趙 旭，董向麗，張振芳，李桂舫，李保華

(青島農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與植物保護學(xué)院，山東省植物病蟲害綜合防控重點實驗室，青島 266109)

剪口齡期和水分脅迫對輪紋病菌從剪鋸口侵染的影響

趙 旭，董向麗，張振芳，李桂舫，李保華*

(青島農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與植物保護學(xué)院，山東省植物病蟲害綜合防控重點實驗室，青島 266109)

為了明確剪口齡期和水分脅迫對輪紋病菌從剪鋸口侵染的影響,本研究采用脫脂棉蘸取輪紋病菌分生孢子懸浮液接種不同齡期和斷水處理的‘富士’蘋果枝條剪口，研究了剪口齡期和水分脅迫對輪紋病菌從剪口侵染的影響。結(jié)果表明，春季修剪形成的剪口在2個月內(nèi)對輪紋病菌都較為敏感，接種發(fā)病率較高。夏秋季節(jié)形成的剪口在2周內(nèi)對輪紋病菌非常敏感，2周后抗病性逐漸增強。蘋果修剪前后，干旱能明顯降低剪口對輪紋病菌的抗侵入和抗擴展能力。保護剪鋸口不受侵染既能降低蘋果苗木帶菌率，又能有效控制輪紋病的危害。

輪紋?。?剪鋸口齡期； 水分脅迫； 剪鋸口侵染

蘋果輪紋病[Botryosphaeriadothidea(Moug.ex Fr.) Ces.& De Not.]是蘋果的重要病害，主要危害枝干和果實，引起病瘤、干腐和輪紋爛果癥狀，嚴(yán)重削弱樹勢，導(dǎo)致果實大量腐爛和死枝死樹[1]。20世紀(jì)70年代后期，隨著質(zhì)優(yōu)但感病‘富士’品種的栽培，輪紋病的危害逐漸加重，采收前常導(dǎo)致大量爛果[2]。隨著果實套袋技術(shù)的推廣，果實輪紋病得到有效控制，但枝干輪紋病逐年加重，已成為蘋果生產(chǎn)的突出問題，在環(huán)渤海灣和黃河故道蘋果產(chǎn)區(qū)，其危害已接近或超過腐爛病。2008年，據(jù)全國7個蘋果主產(chǎn)省的調(diào)查，枝干輪紋病的總體發(fā)病率達77.6%[3]，嚴(yán)重影響到蘋果產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

蘋果輪紋病除從氣孔、皮孔侵染外，還能從剪鋸口侵染。從剪鋸口侵染的輪紋病菌，主要造成干腐癥狀，在生長季節(jié)大量產(chǎn)孢，且維持2年以上，為輪紋病菌的侵染提供了大量侵染菌源[4]，在輪紋病的流行中具有重要作用。筆者近期還發(fā)現(xiàn)，輪紋病菌從剪鋸口侵染能導(dǎo)致蘋果幼苗大量帶菌，是新建果園輪紋病菌的主要侵染來源，危害嚴(yán)重。蘋果矮化密植栽培需要不斷地更新結(jié)果枝組，在主干上形成大量剪口，極大地提高了輪紋病的潛在威脅。目前，對剪鋸口處輪紋病菌的侵染了解很少，本研究采用人工接種方法研究了剪口齡期和水分脅迫對剪鋸口處輪紋病菌侵染的影響，為深入了解剪鋸口處輪紋病菌的侵染規(guī)律和枝干輪紋病防治提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 病原菌

供試輪紋病菌于2008年采自山東萊陽水沐頭村的蘋果園，為‘富士’蘋果枝條病瘤上的單孢分離菌株[5]，編號為LXS030101，活化前在4 ℃冰箱內(nèi)保存。

將輪紋病菌在PDA培養(yǎng)基上活化后，接種于‘富士’蘋果的幼果上，在蘋果的幼果上繁殖分生孢子[6]。將新鮮的分生孢子用純凈水配制成含105個/mL的孢子懸浮液，加入0.1%的吐溫-20，備用。

1.2 春季剪口齡期對輪紋病菌侵染的影響

2012年4月中旬，在青島農(nóng)業(yè)大學(xué)的實驗果園內(nèi)，選擇一年生‘富士’枝條的新鮮剪口標(biāo)記。從修剪后的第7天開始，每隔一個月接種15個剪口。接種時，用脫脂棉球蘸取孢子懸浮液直接放在剪口處，并包扎塑料膜保濕，48 h后解去塑料膜和保濕的棉球。接種后，每20d一次檢查記錄接種枝條的發(fā)病率，以剪口下方出現(xiàn)明顯的壞死病斑記為發(fā)病。從病菌接種到第1個病斑出現(xiàn)時的間隔天數(shù)為潛育期。

