韓 淼，汪曉雯，黃 琛，朱小瓊，國(guó)立耘

(中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理學(xué)系，北京 100193)

甘肅和內(nèi)蒙古地區(qū)馬鈴薯晚疫病菌的致病型

韓 淼，汪曉雯，黃 琛，朱小瓊，國(guó)立耘*

(中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理學(xué)系，北京 100193)

利用來(lái)自國(guó)際馬鈴薯中心含有單顯性抗性基因的11個(gè)鑒別寄主，采用離體葉片測(cè)定方法對(duì)2007—2008年采自甘肅和內(nèi)蒙古地區(qū)的共91個(gè)致病疫霉馬鈴薯分離物的致病型進(jìn)行了測(cè)定。結(jié)果顯示：來(lái)自甘肅的65株菌中共有28個(gè)致病型，有3株可以克服11個(gè)抗性基因；總共有超過(guò)一半的菌株對(duì)抗性基因R7、R9、R11有毒性，而能克服抗性基因R1、R2、R8的菌株數(shù)最少。在來(lái)自內(nèi)蒙古的26株菌中，共檢測(cè)到24個(gè)致病型，有2株菌能克服11個(gè)抗性基因，共有84.6%的菌株可以對(duì)含有抗性基因R7的植株表現(xiàn)出毒性，而R1、R2、R8被克服比例最低。因此，研究結(jié)果表明，在這兩個(gè)地區(qū)可優(yōu)先考慮在菌株采集地種植和選育含有R1，R2和R8這3個(gè)抗性基因的馬鈴薯品種。

馬鈴薯； 馬鈴薯晚疫病菌； 致病型； 鑒別寄主

致病疫霉(Phytophthorainfestans)引起的馬鈴薯晚疫病是馬鈴薯生產(chǎn)中的主要病害之一，病原菌能在短時(shí)間內(nèi)引起寄主塊莖、莖、葉等腐爛，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1]。該病害在我國(guó)馬鈴薯各大主產(chǎn)區(qū)均有發(fā)生[2]，是制約我國(guó)馬鈴薯產(chǎn)業(yè)發(fā)展的一個(gè)重要因素。

致病疫霉是異宗配合的卵菌，通常通過(guò)A1和A2兩種交配型進(jìn)行有性生殖。在過(guò)去的30年中，該病害在多國(guó)嚴(yán)重發(fā)生。國(guó)際貿(mào)易中引起的致病疫霉群體通過(guò)國(guó)際遷移發(fā)生導(dǎo)致的包括出現(xiàn)A2交配型和抗藥性菌株群體結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性增加，被認(rèn)為是該病害在各地嚴(yán)重發(fā)生的主要原因[1]。近些年，中國(guó)多地出現(xiàn)了自育菌株[2-3](即菌株在單獨(dú)培養(yǎng)的條件下可產(chǎn)生具有活性的卵孢子)[3]。自育菌株的出現(xiàn)使田間馬鈴薯晚疫病菌發(fā)生有性生殖的幾率增大，而有性生殖產(chǎn)生的基因重組是增加病菌種群多樣性的重要途徑。研究已發(fā)現(xiàn)自育菌株出現(xiàn)的區(qū)域的群體基因型多樣性顯著高于未發(fā)現(xiàn)自育菌株的地區(qū)[3]，但是，群體基因型多樣性的增加是否對(duì)病原菌的致病性產(chǎn)生影響還有待研究。晚疫病的發(fā)生符合基因?qū)蚣僬f(shuō)[4]，所以病原菌無(wú)毒基因與寄主抗病基因互作決定了病害的發(fā)生。根據(jù)基因?qū)蚣僬f(shuō)，抗病基因即R基因編碼的蛋白識(shí)別對(duì)應(yīng)的無(wú)毒基因編碼的蛋白效應(yīng)物從而導(dǎo)致過(guò)敏性壞死反應(yīng)(hypersensitive reaction)。基于此識(shí)別反應(yīng)，晚疫病的馬鈴薯鑒別寄主可用于馬鈴薯晚疫病菌菌株的致病型檢測(cè)。該檢測(cè)不僅可以反映出菌株間的致病性差異，還能反映出毒性基因的分布和比例，對(duì)病原菌群體致病型結(jié)構(gòu)的了解是制定有效防治策略的基礎(chǔ)。

