劉 蜜， 王曉礽， 陶天琪， 徐菲菲， 劉秀華△， 史大卓

(1解放軍總醫(yī)院病理生理研究室，北京 100853; 2中國中醫(yī)科學院西苑醫(yī)院，北京 100091)

心肌細胞凋亡在缺血性心臟疾病中扮演著重要角色[1]。抑制心肌細胞凋亡可以改善心臟功能[2]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激(endoplasmic reticulum stress, ERS)相關細胞凋亡途徑是一種新提出的凋亡途徑，缺血[3-4]、缺氧/復氧[5]、缺血再灌注損傷[6]及壓力過負荷[7]等均可以激活ERS相關凋亡途徑。在哺乳動物中，ERS反應主要由3種主要的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜蛋白介導，分別是蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase, PERK)、活化轉(zhuǎn)錄因子6(activating transcription factor 6, ATF6)和需肌醇酶1(inositol-requiring enzyme 1, IRE1)。ERS的最初目的是降低未折疊蛋白水平及恢復細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)。然而，持續(xù)或嚴重的ERS激活促凋亡信號。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)主要伴侶分子葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucose-regulated protein 78, GRP78)與這3種感受器蛋白分離，導致其激活。其中PERK-真核起始因子2α(eukaryotic initiation factor 2α, eIF2α)-ATF4-C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein, CHOP)通路是最主要的一條信號通路。我們前期研究證實CHOP介導的ERS相關凋亡參與大鼠急性心肌梗死后非梗死區(qū)心肌細胞凋亡的發(fā)生[3]。

毒胡蘿卜素(thapsigargin, TG)是一種倍半萜內(nèi)酯，可通過抑制肌漿網(wǎng)/內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+-ATP酶擾亂內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)，導致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)Ca2+耗竭以及胞漿Ca2+濃度增加[8-10]。耗竭內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+能激發(fā)ERS，如果這種狀況持續(xù)存在，則能引起ERS相關凋亡[11]。

我們前期研究發(fā)現(xiàn)，西洋參莖葉總皂苷(Panaxquinquefoliumsaponin, PQS)可通過抑制ERS相關凋亡，減輕離體大鼠心肌細胞缺氧/復氧損傷[5]及大鼠缺血再灌注損傷[6]，并且PQS可通過抑制CHOP介導的ERS相關凋亡減輕AMI后心室重構[3]。然而，尚無PQS可以直接抑制TG誘導ERS相關細胞凋亡的報道。本研究采用TG誘導離體乳大鼠心肌細胞凋亡，并且進一步以RNA干擾(RNA interference, RNAi)方法敲低心肌細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)PERK基因，探討PQS抑制ERS相關凋亡的信號途徑。

材 料 和 方 法

1 材料

出生24 h內(nèi)清潔級Sprague-Dawley(SD)新生鼠由軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心提供；PQS粉由吉林省集安益盛藥業(yè)股份有限公司提供；DMEM培養(yǎng)基購自Gibco；新生牛血清 (newborn calf serum，NCS)購自杭州四季青公司；胰蛋白酶(trypsin)購自Amresco；青、鏈霉素混合抗生素購自Gibco；蛋白酶抑制劑和?；撬豳徸許igma；Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒購自南京凱基生物工程公司；Cell Counting Kit-8(CCK-8)購自Dojindo；蛋白電泳分子量(7～175 kD)標志物為Bio-Rad產(chǎn)品；兔抗人GRP78多克隆抗體、兔抗人鈣網(wǎng)蛋白(calreticulin,CRT)多克隆抗體購自Stressgen；兔抗人GAPDH單克隆抗體、小鼠抗人CHOP單克隆抗體、兔抗人Bax和Bcl-2多克隆抗體及兔抗人PERK、eIF2α和p-eIF2α多克隆抗體均購自Cell Signal Technology；增強化學發(fā)光試劑盒購自Millipore；兔抗人p-PERK、ATF4多克隆抗體和辣根過氧化酶標記山羊抗兔及山羊抗小鼠IgG 購自Santa Cruz。

2 乳鼠心肌細胞培養(yǎng)

采用本實驗室[14]方法，無菌操作取出生后24 h內(nèi)SD新生鼠心尖部組織，剪碎成1 mm×1 mm×1 mm大小，加入適量0.15%胰蛋白酶，37 ℃水浴下輕柔攪動、反復消化，制備心肌細胞懸液，差速貼壁。用含15%新生牛血清的DMEM培養(yǎng)液，調(diào)整細胞濃度為每瓶3×106個，接種于底面積為75 cm2的培養(yǎng)瓶，置CO2培養(yǎng)箱進行原代培養(yǎng)。