對于未見到癥狀的接種枝條，從剪口處剪取0.5 cm的枝段，表面消毒后進行組織分離，以確認有無輪紋病菌侵入剪口。

1.3 生長期剪口齡期對病菌侵染的影響

2012年8、9月份選取長勢旺盛的當(dāng)年生‘富士’蘋果的枝條，離基部20cm處剪斷。分別于剪口形成后的第0、1、2、4、8、12天和20天，將剪斷的枝條再從基部剪下，室內(nèi)人工控制條件下，接種后誘導(dǎo)枝條發(fā)病，每個處理接種10個枝條。接種時，用75%的乙醇擦拭整根枝條和剪口，待乙醇完全揮發(fā)后，用脫脂棉蘸取孢子懸浮液接種，置于30℃的恒溫光照培養(yǎng)箱(一恒MGC-250P，溫度控制精度±1℃)中，用蒸餾水培養(yǎng)。保濕培養(yǎng)24 h后，去除棉球，置于相對濕度為75%的環(huán)境(用飽和NaCl溶液控制濕度)中培養(yǎng)，每5 d一次調(diào)查記錄剪鋸口的發(fā)病情況。試驗分別在8月份和9月份重復(fù)2次。

1.4 枝條干旱失水對病菌侵染和擴展的影響

干旱失水試驗在防雨日光棚內(nèi)進行，試驗設(shè)置2個處理：1)干旱處理2 d后，形成剪口，形成剪口后立即接種；2)形成剪口后，干旱處理2 d，再接種，以正常每天澆水的果樹為對照。2012年7月下旬，選擇6株5年生的‘富士’蘋果盆栽苗，每株樹上標(biāo)記10個長勢旺盛、基部直徑接近1cm粗的枝條，其中3株進行斷水處理，3株正常澆水。6株盆栽苗斷水前，每天澆2次水，每次1L，3株盆栽苗，斷水4 d后葉片開始萎蔫，從葉片萎蔫的第2天開始正常澆水。斷水當(dāng)天，每株處理樹上剪斷5個標(biāo)記枝條，剪口距離基部5 cm。干旱處理2 d后，再將另外30個標(biāo)記枝條剪斷。第2批枝條剪斷的當(dāng)天，用脫脂棉蘸取孢子懸浮液同時對60個剪口接種。接種后保濕48 h。接種后每7 d調(diào)查一次，記錄剪口是否發(fā)病及病斑長度。

2 結(jié)果和分析

2.1 春季剪口齡期對病菌侵染的影響

剪口的齡期越短，病原菌越容易侵染。4月中旬修剪的蘋果樹，修剪6d接種，剪口的發(fā)病率為87%，潛育期為56d；36d后接種，發(fā)病率降至40%，潛育期延長至68 d；修剪后67 d接種，發(fā)病率降至13%，潛育期延長至84 d；修剪后99 d再接種，沒有見到發(fā)病枝條(表1)。對于所有未發(fā)病的枝條，切取剪口端部0.5 cm枝段分離，也未分離到輪紋病菌，表明沒有輪紋病菌從剪口侵染。

表1蘋果輪紋病菌分生孢子在‘富士’蘋果不同齡期剪口上的侵染率

Table1Percentageofinfected‘Fuji’applepruningwoundsofdifferentagesafterinoculatedwithconidiaofBotryosphaeriadothidea

剪口齡期/dAgeofpruningwound15個剪口中發(fā)病剪口數(shù)/個Numberofdiseasedwoundsin15pruningwounds 發(fā)病率/%Percentageofdiseasedwounds潛育期/dLatentperiodindays6138756366406867213849900-

2.2 生長期剪口齡期對病菌侵染的影響

生長季節(jié)，隨剪口齡期增長和傷口愈合抗病性逐漸增強。枝條修剪后3d內(nèi)，剪口對輪紋病菌非常敏感，接種發(fā)病率為100%；剪口形成后的4～8 d，仍對輪紋病敏感，接種枝條的發(fā)病率仍達80%；剪口形成12 d后，抗病性逐漸增加，修剪后第20天接種，枝條的發(fā)病率降至30%。剪口齡期對潛育期沒有顯著的影響(表2)。

表2蘋果輪紋病菌分生孢子在‘富士’蘋果枝條不同齡期剪口上的發(fā)病率

Table2Percentageofdiseasedpruningwoundsofdifferentageson‘Fuji’applebranchesafterinoculatedwithconidiaofBotryosphaeriadothidea

