潘銀平，閆 珍，潘 磊，陳培豐△

（1.浙江中醫(yī)藥大學第一臨床醫(yī)學院，浙江杭州310053；2.杭州市第二人民醫(yī)院，浙江杭州310015；3.浙江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院，浙江杭州310006）

惡性腫瘤最顯著的表型是腫瘤細胞的失控性生長及異常血管增生。傳統(tǒng)的手術、放療及化療主要是針對惡性腫瘤細胞的殺傷和控制，但要達到臨床治愈較困難。通過抑制腫瘤血管形成治愈腫瘤已成為可能[1]。目前抑制腫瘤血管生成已為探討中醫(yī)藥治療惡性腫瘤的作用機制提供了一個新思路[2]，深入開展相關研究對豐富中醫(yī)藥抗腫瘤理論，提高臨床療效，促進中醫(yī)藥現(xiàn)代化是一項有益的探索。清熱消積方是浙江省中醫(yī)院腫瘤科在長期的臨床實踐中逐漸積累的抗癌有效方劑，具有一定的臨床療效[3]。本實驗采用荷瘤Lewis 肺癌小鼠建立移植瘤模型觀察清熱消積方對腫瘤組織中缺氧誘導轉錄因子-1α（HIF-1α）蛋白表達的影響，探討該復方抑制腫瘤血管生成的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及瘤株

近交系C57BL/6J 純系小鼠，上海斯萊克動物有限責任公司提供，許可證號：SCXK（滬）2013-0003。在浙江中醫(yī)藥大學實驗動物中心SPF 級動物房適應性飼養(yǎng)7 d。Lewis 肺癌細胞株，購自中國科學院上海細胞生物學研究所。

1.2 實驗用藥

清熱消積方中蛇六谷、白花蛇舌草、半枝蓮、絞股藍、貓爪草、貓人參等采購自浙江省中醫(yī)院中藥房。設定中藥中劑量組作為臨床常用劑量，給藥劑量參照人鼠給藥劑量換算公式[4]方法計算：dB=dA×RB/RA×（WA/WB）1/3。式中：dB、dA 是AB 2 種動物的每kg 體質量劑量（mg/kg）；RB、RA 是動物體型系數(shù)，小鼠為59，人為100；WA、WB 是動物的體質量（kg）值。將該復方水煎、濃縮，制成高、低、中3 個劑量組（生藥量分別為1.12 g/mL，0.56 g/mL、0.28 g/mL）。環(huán)磷酰胺注射液（cyclophosphamide，0.2 g/支），江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司產(chǎn)品，國藥準字：H32020857；批號：12021725。

1.3 主要試劑與儀器

兔免疫組化試劑盒（美國Invitrogen 公司）；BCA蛋白定量試劑盒（普利萊基因技術有限公司）；RIPA裂解液（普利萊基因技術有限公司）；GL-400SD 超聲波細胞破碎儀（南京順流儀器有限公司）；ELX8000 全自動酶標儀（Bio-Tek，美國）；多功能真彩色細胞圖象分析管理系統(tǒng)（美國Media Cybernetics 公司Image-Pro Plus）；ECL 化學發(fā)光試劑盒（普利萊基因技術有限公司）。

1.4 方法

1.4.1 荷瘤小鼠造模、分組與用藥

在無菌條件下取接種Lewis 肺癌10 d 的C57BL/6J 荷瘤小鼠，脫頸椎處死，無菌條件下取皮下生長良好、呈魚肉狀的瘤組織，去除壞死部分，剪碎，按瘤重與生理鹽水1∶3 制成勻漿，200 目細胞篩過濾，得瘤細胞混懸液。1 500 r/min 離心5 min，加生理鹽水調至腫瘤細胞數(shù)約為1×107/mL。無菌條件下，75%酒精消毒小鼠右腋下皮膚，用1 mL 無菌注射器取細胞懸液0.2 mL（約含2×106個活細胞），無菌條件下接種于小鼠右腋窩皮下，拔出針頭，用無菌棉球輕壓針眼處片刻，防止細胞懸液流出。接種瘤細胞后，送回動物飼養(yǎng)室繼續(xù)飼養(yǎng)。

接種24 h 后，用隨機化數(shù)字表法將荷瘤小鼠分為5 組，分別為：荷瘤空白對照組（NS 組）；陽性對照組（CTX 組）；清熱消積方高、中、低劑量組；每組12 只小鼠。灌胃：第二天分組后稱體質量，即開始給藥，每日1 次，連續(xù)14 d。荷瘤空白對照組，清熱消積方高、中、低3 個劑量組按0.2 mL/10g 量分別胃飼生理鹽水、中藥水煎液。陽性對照組腹腔注射環(huán)磷酰胺，參照人鼠給藥劑量換算后按30 mg/kg（0.3 mg/10 g）作為一次用藥劑量，每周給藥2 次，實驗期間共給藥4 次。

1.4.2 檢測項目及方法

荷瘤小鼠瘤組織HIF-1α 蛋白表達：免疫組織化學法和免疫印跡法。

1.4.3 統(tǒng)計分析

采用SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件分析，計量資料均以（x±s）描述，2 組間比較采用配對t 檢驗，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 建立移植瘤模型

