反應(yīng)的影響

白背飛虱ISSR-PCR反應(yīng)模板DNA量指標(biāo)曲線表明(圖2)：模板DNA量由10ng至30ng、50ng至70ng變化，擴增結(jié)果記分降低；30ng 至50ng，擴增結(jié)果記分上升。白背飛虱ISSR-PCR反應(yīng)模板DNA量為50ng時最優(yōu)。

2.3 退火溫度對白背飛虱ISSR-PCR反應(yīng)的影響

退火溫度對ISSR-PCR反應(yīng)結(jié)果具較大影響。由英屬哥倫比亞大學(xué)生物技術(shù)實驗室(UBC)開發(fā)的ISSR引物中篩選獲得10條引物，做退火溫度梯度篩選(圖3)，獲得該10條引物的最優(yōu)退火溫度有所不同，在51.0～54.0℃間(表3)。

圖3 引物AG-2退火溫度梯度篩選Fig.3 The results of ISSR-PCR at different annealing temperatures with primer AG-2

表3 白背飛虱ISSR-PCR引物信息1)Table 3 The primers of ISSR-PCR for S.furcifera

1) Y=1/4(C,T); R=1/4(A,G)

2.4 循環(huán)次數(shù)對白背飛虱ISSR-PCR反應(yīng)的影響

白背飛虱ISSR-PCR反應(yīng)循環(huán)次數(shù)篩選試驗設(shè)置了35、40、45次3個梯度，綜合條帶的豐富度及泳道彌散情況表明(圖4)，40次循環(huán)為白背飛虱ISSR-PCR反應(yīng)最優(yōu)循環(huán)次數(shù)。

圖4 白背飛虱ISSR-PCR反應(yīng)循環(huán)次數(shù)篩選Fig.4 The results of different ISSR-PCR cycles

3 結(jié)論與討論

本研究結(jié)果揭示Mg2+、TaqDNA聚合酶、dNTPs、模板DNA和引物等因素綜合影響PCR反應(yīng)，因素間存在相互作用。正交設(shè)計優(yōu)化以PCR體系各因素綜合作用為研究對象，相對單因素分別優(yōu)化法，正交設(shè)計優(yōu)化試驗簡化了試驗步驟，降低了試驗成本，縮減了試驗周期，獲得的最優(yōu)組合更符合試驗實際情況。

Mg2+作為TaqDNA聚合酶激活劑，濃度過高導(dǎo)致非特異產(chǎn)物增加；濃度過低降低了聚合酶的作用，導(dǎo)致產(chǎn)物量降低。dNTPs作為PCR產(chǎn)物原料，濃度過高影響Mg2+的作用；過低則PCR反應(yīng)不完全，產(chǎn)物量降低。模板DNA濃度影響與引物結(jié)合幾率，過低或過高會降低結(jié)合幾率，產(chǎn)物量降低[14]。本研究基于正交優(yōu)化設(shè)計對白背飛虱ISSR-PCR的5個因素進行4水平優(yōu)化，構(gòu)建了最優(yōu)體系，即：2 μL 10×PCR Buffer(10mmol/L Tris-HCl;50mmol/L KCl),1.5 mmol/L Mg2+,0.25 mmol/L dNTPs，0.9 μmol/L Primer，1UTaqDNA聚合酶(TaKaRa)和50ng 模板DNA，ddH2O補充至20μL。

退火溫度對PCR結(jié)果有較大影響[15]，溫度過低會增加引物與DNA模板的非特異性結(jié)合，從而導(dǎo)致反應(yīng)結(jié)果中出現(xiàn)大量非特異性結(jié)合條帶；溫度過高會降低引物與DNA模板的特異性結(jié)合，導(dǎo)致反應(yīng)結(jié)果中特異性結(jié)合條帶減少。本研究對10條白背飛虱ISSR-PCR引物做退火溫度梯度篩選，獲得了各引物最優(yōu)退火溫度。各引物的最優(yōu)退火溫度有所不同，在51.0～54.0℃間。循環(huán)次數(shù)對ISSR-PCR反應(yīng)結(jié)果有一定的影響，較少的循環(huán)次數(shù)會導(dǎo)致擴增產(chǎn)物量減少，條帶檢測困難；較多的循環(huán)次數(shù)會導(dǎo)致非特異性產(chǎn)物的增加，導(dǎo)致泳道彌散嚴重。研究顯示40次循環(huán)為白背飛虱ISSR-PCR反應(yīng)最優(yōu)循環(huán)次數(shù)。

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EstablishmentandoptimizationofISSR-PCRreactionsystemwithorthogonaldesignforSogatellafurcifera

Xie Jianan, Guo Jianjun, Jin Daochao

(ProvincialKeyLaboratoryforAgriculturalPestManagementofMountainousRegions,InstituteofEntomology,GuizhouUniversity,Guiyang550025,China)

Sogatellafurciferais one of the most important rice pests.To establish and optimize ISSR-PCR reaction system forS.furcifera,the factors influencing ISSR system were studied with L16(45) orthogonal design,and the optimal annealing temperature and cycle times were proposed.The results showed that the optimal conditions for ISSR-PCR system were 2 μL 10×PCR buffer (10mmol/L Tris-HCl,50mmol/L KCl),1.5 mmol/L Mg2+,0.25 mmol/L dNTPs mixture,0.9 μmol/L of each primer,1UTaqDNA polymerase (TaKaRa) and 50ng template DNA in 20μL reaction volume.The optimal annealing temperatures were 51.0-54.0℃ for the 10primers used in the present study.The clear and reproducible DNA bands were obtained by the optimal annealing temperature and 40reaction cycles.

Sogatellafurcifera; orthogonal design; ISSR

2013-06-16

：2013-08-05

貴州省農(nóng)業(yè)攻關(guān)(黔科合NY字[2010]3064號)；“973”計劃前期研究專項(2009CB125909)；貴州省教育廳自然科學(xué)研究項目(2010011)

S 435.112.3

：ADOI：10.3969/j.issn.0529-1542.2014.02.021

* 通信作者 E-mail: dcjin@gzu.edu.cn