甘肅省和內(nèi)蒙古自治區(qū)是中國(guó)最重要的種薯和商品薯生產(chǎn)地，也是晚疫病的常發(fā)區(qū)。做好馬鈴薯種薯產(chǎn)地的晚疫病防治是保證馬鈴薯商品薯高產(chǎn)的前提。本研究的目的是明確甘肅和內(nèi)蒙古地區(qū)馬鈴薯晚疫病菌群體中的致病型種類及其分布。

1 材料與方法

1.1 材料

供試菌株：2007年采自甘肅省十個(gè)地區(qū)的馬鈴薯晚疫病菌株65株和2008年采自內(nèi)蒙古地區(qū)的馬鈴薯晚疫病菌株26株(表 1)。

表1馬鈴薯晚疫病菌菌株來(lái)源及不同地區(qū)的致病型類型

Table1OriginsofthePhytophthorainfestansisolatesandthevarianceofpathotypesindifferentregions

年份Year地點(diǎn)Location菌株數(shù)No．ofisolates交配型Matingtype致病型數(shù)No．ofpathotypeSSR基因型數(shù)No．ofgenotypes2007定西Dingxi，Gansu7A143東鄉(xiāng)平Dongxiangping，Gansu4A133會(huì)川Huichuan，Gansu11A199臨夏Linxia，Gansu5A142岷縣Minxian，Gansu4A144天水Tianshui，Gansu19A1，自育1213永登Yongdeng，Gansu2A122渝中Yuzhong，Gansu5A142渝中上莊Yuzhongshangzhuang，Gansu3A123莊浪Zhuanglang，Gansu5A1432007集寧Jining，InnerMongolia2A11-2008呼和浩特Huhhot，InnerMongolia19A1，自育18-烏蘭察布Ulanqab，InnerMongolia2A12-武川Wuchuan，InnerMongolia3A13-Total 91

植物材料：含有單個(gè)抗性基因R1-R11的11個(gè)鑒別寄主的組培苗，感病品種‘夏波蒂’(‘Shapody’)作為對(duì)照。

1.2 方法

1.2.1 鑒別寄主的準(zhǔn)備

MS培養(yǎng)基配方如下。

大量元素(母液Ⅰ)： NH4NO333g/L；KNO338 g/L；CaCl2·2H2O 8.8 g/L； MgSO4·7H2O 7.4 g/L；KH2PO43.4 g/L。

微量元素(母液Ⅱ)：KI 0.166g/L；H3BO 1.240g/L；MnSO4·4H2O 4.460g/L；ZnSO4·7H2O 1.720g/L； NaMoO4·2H2O 0.05 g/L；CuSO4·5H2O 0.005 g/L； CoCl2·6H2O 0.005 g/L。

鐵鹽(母液Ⅲ)：FeSO4·7H2O 5.560g/L；Na2-EDTA·2H2O 7.460g/L。

有機(jī)成分(母液Ⅳ)：ⅣA肌醇 20g/L；ⅣB煙酸0.100g/L；鹽酸吡哆醇(維生素B6)0.100g/L；鹽酸硫胺醇(維生素B1)0.100g/L；甘氨酸0.400g/L。

以上各種營(yíng)養(yǎng)成分的用量，除了母液Ⅰ為20倍濃縮液外，其余的均為200倍濃縮液。

組培苗莖段移植在MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)3～5周后，將其移栽至營(yíng)養(yǎng)土草炭土和蛭石以1∶1比例的混合物中。移栽后用保鮮膜覆蓋住培養(yǎng)盒，3～5 d后可將保鮮膜揭開(kāi)，于18～25 ℃溫室中L∥D=16h∥8 h條件下培養(yǎng)。待組培苗長(zhǎng)出7～10片復(fù)葉時(shí)即可采集葉片用于接種鑒定。