剪口齡期/dAgeofpruningwound20個剪口中發(fā)病剪口數(shù)/個Numberofdiseasedwoundsin20pruningwounds發(fā)病率/%Percentageofdiseasedwounds潛育期/dLatentperiodindays0201003120100322010034168038168031212607206307

2.3 枝條干旱失水對病菌侵染和擴展的影響

枝條干旱失水能顯著降低枝條對輪紋病菌的抗侵入能力和抗擴展能力。經(jīng)斷水處理2 d的盆栽蘋果幼樹修剪后，新形成剪口的接種發(fā)病率為100%，53d后病斑的平均長度為1.31cm，顯著高于未經(jīng)斷水處理樹上的剪口(P<0.05)，潛育期也短于未斷水處理樹上的剪口。盆栽蘋果樹修剪后，經(jīng)斷水處理2 d后再接種枝條的發(fā)病率為60%，53d后病斑的平均 長度為0.88 cm，也顯著高于未斷水處理樹上的剪口(P<0.05)(表3)。

表3輪紋病菌分生孢子在水分脅迫的剪口上的病斑長度和發(fā)病率1)

Table3PercentageofdiseasedwoundsandlengthofcankersontheinoculatedpruningwoundsstressedbywaterwithconidiaofBotryosphaeriadothidea

處理方法Treatment病斑長度/cmCankerlength發(fā)病率/%Percentageofdiseasedwounds潛育期/dLatentperiodindays干旱2d后剪枝，當(dāng)天接種Pruningandinoculating2daysafterdrought(1．31±0．66)a10015正常枝條剪枝，當(dāng)天接種Pruningandinoculatingnormalbranches(0．50±0．62)ab6726剪枝后干旱，2d后接種Droughtafterpruningandinocu?lating2dayslater(0．88±1．25)ab6019剪枝后正常處理，2d后接種Normaltreatmentafterpruningandinoculating2dayslater(0．30±0．48)b3326

1) 表中同列不同字母表示病斑長度在0.05水平上差異顯著。 Different letters in the same column indicate significant difference at 0.05 level.

3 結(jié)論與討論

春季修剪形成的剪口在2個月內(nèi)對輪紋病菌都較為敏感，接種發(fā)病率較高。夏秋季形成的剪口在2周內(nèi)對輪紋病非常敏感，2周后抗病性逐漸增強，3周齡的剪口接種發(fā)病率仍達30%。蘋果修剪前后，干旱能明顯降低剪口對輪紋病菌的抗侵入和抗擴展能力。

蘋果樹多在春季修剪，修剪的剪鋸口是輪紋病菌的重要侵染孔口，從剪鋸口侵染的輪紋病菌主要誘發(fā)干腐癥狀，在生長季節(jié)能產(chǎn)生大量孢子，為病害的流行提供了大量菌源。保護剪鋸口不受輪紋病菌侵染是控制輪紋病的發(fā)生與流行的重要措施。

輪紋病菌主要侵染皮層，皮層的愈合程度是影響輪紋病菌從剪鋸口侵染的重要因子。在煙臺蘋果產(chǎn)區(qū)，春季枝條從4月份開始發(fā)育，5月中下旬短梢停長后，大量養(yǎng)分才能從葉片回流到樹體，促進傷口的愈合。在傷口愈合前，剪鋸口一直都對輪紋病菌敏感。冬春季形成的剪鋸口感病期較長。本試驗的結(jié)果也證實，4月中旬形成的剪鋸口直到6月中旬才有較強的抗性。因此，春季在采用化學(xué)藥劑保護剪鋸口時，藥劑的保護效果要維持到剪鋸口愈合，即6月份蘋果短梢停長后，才能達到理想的效果。生長期間剪口的愈合速度主要取決于蘋果樹的長勢、氣溫和枝條的充水度。樹勢旺、氣溫高、枝條的充水度好，剪口愈合快。

蘋果樹育苗多在7-8月份蘋果旺長期嫁接，嫁接后需將嫁接口上方的砧木枝條剪除。剪砧后形成的剪口雖然愈傷速度很快，但在剪口愈合前很容易被輪紋病菌侵染。如果育苗圃離老果園或楊、柳樹較近，大量的輪紋病菌孢子隨風(fēng)雨傳播侵染未愈合的剪口，使蘋果幼苗嫁接口上方的“枯死樁”內(nèi)大量帶菌。帶有輪紋病菌的蘋果幼苗定植后，若受干旱脅迫，枝條失水，嫁接口上方“枯死樁”內(nèi)的腐爛病菌會迅速生長擴展，使蘋果幼苗的皮層從嫁接口處開始壞死，形成干腐癥狀，最終導(dǎo)致整樹枯死。能夠存活下來的幼樹，“枯死樁”上能產(chǎn)生大量孢子，隨雨水傳播，侵染主干，在主干下部形成大量輪紋病瘤，并逐漸向上擴展蔓延，嚴(yán)重削弱樹勢。M系砧對輪紋病更加敏感，以M系為自根砧和中間的蘋果苗，輪紋病菌的帶菌率更高。

