羅燦蘭，田 虹，秦 偉，陳遠壽

(遵義醫(yī)學院 生理學教研室，貴州 遵義 563099)

血管性癡呆(vascular dementia,VD)是一種由出血、缺血、缺氧性腦血管病引起的以癡呆為主要表現(xiàn)的慢性漸進性智能障礙綜合征[1]。它嚴重影響人們的生活質(zhì)量，可VD造成的學習記憶功能障礙的具體機制還不十分明確，臨床上的治療方法目前效果欠佳。文獻發(fā)現(xiàn)，cAMP反應元件結(jié)合蛋白(CREB)活性的激活及變化與樹突棘的可塑性和學習記憶功能有關(guān)，而磷酸化CREB(pCREB)是CREB的活化形式，位其下游的大量基因如即刻早基因、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子等基因的轉(zhuǎn)錄均受其調(diào)節(jié)，也參與了神經(jīng)元生存過程，以及學習記憶等重要作用[2-3]。絞股藍能否通過改變pCREB的表達量來影響小鼠的學習記憶功能還未知。近來有研究報道，絞股藍總苷(Gprostemma Pentaphyllum Makino,GP)在缺血性腦損傷中能清除自由基、抗脂質(zhì)過氧化，抑制鈣超載、減輕線粒體損傷，建立腦動脈側(cè)支循環(huán)、增加腦血流量，增強神經(jīng)活性作用[4-5]，對血管性癡呆的空間記憶和長時程增強有改善作用[6]，顯示絞股藍總苷可能有神經(jīng)保護作用。我們先前的研究也證實絞股藍總苷可明顯改善VD小鼠的學習記憶能力[7-8]。然而絞股藍改善血管性癡呆所致的學習記憶功能障礙的具體機制目前尚不清楚。為此，本研究拷貝小鼠血管性癡呆模型，觀察血管性癡呆小鼠以及絞股藍治療的VD小鼠海馬神經(jīng)元損傷和海馬組織pCREB mRNA表達變化情況，以探討絞股藍改善血管性癡呆小鼠學習記憶功能及其可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑與儀器 絞股藍總皂苷(含量>90%)，購于東宇藥業(yè)有限公司；水合氯醛粉劑，中國醫(yī)藥集團上?；瘜W試劑公司提供；RNA抽提試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR用混合熒光引物，均由大連寶生物工程有限公司提供；蘇木精，成都貝斯特試劑有限公司提供。CM1800冰凍切片機，德國徠卡公司生產(chǎn)；熒光顯微鏡，日本Olympus生產(chǎn)；Icycler熒光定量PCR儀，美國BIO-RAD公司生產(chǎn)；Tu-1810紫外分光光度計，北京通用分析儀器公司生產(chǎn)；Centrifuge5415D離心機，德國Eppendof公司生產(chǎn)；BeckMAN coulTER離心機，美國貝克曼公司生產(chǎn)。

1.2 實驗動物與分組 C57BL/6G 清潔健康雄性小鼠90只，體重22～25g，5周齡，采購于重慶第三軍醫(yī)大野戰(zhàn)外科研究所醫(yī)學實驗動物中心，許可證號：SCXK-(軍)2002008。適應性喂養(yǎng)5 d后隨機將雄性C57BL小鼠80只分為5組：假手術(shù)組(Sham組)、血管性癡呆模型組(VD組)、血管性癡呆+絞股藍處理組(GP低、中、高劑量組)，每組16只。每組實驗動物又分24、72 h進行觀測。

1.3 制備血管性癡呆模型與給藥 運用反復夾阻小鼠2側(cè)頸總動脈致缺血-再灌注制作血管性癡呆模型。術(shù)前小鼠禁食8 h ，不禁水。腹腔注射10%水合氯醛0.35 mL/100g麻醉，仰臥位固定，備皮后消毒頸正中切口，小心地鈍性分離左、右側(cè)頸總動脈，避開頸動脈竇及神經(jīng)用小動脈夾夾雙側(cè)頸總動脈使頸總動脈阻閉，造成腦缺血10 min，放開動脈夾再灌注20 min，如此反復3次。術(shù)后保持室內(nèi)溫度26 ℃。假手術(shù)組小鼠同法麻醉后分離2側(cè)頸總動脈，僅穿線，不阻斷血流。