3 實驗分組

取原代培養(yǎng)心肌細胞，置于CO2培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)24 h，換無新生牛血清的DMEM 培養(yǎng)液同步化24 h后，根據(jù)預實驗結果，選取保護作用明顯的給藥濃度160 mg/L(終濃度)進行下列實驗。實驗分為以下5組：(1) 正常對照(control)組：細胞置于CO2培養(yǎng)箱37 ℃常規(guī)培養(yǎng)24 h至實驗結束；(2) TG組：培養(yǎng)液內(nèi)加入1 μmol/L TG，常規(guī)培養(yǎng)24 h至實驗結束；(3) PQS+TG組：在培養(yǎng)液中加入PQS，使終濃度160 mg/L，預處理24 h，之后處理同 (2) 組；(4)PERK敲低+TG組(si-PERK+TG)：針對rat PERK(NC_005103.3)設計并篩選出25 bp的穩(wěn)定型雙鏈小干擾RNA(stealth siRNA, stRNA)stPERK-1，以終濃度50 nmol/L轉(zhuǎn)染細胞，轉(zhuǎn)染方法按照Lipofectamine 2000(Invitrogen)說明書進行，轉(zhuǎn)染6 h后更換含10%新生牛血清的DMEM培養(yǎng)液，同時加入TG使其終濃度為1 μmol/L，常規(guī)培養(yǎng)24 h至實驗結束；(5) 隨機雙鏈RNA轉(zhuǎn)染對照+ TG組 (mock+TG)：隨機合成的雙鏈stealth siRNA 對細胞進行轉(zhuǎn)染6 h 后更換含10%新生牛血清的DMEM培養(yǎng)液，同時加入TG使其終濃度為1 μmol/L，常規(guī)培養(yǎng)24 h至實驗結束。

4 方法

4.1CCK-8法檢測細胞活力 以2×103cells/well的密度接種96孔板，每孔培養(yǎng)液體積100 μL，每組8個復孔，重復3次。實驗處理結束后加入10 μL CCK-8，以沒有接種細胞而加入等量培養(yǎng)液和CCK-8的孔作為對照。96孔板在培養(yǎng)箱培養(yǎng)3 h后以酶標儀在450 nm下檢測A值。

4.2Annexin V/PI雙標法檢測細胞凋亡 以1×104/cm2的密度接種細胞于60 mm培養(yǎng)皿，參照annexin V-FITC 凋亡檢測試劑盒說明書的方法進行檢測：實驗處理結束后以不含EDTA的0.25%胰酶消化并收集細胞，以0.01 mol/L PBS離心洗滌細胞2次，每次的離心條件為3 000 r/min × 30 s，洗滌后的沉淀以500 μL binding buffer懸浮均勻，分別加入5 μL annexin V和5 μL PI，充分混合均勻，室溫下避光孵育10 min后，以流式細胞儀(BD FACSVerse)檢測早期凋亡率和晚期凋亡率之和。

4.3Westernblotting按Liu等[15]報道方法提取心肌細胞總蛋白，BCA法蛋白定量后分裝，-80 ℃保存。取上述細胞蛋白提取液上清 (含蛋白80μg) 進行SDS-PAGE(12%分離膠，將電泳分離后的蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，用5%BSA封閉1h后分別加入GRP78、CRT、PERK、eIF2α、p-eIF2α、Bcl-2及Bax多克隆抗體(均為1∶500)、p-PERK多克隆抗體(1∶200)、CHOP單克隆抗體(1∶500)和GAPDH單克隆抗體(1∶1 000)4 ℃過夜孵育，用1×TBS-T洗膜后，以相應的Ⅱ抗孵育1.5h?；瘜W發(fā)光ECL顯示，采用Image-ProPlus4.1軟件分析蛋白條帶的積分吸光度值(integratedabsorbance, IA=平均吸光度值×面積)，以靶蛋白IA值/GAPDHIA值的比值反映靶蛋白水平。

5 統(tǒng)計學處理

數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，采用 SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件分析。單因素方差分析(one-way ANOVA)進行多組間比較，S-N-K法進行多組間兩兩比較。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 不同濃度PQS對TG誘導心肌細胞凋亡及細胞活力的影響

