何艷芳，郭學(xué)芬，王 軍

(1. 河南省新鄉(xiāng)市中心醫(yī)院，河南 新鄉(xiāng) 453000；2. 河南省輝縣婦幼保健院，河南 輝縣 453600；3. 徐州醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，江蘇 徐州 221000)

參麥對新生大鼠缺氧缺血性腦損傷的干預(yù)作用

何艷芳1，郭學(xué)芬2，王 軍3

(1. 河南省新鄉(xiāng)市中心醫(yī)院，河南 新鄉(xiāng) 453000；2. 河南省輝縣婦幼保健院，河南 輝縣 453600；3. 徐州醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，江蘇 徐州 221000)

目的 研究參麥注射液對新生大鼠缺氧缺血性腦損傷(HIBD)的干預(yù)作用。方法 建立新生鼠HIBD模型。免疫組化方法檢測缺氧缺血(HI)后2 h、12 h、24 h、3 d、7 d、14 d各時間點新生大鼠右側(cè)大腦海馬CA1區(qū)Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)情況。實驗各觀察點隨機分為假手術(shù)組(S組)、參麥注射液治療組(SM組)、生理鹽水對照組(C組)，每組9只。結(jié)果 HI后2 h，SM組、C組右側(cè)大腦海馬CA1區(qū)Bcl-2蛋白表達(dá)及Bax蛋白表達(dá)均已有升高，24 h達(dá)到高峰，14 d各組降到與SM組同一水平:SM組、C組在2 h、12 h、24 h、3 d、7 d點與S組比較均有顯著性差異，在14 d與S組比較無顯著性差異；SM組在24 h、3 d、7 d與C組比較，Bcl-2蛋白表達(dá)較C組高，在2 h、12 h、14 d點與C組比較無顯著性差異。SM組在12 h、24 h、3 d、7 d與C組比較，Bax蛋白表達(dá)較C組降低，在2 h、14 d與C組比較無顯著性差異。結(jié)論 參麥注射液可以提高抑制凋亡基因Bcl-2的表達(dá)及降低促凋亡基因Bax的表達(dá)。

參麥注射液；缺氧缺血性腦損傷；Bax；Bcl-2

本研究旨在探討參麥注射液對新生大鼠缺氧缺血(HI)后大腦海馬CA1區(qū)Bax、Bcl-2蛋白的干預(yù)作用。

1 實驗資料

1.1 動物 7 d齡新生SD大鼠(徐州醫(yī)學(xué)院院實驗動物中心提供),雌雄不限,體質(zhì)量12～16 g。

1.2 主要藥品、試劑以及主要儀器 8%O2、92%N2混合氣體(上海特種氣體廠)，參麥注射液(雅安三九藥業(yè)有限公司)，常壓缺氧艙(上海市兒科研究所)，兔抗Bcl-2抗體、兔抗Bax抗體、SP試劑盒、聯(lián)苯二胺顯示劑(DAB)、枸櫞酸鈉、磷酸鹽緩沖液均購自北京中山公司。

1.3 方法 將新生7 d SD大鼠參照Rice法,乙醚吸入麻醉后,結(jié)扎鼠右側(cè)頸總動脈,術(shù)畢2 h后置容器中持續(xù)吸入8%O2、92%N2混合氣體,流速2.0 L/min,以鈉石灰吸收CO2,持續(xù)2 h，建立HIBD模型。將HIBD模型大鼠隨機分為假手術(shù)組(S組)、參麥注射液治療組(SM)組、生理鹽水對照組(C組)，各9只。S組僅切開頸正中皮膚和分離右側(cè)頸正中動脈,不結(jié)扎,不缺氧。SM組于HI后即刻腹腔注射參麥注射液10 mL/kg,1次/d,在缺氧缺血后7 d內(nèi),按觀察時間連續(xù)用藥直至7 d。C組采用生理鹽水，用法用量同SM組。免疫組化方法檢測缺氧缺血(HI)后2 h、12 h、24 h、3 d、7 d、14 d各時間點新生大鼠右側(cè)大腦海馬CA1區(qū)Bax、Bcl-2蛋白的表達(dá)情況。將鼠以10%水合氯醛10 mL/kg腹腔注射麻醉，斷頭取腦，用4%多聚甲醛固定3 d，石蠟包埋，連續(xù)切片，按序間隔留片，并分別貼片后取其中Ⅰ～Ⅱ套留作免疫組化。切片用免疫組織化學(xué)染色(SP法)后，LEICA Qwin圖像處理與分析系統(tǒng)測定右腦海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)灰度值。