術(shù)前3 d及術(shù)后24、72 h的每天早晨分別給絞股藍處理組小鼠腹腔注射1次絞股藍皂苷稀釋液(低、中、高劑量：100、200、400 mg/kg) 。VD模型組及假手術(shù)組腹腔注射等容積生理鹽水，療程及次數(shù)與GP處理組相同。

1.4 腦組織HE染色 將小鼠稱重后予10%水合氯醛0.35 mL/100g腹腔注射麻醉，仰臥位固定，剪開上腹部并夾緊劍突向上翻，暴露及剪開胸腔隔膜，打開胸腔且暴露心臟。輕輕將注射器針頭從左心室插入主動脈，止血鉗固定針頭，剪開右心耳，先灌注0.9%生理鹽水50 mL，接著灌注4%多聚甲醛50 mL，見小鼠尾部變硬并翹起。迅速斷頭，小心地取出完整腦組織，放置于4%多聚甲醛進行后固定，4 ℃過夜，分別予4 ℃15%、30%蔗糖依次脫水，每次均沉底。將修飾好的腦組織放入卡諾氏固定液中固定后依次進行洗滌、脫水、透明、浸蠟、包埋、切片(組織厚6 μm)、貼片，烘干貼好組織的載玻片后進行脫蠟復水，蘇木精染色15 min后依次水洗、分色、漂洗、脫水、復染(0.5%伊紅乙醇)、再脫水、透明、封片。

1.5 pCREB表達的檢測

1.5.1 樣品采集與處理 小鼠斷頭處死后在冰盤上迅速取腦，取出左、右側(cè)完整海馬，將兩側(cè)海馬放于盛有0.5 mL trizol的EP管中，-80 ℃凍存。取50 mg凍存的海馬組織，依次進行解凍，勻漿，離心，萃取，沉淀，空干，提取出總RNA，紫外分光光度計測定總RNAA260/A280的值在1.8～2.0，說明RNA質(zhì)量好，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，-20 ℃保存?zhèn)溆?。RT-PCR反應測定海馬組織pCREB的含量。

1.5.2 pCREB mRNA的表達測定 環(huán)腺苷酸反應元件結(jié)合蛋白基因序列根據(jù)基因庫并用Primer 5.0分析軟件設計得到，再磷酸化成磷酸化環(huán)腺苷酸反應元件結(jié)合蛋白。用同一軟件設計內(nèi)參基因β-actin 與CREB。定量PCR 引物序列及反應條件(見表1)。運用RT-PCR 方法檢測海馬組織pCREB mRNA的表達水平。

表1基因引物序列及反應條件

基因名稱 引物序列 產(chǎn)物片段/bp退火溫度/ ℃β-actin上游 TGAGAGGGAAATCGTGCGTGAC下游 GCTCGTTGCCAATAGTGATGACC14957pCREB上游 TGGCTAACAATGGTACGGATGG下游 CTGGGCACTAGAATCTGCTGTCC13359

2 結(jié)果

2.1 絞股藍對血管性癡呆小鼠海馬神經(jīng)元損傷的影響 造模后72h海馬組織HE染色顯示，假手術(shù)組海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)細胞數(shù)目多，排列緊密、整齊，細胞結(jié)構(gòu)完整，細胞核為橢圓形或圓形(見圖1A)；血管性癡呆模型組海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)細胞多見片狀壞死，其數(shù)目減少明顯，細胞排列雜亂，細胞核邊界模糊、多固縮(見圖1B)；血管性癡呆+絞股藍低劑量處理組錐體神經(jīng)細胞數(shù)目稍多，層次排列整齊(見圖1C)；血管性癡呆+絞股藍中、高劑量處理組海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)細胞數(shù)目增多，少見明顯片狀壞死，細胞結(jié)構(gòu)較清晰、排列較緊密、整齊，少見細胞核固縮(見圖1D、E)。

注：A：假手術(shù)組；B：模型組；C～E：絞股藍處理組(低、中、高劑量組)；(HE×400)。圖1 絞股藍干預72h后對血管性癡呆小鼠海馬組織神經(jīng)元損傷的影響