流式細胞術及CCK-8法檢測發(fā)現(xiàn)：與正常對照組比較，TG處理使心肌細胞凋亡率升高31.5%(P<0.05)，使心肌細胞活力降低69.2%；與TG組比較，PQS(40 mg/L、80 mg/L及160 mg/L)預處理及?；撬犷A處理可使心肌細胞凋亡率分別降低19.0%、35.2%、51.1%和54.4%(P<0.05)，使心肌細胞活力分別升高3.5%、15.4%、28.5%和32.6%(P<0.05),見圖1。

2 不同濃度PQS對TG誘導心肌細胞Bcl-2及 Bax表達比值的影響

Western blotting結果發(fā)現(xiàn)，與正常對照組比較，TG處理使心肌細胞Bcl-2與 Bax表達比值降低57.9%(P<0.05)；與TG組比較，PQS(40 mg/L、80 mg/L及160 mg/L)預處理及?；撬犷A處理可使心肌細胞Bcl-2/Bax升高9.8%、13.8%、82.7%和97.9%(P<0.05)，見圖2。

3 PQS及敲低PERK對TG誘導心肌細胞凋亡及細胞活力的影響

流式細胞術及CCK-8法檢測發(fā)現(xiàn)：與TG組比較，PQS預處理可使心肌細胞凋亡率降低36.2%(P<0.05)，使心肌細胞活力升高47.4%(P<0.05)，敲低PERK表達可使心肌細胞凋亡率降低45.2%(P<0.05)，使細胞活力升高63.7%(P<0.05)；與TG組比較，mock+TG組細胞凋亡率和細胞活力沒有明顯改變(P>0.05)。PQS預處理與PERK基因敲低對TG處理心肌細胞的保護作用無明顯差異(P>0.05)，見圖3。

4 PQS及敲低PERK對TG誘導心肌細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激分子表達的影響

Western blotting結果顯示，與control組比較，TG可使GRP78和CRT蛋白的表達分別升高4.9倍和4.2倍(P<0.05)；使PERK和eIF2α的磷酸化分別升高96.9%和82.9%(P< 0.05)；使ATF4和CHOP的蛋白表達分別升高8.7倍和3.1倍(P<0.05)。與TG組比較，PQS預處理可使GRP78、CRT蛋白表達分別降低75.5%和78.4%(P<0.05)；使PERK、eIF2α磷酸化分別降低36.4%和27.6%(P<0.05)；使ATF4和CHOP蛋白表達分別降低75.1%和60.6% (P<0.05)。與TG組比較，敲低PERK對GRP78和CRT蛋白表達均無顯著影響(P>0.05)；敲低PERK可使PERK和eIF2α蛋白磷酸化分別降低33.1%和28.3%(P<0.05)；敲低PERK可使ATF4和CHOP蛋白表達分別降低68.5%和32.0%(P<0.05)。與TG組比較，mock+TG組PERK及eIF2α蛋白磷酸化、GRP78、CRT、ATF4和CHOP蛋白表達沒有顯著改變(P<0.05)。PQS預處理與敲低PERK在降低PERK和eIF2α蛋白磷酸化以及ATF4和CHOP蛋白表達方面結果相似(P>0.05)，見圖4。

Figure 1. Effects of PQS on the apoptosis (A) and viability (B) of cardiomyocytes. Mean±SD. n=3.#P<0.05 vs control; *P<0.05 vs TG.

Figure 2. The effect of PQS on the expression of Bax and Bcl-2.Mean±SD.n=3.#P<0.05 vs control; *P<0.05 vs TG.