1.2.2 游動(dòng)孢子懸浮液的制備

將待測(cè)菌株的菌絲塊接種于黑麥番茄培養(yǎng)基上[2]，在18 ℃條件下黑暗培養(yǎng)7～10d。用無(wú)菌水將游動(dòng)孢子囊洗下，并將菌絲等雜質(zhì)過(guò)濾掉。之后將游動(dòng)孢子囊懸浮液調(diào)至濃度為5 × 104個(gè)/mL，收集到的孢子囊懸浮液放入4 ℃下培養(yǎng)3h以促進(jìn)游動(dòng)孢子釋放，接種工作應(yīng)在1h之內(nèi)完成，以免游動(dòng)孢子喪失活性。

1.2.3 接種方法

采用離體葉片測(cè)定的方法。在培養(yǎng)皿中放入直徑9 cm的濾紙，加入無(wú)菌水潤(rùn)濕濾紙，以保持培養(yǎng)皿內(nèi)部的相對(duì)濕度在90%以上。采集待測(cè)鑒別寄主植株的中部葉片，背面朝上放入培養(yǎng)皿中，每個(gè)培養(yǎng)皿中3～4片葉，每個(gè)葉片接種不同菌株。將待測(cè)菌株的游動(dòng)孢子懸浮液接種于葉片背面，每個(gè)葉片接種10μL，每個(gè)菌株設(shè)4個(gè)重復(fù)，隨機(jī)分布在不同皿中。接種后在18～19 ℃下暗培養(yǎng)12～24 h，14～16h/d光照(2000～4000lx)繼續(xù)培養(yǎng)4～7 d。接種后的第4～7天開(kāi)始觀察和記錄檢測(cè)結(jié)果，所有的試驗(yàn)在獨(dú)立的條件下重復(fù)2～3次。

1.2.4 病情調(diào)查

葉片發(fā)病病級(jí)采用如下分級(jí)方法(圖1)。

圖1 致病型測(cè)定的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)Fig.1 Classification standard of pathotype testing

0級(jí)：無(wú)侵染癥狀。

1級(jí)：典型的過(guò)敏性反應(yīng)；肉眼可見(jiàn)微小病斑、黑色壞死，一般僅局限于接種位點(diǎn)，無(wú)明顯擴(kuò)展，病斑邊緣無(wú)失綠暈環(huán)，無(wú)菌絲體和孢子囊產(chǎn)生。連續(xù)觀察4～7 d，結(jié)果相同；延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間后，鏡檢確認(rèn)葉片表面無(wú)菌絲體和孢子囊形成。

2級(jí)：限制性病斑;肉眼可見(jiàn)較明顯的限制性病斑、黑色壞死，一般僅局限于接種位點(diǎn)及有限鄰近區(qū)域，病斑不能跨越二級(jí)葉脈，病斑邊緣無(wú)失綠暈環(huán)，無(wú)或極少有菌絲體和孢子囊產(chǎn)生。延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間后，鏡檢確認(rèn)葉片表面菌絲體稀少，無(wú)或極少有孢子囊形成。

3級(jí)：典型的擴(kuò)展性水浸狀病斑;肉眼可見(jiàn)接種部位及附近、甚至整個(gè)葉片成水浸狀，表面有大量菌絲體產(chǎn)生、大范圍蔓延，病斑形狀不規(guī)則，病斑組織變黑壞死尚不明顯，邊緣有明顯的失綠暈環(huán)。病斑擴(kuò)展顯著、可跨越二級(jí)葉脈和主葉脈，形狀不斷變化，顯微觀察可見(jiàn)大量菌絲體和孢子囊的形成。

其中，0<平均病級(jí)≤2為抗性反應(yīng)(resistant)，平均值>2為感病反應(yīng)(susceptible)即供試菌株含有相應(yīng)的毒性基因。根據(jù)Black等[5]的方法確定菌株的致病型類型。