1.4 檢測指標(biāo) 切片用免疫組織化學(xué)染色(SP法)后,LEICA Qwin圖像處理與分析系統(tǒng)測定各組新生大鼠右海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)灰度值。

2 結(jié) 果

2.1 HI后各組大鼠海馬CA1區(qū)Bcl-2表達(dá)情況 見表1及圖1～6。

2.2 HI后各組大鼠海馬CA1區(qū)Bax表達(dá)情況 見表2及圖7～12。

表1 HI后各組大鼠右側(cè)海馬Bcl-2灰度值比較

注：①與S組比較,P<0.05;②與S組比較，P<0.01；③與C組比較，P<0.01。

圖1 HI后24 h假手術(shù)組新生大鼠海馬CA1區(qū)Bcl-2的表達(dá)

圖2 HI后24 h對照組新生大鼠海馬CA1區(qū)Bcl-2的表達(dá)

3 討 論

圖3 HI后24 h參麥組新生大鼠海馬CA1區(qū)Bcl-2的表達(dá)

圖4 HI后3 d假手術(shù)組新生大鼠海馬CA1區(qū)Bcl-2的表達(dá)

圖5 HI后3 d對照組新生大鼠海馬CA1區(qū)Bcl-2的表達(dá)

圖6 HI后3 d參麥組新生大鼠海馬CA1區(qū)Bcl-2的表達(dá)

組別2h12h24h3d7d14dS組5.53±0.635.32±0.875.09±1.165.40±1.025.39±0.905.4±0.86SM組7.78±1.06①16.72±1.39②③21.86±2.03②④15.3±1.34②④7.54±1.42①③5.6±1.27C組8.0±1.02①16.96±1.40②30.44±1.20②19.22±1.77②9.34±1.30①5.8±1.18

注：①與S組比較,P<0.05;②與S組比較，P<0.01；③與C組比較，P<0.05。

圖7 HI后24 h假手術(shù)組新生大鼠海馬CA1區(qū)Bax的表達(dá)

圖8 HI后24 h對照組新生大鼠海馬CA1區(qū)Bax的表達(dá)

圖9 HI后24 h參麥組新生大鼠海馬CA1區(qū)Bax的表達(dá)

圖10 HI后3 d假手術(shù)組新生大鼠海馬CA1區(qū)Bax的表達(dá)

圖11 HI后3 d對照組新生大鼠海馬CA1區(qū)Bax的表達(dá)

圖12 HI后3 d參麥組新生大鼠海馬CA1區(qū)Bax的表達(dá)

段濤等[1]研究表明，新生兒缺氧缺血性腦損傷后遲發(fā)性神經(jīng)元死亡的發(fā)生與細(xì)胞凋亡密切相關(guān),其機制極為復(fù)雜,可能涉及線粒體損傷導(dǎo)致的能量代謝障礙、氧自由基、損傷、細(xì)胞內(nèi)鈣超載、興奮性氨基酸及其受體毒性、體液因子、炎癥細(xì)胞和炎癥因子、細(xì)胞因子損傷等各個方面。參麥注射液組方源于《千金要方》之生脈散，是根據(jù)祖國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)的經(jīng)典方劑修正而成的復(fù)方制劑，已廣泛用于臨床。參麥注射液的有效成分是人參皂甙和人參多糖,具有清除氧自由基、抗脂質(zhì)過氧化、保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞作用,可擴張外周血管,增加冠脈血流量,提高心肌對缺氧、缺血的耐受性,減輕心肌缺血,縮小心肌梗死范圍,保護(hù)、修復(fù)心肌細(xì)胞[2]。俞銳敏等[3]

證實了不同劑量參麥注射液對機體的作用。結(jié)合預(yù)實驗及參麥注射液藥理研究結(jié)果，本實驗選用10mL/kg這一劑量。在細(xì)胞凋亡調(diào)控機制方面，Bcl-2家族是迄今為止研究得最深入，廣泛的凋亡調(diào)控基因之一[4]。Bcl-2作為一種廣義的抑制凋亡基因,其功能主要是抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞生存，它通過羧基端的信號錨定序列跨線粒體膜而發(fā)揮作用,在線粒體上可直接調(diào)節(jié)膜上通透性轉(zhuǎn)換孔來調(diào)節(jié)線粒體膜的通透性,以阻止細(xì)胞色素C釋放入胞質(zhì)而抑制細(xì)胞凋亡[5]。Bax基因亦為Bcl-2家族成員,結(jié)構(gòu)與Bcl-2有21%的相似性,其作用則與Bcl-2相反,活化的Bax可使線粒體和脂質(zhì)體通透性增加,啟動凋亡信號,具有促凋亡作用。而Bcl-2可抑制Bax的活化,從而抑制細(xì)胞凋亡。本實驗結(jié)果顯示：與生理鹽水對照組相比，參麥治療組大鼠海馬神經(jīng)元CA1區(qū)Bcl-2蛋白表達(dá)細(xì)胞數(shù)明顯增加，Bax蛋白表達(dá)細(xì)胞顯著減少，表明參麥注射液可能通過調(diào)節(jié)Bcl-2、Bax蛋白的表達(dá)抑制神經(jīng)凋亡。