討 論

持續(xù)ERS時PERK磷酸化，依次磷酸化eIF2α，抑制多數(shù)蛋白質(zhì)合成，并激活ATF4[16]。這種ERS信號系統(tǒng)能誘導過表達的CHOP與其它轉(zhuǎn)錄因子結合，導致促凋亡基因表達[17-18]。CHOP介導的ERS相關凋亡參與了多種心血管疾病的發(fā)生發(fā)展[8, 19-21]。Zhang等[8]通過腹主動脈狹窄誘導高血壓心肌肥厚的大鼠模型，腹主動脈狹窄早期即可誘導內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶CRT表達增加，激活ERS的適應性途徑；后期可誘導ERS相關CHOP途徑，導致心肌細胞凋亡。本室前期工作證實[21]，TG可誘導心肌細胞的ERS反應，CRT、GRP78、ATF4和PERK表達升高：TG 1～10 nmol/L作用48 h和50 nmol/L作用12～36 h，可誘導Bcl-2/Bax比值代償性增加，具有細胞保護作用；TG 70～100 nmol/L作用48 h或50 nmol/L作用72 h則誘導過度ERS，導致CHOP表達增加和Bcl-2/Bax比值下降，觸發(fā)心肌細胞凋亡途徑，表明CHOP介導的ERS相關凋亡途徑參與了TG誘導的心肌細胞肥大過程。結合本室前期工作及文獻報道[12-13]，本研究采用1 μmol/L TG處理體外培養(yǎng)的乳大鼠心肌細胞24 h，與對照組比較，心肌細胞凋亡顯著增加，細胞活力明顯降低，且ERS分子GRP78蛋白表達、PERK磷酸化和CHOP蛋白表達顯著增加，抗凋亡蛋白Bcl-2與促凋亡蛋白Bax比值明顯降低，說明出現(xiàn)明顯ERS相關凋亡，和文獻[21]中TG的干預劑量和時間不同，但結果一致。

Figure 3. The effects of PQS and knockdown of PERK on the apoptosis (A) and viability (B) of cardiomyocytes. Mean±SD.n=3.#P<0.05 vs control; *P<0.05 vs TG；△P<0.05 vs mock+TG.

Figure 4. The effects of PQS and PERK knockdown on protein expression of ERS molecules in the cardiomycytes.Mean±SD.n=3.#P<0.05 vs control; *P<0.05 vs TG; △P<0.05 vs mock+TG.

Tsukano等[22]用0.1 μmol/L TG處理體外培養(yǎng)的大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元24 h，證明可誘導caspase-9及caspase-3的激活，導致細胞凋亡。Szegezdi等[23]用1.5 μmol/L TG處理PC12細胞24 h，結果表明可導致細胞凋亡，機制涉及caspase-12的激活及CHOP表達增加。進一步研究發(fā)現(xiàn)，TG誘導PC12細胞激活Bim，誘導Bax向線粒體轉(zhuǎn)位，導致線粒體釋放細胞色素C，激活caspase-3、caspase-7及caspase-9，最終誘導線粒體相關凋亡。

為了證實PQS可通過抑制ERS相關凋亡發(fā)揮心血管保護作用，本研究在TG誘導之前，用PQS預處理24 h，結果表明可顯著減輕TG誘導的細胞凋亡及細胞活力下降，且呈劑量依賴性地升高促凋亡蛋白Bax的表達，降低抗凋亡蛋白Bcl-2的表達。PQS 160 mg/L與ERS抑制劑?；撬嶙饔孟嗨?。本課題組前期工作發(fā)現(xiàn)[3,5]，PQS能劑量依賴性地降低心肌細胞缺氧/復氧損傷，并可通過抑制ERS相關凋亡減輕大鼠急性心肌梗死后心室重構，機制涉及PQS降低ERS分子GRP78、CRT、CHOP及Bax蛋白的表達，升高抗凋亡分子Bcl-2蛋白表達等方面。本研究結果PQS可抑制CHOP介導的ERS相關凋亡，與前期報道一致。

為進一步探討PQS抑制ERS相關凋亡的作用途徑，我們對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜蛋白PERK表達進行了干預。通過細胞轉(zhuǎn)染si-PERK敲低PERK表達，結果表明可顯著降低TG誘導的心肌細胞凋亡，升高細胞活力，抑制ERS分子PERK、eIF2α、ATF4和CHOP的翻譯，并可抑制PERK和eIF2α磷酸化，但對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)伴侶分子GRP78和CRT蛋白的水平無明顯影響，與文獻報道一致[22, 24]。PQS預處理組與敲低PERK組在心肌細胞凋亡、心肌細胞活力及ERS分子的表達方面均無顯著差異，PQS預處理可模擬敲低PERK對心肌細胞的保護作用。

綜上所述，本實驗證明PQS通過抑制過度ERS，發(fā)揮抗心肌細胞凋亡作用，其作用機制涉及PQS抑制PERK-eIF2α-ATF4-CHOP途徑,表現(xiàn)為PQS可以降低PERK及eIF2α的磷酸化水平，降低TG誘導的GRP78、CRT、ATF4和CHOP蛋白表達，從而減輕ERS凋亡通路激活。

[參 考 文 獻]

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