2 結(jié)果和分析

通過(guò)檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)來(lái)自甘肅省10個(gè)地區(qū)的65株馬鈴薯晚疫病菌中，共有28個(gè)致病型(表2)。其中，天水地區(qū)的19株菌分屬12個(gè)致病型；會(huì)川地區(qū)的11株菌屬于9個(gè)致病型。在發(fā)現(xiàn)的28個(gè)致病型中，0致病型最多，占25%。其次是致病型7.9.11，發(fā)生頻率為15.6%。共檢測(cè)到3個(gè)菌株對(duì)所測(cè)11個(gè)寄主均表現(xiàn)為毒性，屬于所謂的“超級(jí)致病型”，之前的研究發(fā)現(xiàn)其SSR基因型均為3[3](表1)。來(lái)自內(nèi)蒙古地區(qū)的26株馬鈴薯晚疫病菌菌株中共有24個(gè)致病型(表2)，所有致病型所占比例都很低，未發(fā)現(xiàn)優(yōu)勢(shì)致病型，有2株菌屬于超級(jí)致病型。結(jié)合之前對(duì)甘肅省十個(gè)地區(qū)的致病疫霉群體的SSR基因型研究結(jié)果[3]，采用Pearson相關(guān)系數(shù)對(duì)2007年采自甘肅地區(qū)的菌株SSR基因型種類和致病型種類進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示晚疫病菌致病型多樣性與SSR基因型多樣性存在一定的正相關(guān)性(P<0.01)，即基因型種類較多的地區(qū)其致病型種類也較豐富。

研究還發(fā)現(xiàn)來(lái)自甘肅的菌株中，分別有64.5%、51.6%、50.0%的菌株對(duì)含有R7、R9、R11的植株表現(xiàn)出毒性(圖2)。其次是對(duì)R4、R10表現(xiàn)毒性的菌株比率分別為22.6%和33.9%。對(duì)R3、R5、R6表現(xiàn)毒性的比例分別為17.7%、16.1%、17.7%，而能克服R1、R2、R8的菌株比率最低，均為8.1%。

來(lái)自內(nèi)蒙古的菌株群體中，超過(guò)一半的菌株可以克服R7(84.6%)、R9(69.2%)、R10(53.8%)、R11(76.9%)?？朔3、R4、R5、R6菌株比例相對(duì)較低，分別為46.2%、42.3%、34.6%、42.3%。僅有23.1%、15.4%、15.4%的菌株可以克服抗性基因R1、R2和R8(圖2)。

圖2 甘肅和內(nèi)蒙古地區(qū)馬鈴薯晚疫病菌分離物克服11個(gè)寄主抗性基因的比例Fig.2 Frequency of compatible interaction of Phytophthora infestans from Gansu and Inner Mongolia defeating R genes in 11differentials

表2 甘肅和內(nèi)蒙古馬鈴薯晚疫病菌群體的致病型種類及其頻率Table 2 Pathotype structure and percentages of Phytophthorainfestans population in Gansu and Inner Mongolia

3 討論

本研究從采自甘肅和內(nèi)蒙古的91株馬鈴薯晚疫病菌中共檢測(cè)到45個(gè)致病型，表明這兩個(gè)地區(qū)的馬鈴薯晚疫病菌的致病型種類豐富。其中在來(lái)自甘肅天水地區(qū)的19株菌(4株A1型菌株，15株自育型菌株)中鑒定出17種致病型；之前的研究也發(fā)現(xiàn)天水地區(qū)的SSR基因型多樣性指數(shù)是在甘肅地區(qū)中最高的[3]。天水地區(qū)是甘肅省重要的種薯培育基地，該地馬鈴薯品種繁多，病原菌群體受到的選擇壓力高，同時(shí)，自育菌株的存在也可能是導(dǎo)致該地馬鈴薯晚疫病菌菌株群體結(jié)構(gòu)非常復(fù)雜的一個(gè)原因。

研究中發(fā)現(xiàn)，超過(guò)一半的菌株在抗性基因R7、R9、R11的植株上表現(xiàn)為毒性；抗性基因R1、R2和R8被克服比例最低。因此，培育含有R1、R2和R8的馬鈴薯品種用于晚疫病的防治在該地區(qū)仍然是可行的。姚裕琪等[6]1995年用7個(gè)單基因寄主，5個(gè)雙基因寄主和3個(gè)雙基因寄主在內(nèi)蒙古呼市檢測(cè)到5種致病型；郭軍等[7]在1997-1999年和2002-2003年采自內(nèi)蒙古地區(qū)的38個(gè)致病疫霉菌株中發(fā)現(xiàn)了18個(gè)致病型。2009年，成蘭芳等[8]從甘肅地區(qū)采集的63株菌中發(fā)現(xiàn)了16種致病型。由此可見(jiàn)，甘肅和內(nèi)蒙古地區(qū)的馬鈴薯晚疫病菌的致病型結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)出多樣性和復(fù)雜性。因此，今后應(yīng)加強(qiáng)對(duì)該地區(qū)晚疫病菌致病型組成及群體結(jié)構(gòu)的監(jiān)測(cè)和研究。