在剪砧的當(dāng)天噴施殺菌劑，保護剪口不受輪紋病菌侵染是防止蘋果幼苗感染輪紋病的最有效措施。根據(jù)本試驗的結(jié)果，生長季節(jié)蘋果枝條上新形成的剪口在3周之內(nèi)對輪紋病菌都比較敏感。因此，保護剪鋸口的時間需維持3周以上，而且在嫁接或剪砧前要澆足水。

近年來，大力推廣蘋果矮化密植栽培技術(shù)。該技術(shù)的核心是需要不斷地更新結(jié)果枝組，與常規(guī)的栽培技術(shù)相比，修剪量更大，而且絕大部分剪口都在主干上，加重輪紋病菌和腐爛病菌的危害概率。因此，矮化密植園中春季保護剪鋸口顯得尤為重要。

水分脅迫能降低剪鋸口對輪紋病菌的抗侵入能力和抗擴展能力，輪紋病菌因此能夠從剪口大量侵入，且能迅速擴展，形成壞死斑。大量觀察也表明，當(dāng)蘋果樹受水分脅迫時，病瘤內(nèi)或潛伏于寄主組織的輪紋病菌能很快突破寄主的防御，在皮層內(nèi)迅速擴展，導(dǎo)致皮層壞死，形成干腐癥狀。6月份新栽幼樹大量死亡，就是干旱誘發(fā)干腐病發(fā)病造成的。干旱對于輪紋病菌擴展和侵染的影響機制目前還不明確，然而，防止干旱是防治輪紋病菌侵染和擴展的重要措施。

[1] 董娟華,李保華.蘋果輪紋病的研究進展[J].北方果樹,2009(1): 1-2.

[2] 陳策.蘋果果實輪紋病研究進展[J].植物病理學(xué)報,1999,29(3): 193-198.

[3] 國立耘,李金云,李保華,等.中國蘋果枝干輪紋病發(fā)生和防治情況[J].植物保護,2009,35(4): 120-123.

[4] Sutton T B.Production and dispersal of ascospores and conidia byPhysalosporaobtusaandBotryosphaeriadothideain apple orchards[J].Phytopathology,1981,71(6): 584-589.

[5] 董娟華,羅麗,王彩霞,等.一種強寄生病原真菌的分離方法——毛細管打孔單孢分離法[J].中國農(nóng)學(xué)通報,2009,25(3): 210-212.

[6] 冷偉峰,李保華,國立耘,等.蘋果輪紋病菌誘導(dǎo)產(chǎn)孢方法[J].植物病理學(xué)報,2009,39(5): 536-539.

EffectsofpruningwoundageandwaterstressonwoundinfectionbyBotryosphaeriadothidea

Zhao Xu, Dong Xiangli, Zhang Zhenfang, Li Guifang, Li Baohua

(CollegeofCropProtectionandAgronomy,QingdaoAgriculturalUniversity，KeyLaboratoryofIntegratedCropPestManagementofShandongProvince，Qingdao266109,China)

In order to investigate the effects of pruning wound age and water stress on apple pruning wound infection byBotryosphaeriadothidea,apple pruning wounds with different ages or water stress were inoculated with conidia of the pathogen.The results showed that,pruning wounds within 2 months in spring were susceptible to pathogen and the infected wound percentage was high.Pruning wounds formed in summer and autumn within 2 weeks were susceptible,and later they gradually become resistant against the infection.Loss of or stressed by water reduced the resistance of the pruning wounds against the infection byB.dothidea.Preventing the infection from pruning wounds would depress the infection percentage of apple seedlings and diminish the damaging by the pathogen.

Botryosphaeriadothidea; age of pruning wounds; water stress; infection of pruning wounds

2013-03-08

：2013-03-28

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系(CARS-28)；公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(nyhyzx3-22)；山東省泰山學(xué)者建設(shè)工程專項

S 436.611.1

：ADOI：10.3969/j.issn.0529-1542.2014.02.023

* 通信作者 Tel:0532-88030480; E-mail: baohuali@qau.edu.cn