[1] 段濤,陳超. 新生兒缺氧缺血性腦病(Ⅱ)[J]. 中華醫(yī)學(xué)雜志,2005,8(5):129-133

[2] 歐陽修河，尹睿，張穎. 參麥注射液對無創(chuàng)通氣治療慢性阻塞性肺病并嚴(yán)重呼吸衰竭的影響[J]. 中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，2006，26(7)：608-611

[3] 俞銳敏，熊愛華，楊欽河. 參麥注射液對大鼠急性心肌缺血及eNOSmRNA表達(dá)的影響[J]. 中國病理生理雜志，2006，22(6)：1083-1086

[4] 周斌，于博，姚南，等. 三七總皂甙對梗阻性黃疸肝組織中Bax，Bcl-2表達(dá)的影響及意義[J]. 第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，2006，27(19)：1765-1770

[5] 王漢民,吳雄飛,譚華等. 川芎嗪對缺血/再灌注損傷大鼠腎臟細(xì)胞凋亡及Bcl-2和Bax表達(dá)的影響[J]. 第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報,2006，27(20)：1884-1889

Effects of Shenmai injection on hypoxic-ischemic brain damage of neonatal rats

He Yanfang1, Guo Xuefeng2, Wang Jun3

(1.The Central Hospital of Xinxiang, Xinxiang 453000, Henan, China; 2.Matern and Child Health Care Hospital of Huixian County, Huixian, Henan, China 453600; 3.The First Affiliated Hospital of Xuzhou Medical College, Xuzhou, Jiangsu, China 221000)

Objective It is to investigate the intervention effect of Shenmai injection on neonatal rats with hypoxic-ischemic brain damage. Methods Neonatal rat models with HIBD were established. Immunohistochemistry was used to detect the expression of Bax and Bcl-2 in the hippocampal CA1 region of right brain in neonatal rats with HIBD at 2 h, 12 h, 24 h, 3 d, 7 d, 14 d after hypoxic-ischemic (HI) insult. Every observed spot was separated into three groups: sham operation (S), control group (C) and Shenmai injection treatment (SM). Results The expression of Bcl-2 in right hippocampal CA1 region in group SM, group C at 2 h after HI insults had already began to increase, peak at 24 h and then gradually decreased. The expression of Bcl-2 in right hippocampal CA1 region in every group had no difference at 14 d (P>0.05). The expression of Bcl-2 in right hippocampal CA1 region in group SM at 24 h, 3 d， 7 d was significantly more than that of group C(P<0.05,P<0.01). The expression of Bcl-2 in right hippocampal CA1 region in group SM and group C had no difference at 2 h, 12 h, 14 d (P>0.05). The expression of Bax in right hippocampal CA1 region in group SM, group C at 2 h after HI insults had already began to increase, peak at 24 h and then gradually decreased. The expression of Bax in right hippocampal CA1 region in every group had no difference at 14 d (P>0.05). The expression of Bax in right hippocampal CA1 region in group SM at 12 h, 24 h, 3 d, 7 d was significantly less than that of group C(P<0.05,P<0.01). The expression of Bax in right hippocampal CA1 region in group SM and group C had no difference at 2 h, 14 d(P>0.05). Conclusion Shenmai injection can significantly enhance the expression of Bcl-2 in right hippocampal CA1 region and decline the expression of Bax in right hippocampal CA1 region.

Shenmai injection; hypoxic-ischemia brain damage; Bax; Bcl-2

何艷芳，女，主治醫(yī)師，碩士，主要從事新生兒疾病的診治工作。

王軍，Tel：18052268109

10.3969/j.issn.1008-8849.2014.05.007

R-332

A

1008-8849(2014)05-0475-04

2013-05-10