C57BL/6J 小鼠接種Lewis 肺癌細胞懸液7d 后在右腋皮下可觸摸到米粒大小結節(jié)，連續(xù)觀察12d，實驗小鼠接種部位皮下腫塊無自然消退現(xiàn)象，成瘤率100%，符合實驗要求。

2.2 對荷瘤小鼠腫瘤組織HIF-1α 蛋白表達的影響

經(jīng)免疫組化法測定，清熱消積方高、中、低劑量組、CTX 組均能下調荷瘤小鼠腫瘤組織HIF-1α 蛋白的表達。

數(shù)據(jù)經(jīng)統(tǒng)計學分析，清熱消積方高、中、低劑量組、CTX 組腫瘤組織平均光密度（MOD）值與NS 組比較均有差異（P＜0.05）；清熱消積方高、中、低劑量組之間的腫瘤組織MOD 值比較均無差異（P>0.05）；清熱消積方高、中、低劑量組與CTX 組腫瘤組織MOD 值兩兩比較均無差異（P>0.05）（表1）。

表1 各組荷瘤小鼠腫瘤組織HIF-1α 蛋白的表達（MOD）（x±s）

數(shù)據(jù)經(jīng)統(tǒng)計學分析，清熱消積方高、低劑量組、CTX 組腫瘤組織陽性細胞所占值（A%）與NS 組比較均有差異（P＜0.05）；清熱消積方各劑量組間的瘤組織陽性細胞所占值（A%）均無差異（P>0.05）（表2）。

表2 各組荷瘤小鼠腫瘤組織HIF-1α 蛋白的表達（A%）（x±s）

經(jīng)免疫印跡法測定，如下圖所示，β-actin 片段大小趨于一致，清晰且無雜帶。各組蛋白均有較強的actin 條帶出現(xiàn)，表明各組樣品的蛋白總濃度相近，且各組actin 條帶的亮度相似。而實驗組中，空白對照組HIF-1α 條帶較各治療組明顯增強，治療組中，CTX 組和中藥高、中劑量組條帶亮度趨于一致，中藥低劑量組條帶亮度較CTX 組增強，見圖1。

圖1 各組荷病小鼠腫瘤組織HIF-1 d 蛋白的表達

3 討論

缺氧是實體腫瘤的重要特征之一[5]。惡性腫瘤通過血管新生和增加糖酵解來不斷適應缺氧的微環(huán)境，繼而使腫瘤在缺氧條件下也可不斷生長、浸潤。HIF-1α 是廣泛存在的一種缺氧誘導因子，在正常氧分壓條件下它位于胞漿中，正常的細胞中不表達，在缺氧的條件下則可以進入到核內(nèi)發(fā)揮作用。所確定的受HIF-1α 調控的缺氧反應基因涉及參與腫瘤細胞的能量代謝、增殖、凋亡、轉移、耐藥及血管擴張、血管新生等多個方面[6-7]。由此可見，HIF-1α在腫瘤的惡性進展過程中起著關鍵性作用。有研究發(fā)現(xiàn)，HIF-1α 在肺癌中有過度表達，發(fā)揮著促進腫瘤血管生成、促進腫瘤細胞侵襲轉移和影響細胞凋亡等作用[8-10]。HIF-1α 在腫瘤中的重要作用是可調節(jié)VEGF 的轉錄，上調VEGF 的表達，誘導新生血管形成，導致惡性腫瘤的生長、侵襲及轉移[11-12]。HIF-1α 高表達的惡性腫瘤大多分化差、進展快、血管生成密度高、易發(fā)生轉移及復發(fā)、預后差。

清熱消積方是浙江省中醫(yī)院腫瘤科常用的抗癌復方，其中蛇六谷，性寒味辛，具有消腫散結、解毒止痛的功效；白花蛇舌草，性寒味苦，具有清熱解毒、利濕消腫的功效；半枝蓮，性寒味辛、苦，具有清熱解毒、化瘀利尿的功效；絞股藍，性微寒味甘，具有清熱解毒、止咳消痰、益氣健脾的功效；貓爪草，性微溫味甘、辛，具有化痰散結、解毒消腫的功效；貓人參，性涼味苦、澀，具有清熱解毒、消腫抗癌的功效。諸藥合用，體現(xiàn)了清熱解毒、化痰消積的治則，共除熱毒痰積，邪去而己自安。

我們前期研究發(fā)現(xiàn)[13]，清熱消積方對S180 癌細胞生長有抑制作用，抑瘤率達30.72%～40.75%，且與對照組的瘤重比較有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。還證實清熱消積方對VEGF、bFGF 等重要的腫瘤血管生成因子有降低其表達的作用。還能對Lewis 肺癌的CD44V6 表達具有調節(jié)作用[14]。并可抑制SPC-A-1人肺癌細胞和HUVEC 臍靜脈內(nèi)皮細胞的增殖、遷移、趨化和成管能力，從而抑制腫瘤細胞的侵襲、轉移和血管生成[15]。

本實驗在前期實驗的基礎上，采用免疫組織化學法和免疫印跡法觀察對荷瘤鼠腫瘤組織中HIF-1α 蛋白表達的影響。結果提示：清熱消積方的不同劑量組均能下調HIF-1α 蛋白的表達，并與對照組比較具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。表明清熱消積方下調腫瘤組織的HIF-1α 蛋白的表達可能是其抗腫瘤血管生成等作用機制之一。

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