2.2 海馬組織pCREBmRNA的表達情況 與假手術(shù)組比較，VD 模型組海馬組織 pCREBmRNA 的表達水平均顯著降低(P<0. 05)；與VD模型組相比，血管性癡呆+絞股藍低、中、高劑量處理組海馬組織pCREBmRNA 表達量均明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義 (P<0. 05) ；血管性癡呆+絞股藍低、中、高劑量處理組間差異無統(tǒng)學意義(P>0.05)，pCREBmRNA的表達量呈遞增趨勢(見表2) 。結(jié)果表明絞股藍總苷可使血管性癡呆小鼠海馬組織pCREB的表達量提高，并且在短期內(nèi)低、中、高劑量間無明顯量效關(guān)系。

組別 劑量(mg/kg)24h72h假手術(shù)組_1.58±0.041.66±0.04模型組_1.43±0.06*1.31±0.03*低劑量組1001.69±0.03#1.46±0.04#中劑量組2001.70±0.05#1.50±0.10#高劑量組4001.71±0.08# 1.51±0.32#

注：與假手術(shù)組比：*P< 0.05；與模型組比：#P< 0.05。

3 討論

反復腦缺血再灌注后，可誘導某些對缺血敏感的腦區(qū)神經(jīng)元細胞即早基因快速表達，從而導致神經(jīng)元細胞的凋亡，是造成血管性癡呆(VD)的主要原因之一。研究發(fā)現(xiàn)，海馬組織CA1區(qū)是缺血缺氧最為敏感的區(qū)域，最易發(fā)生神經(jīng)元選擇性遲發(fā)型死亡，而海馬區(qū)組織的神經(jīng)細胞凋亡會導致動物或患者的認知功能障礙，造成學習記憶減退，乃至發(fā)生癡呆[9-12]。本實驗采用c57BL6/G小鼠反復夾閉2側(cè)頸總動脈3次以拷貝VD模型，組織學結(jié)果發(fā)現(xiàn)，VD模型組小鼠海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元細胞數(shù)目明顯減少，呈片狀壞死，與文獻報道一致[1,11]。提示，反復腦缺血再灌注后海馬神經(jīng)元細胞死亡可能是小鼠發(fā)展成VD的原因之一。

本實驗結(jié)果顯示：與VD模型組小鼠比較，絞股藍處理組小鼠海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)細胞數(shù)目增多，細胞結(jié)構(gòu)較清晰、排列較緊密、整齊，少見細胞核固縮及細胞脫落壞死。結(jié)果表明，絞股藍對海馬神經(jīng)元損傷有保護作用。

為進一步研究絞股藍對神經(jīng)元損傷的保護機制，本實驗研究了與學習記憶相關(guān)的關(guān)鍵分子環(huán)磷酸腺苷反應元件結(jié)合蛋白(CREB)。早期研究發(fā)現(xiàn)缺失CREB的突變型小鼠空間學習記憶功能受損明顯[13]。而磷酸化的CREB(pCREB)才能與cAMP反應元件結(jié)合，誘導下游基因轉(zhuǎn)錄，參與神經(jīng)元的生長過程，對學習記憶有重要作用[2-3]。pCREB的水平變化可影響神經(jīng)元突觸的可塑性與學習記憶能力[2-3]。正常小鼠經(jīng)過水迷宮訓練后可提高學習能力，且測定海馬組織pCREB的含量增高[14]。本實驗結(jié)果顯示，VD 模型組海馬組織 pCREB mRNA 的表達水平比假手術(shù)組均顯著降低；絞股藍低、中、高劑量處理組海馬組織pCREB mRNA 表達量比VD模型組均明顯增加，差異顯著。本課題組先前的實驗證實，絞股藍可明顯改善VD小鼠的學習記憶能力[7]。提示，刺激VD小鼠海馬CREB的轉(zhuǎn)錄活性可能是絞股藍發(fā)揮神經(jīng)保護及其促進學習記憶作用的機制之一。

綜上所述，本實驗結(jié)果證實，絞股藍總皂苷可保護VD所致的小鼠海馬CA1錐體神經(jīng)元損傷，提高VD小鼠學習記憶能力，其機制可能與上調(diào)海馬CA1錐體神經(jīng)元pCREB mRNA 表達有關(guān)。這為探討絞股藍總皂苷的神經(jīng)保護作用和提高學習記憶能力的分子機制補充了新的實驗依據(jù)和思路。

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