超級(jí)致病型(或超級(jí)生理小種)，即對(duì)所有11個(gè)公認(rèn)的含有單顯性抗性基因的寄主均表現(xiàn)為毒性的菌株歷來(lái)是對(duì)馬鈴薯晚病菌菌株群體檢測(cè)的重要目標(biāo)之一。本研究中從來(lái)自甘肅和內(nèi)蒙古的馬鈴薯晚疫病菌菌株群體中均檢測(cè)到超級(jí)致病型。自2000年以來(lái)，歐洲地區(qū)也相繼發(fā)現(xiàn)超級(jí)致病型，根據(jù)目前EUROBLIGHT (http:∥euroblight.net/)的整理，比利時(shí)、愛(ài)沙尼亞、北愛(ài)爾蘭和荷蘭都已發(fā)現(xiàn)超級(jí)致病型，但是超級(jí)致病型的比例占所測(cè)菌株的比例仍然較低，除北愛(ài)爾蘭8%左右，其他國(guó)家的均低于5%。此前，在內(nèi)蒙古自治區(qū)(5株菌，2003年)[7]、云南省[9-10]、四川省(2株，2006-2008年)以及黑龍江省和吉林省(18株，2009年)[11]均被檢測(cè)到，比例仍然較低，這一結(jié)果與此前歐洲的發(fā)現(xiàn)相似。

致病型測(cè)定雖然是目前普遍采用的檢測(cè)菌株對(duì)寄主植物毒性反應(yīng)的方法，但是，該方法不僅耗時(shí)長(zhǎng)，而且需要標(biāo)準(zhǔn)的含有單顯性基因的專用寄主。本研究的結(jié)果顯示晚疫病致病型的多樣性與群體遺傳多樣性存在一定的正相關(guān)性，且目前發(fā)現(xiàn)的超級(jí)致病型的多為SSR基因型3。因此，SSR 標(biāo)記可以作為監(jiān)測(cè)的輔助工具。

綜上所述，測(cè)定馬鈴薯晚疫病菌菌株群體的致病型類型和分布，以及借助SSR 標(biāo)記快速發(fā)現(xiàn)潛在的超級(jí)致病型只是田間菌株群體監(jiān)測(cè)的基礎(chǔ)，根據(jù)該地的致病型結(jié)構(gòu)，合理進(jìn)行馬鈴薯抗病品種的培育及布局，應(yīng)該作為今后的主要防治策略之一。

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PathotypesofPhytophthorainfestansisolatesinGansuandInnerMongolia

Han Miao, Wang Xiaowen, Huang Chen, Zhu Xiaoqiong, Guo Liyun

(DepartmentofPlantPathology,ChinaAgriculturalUniversity,Beijing100193,China)

A determination was performed to figure out the distribution ofPhytophthorainfestanspathotypes in Gansu and Inner Mongolia by using 11differentials of potato lines carrying resistance (R) genes.The results showed that among the 65 isolates collected from Gansu,28 pathotypes were detected,of which pathotype 0and pathotype 7.9.11were the most frequent,while the frequencies ofVir1,Vir2 andVir8 were the lowest.Three isolates could infect all 11differentials.In Inner Mongolia,a total of 24 pathotypes were distinguished,among which two isolates defeated all 11R genes.The frequencies ofVir1,Vir2 andVir8 were the lowest.According to the results,potato cultivars carryingR1,R2 andR8 are recommended for these regions.

potato;Phytophthorainfestans; pathotype; differential

2013-04-27

：2013-06-18

公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)(3-20)

S 435.32

：ADOI：10.3969/j.issn.0529-1542.2014.02.029

致謝：感謝云南師范大學(xué)李燦輝老師提供的R1-R11的鑒別寄主。

* 通信作者 E-mail:ppguo@cau.edu.cn