邢 進(jìn)，馮育芳，岳秉飛，賀爭鳴

(中國食品藥品檢定研究院 實驗動物資源研究所，北京 100050)

嗜肺巴斯德桿菌(Pasteurellapneumotropica, PP)是一種主要感染嚙齒類動物的條件致病菌。其主要存在于嚙齒類動物的上呼吸道、肺、消化道和泌尿道[1]。一般PP不會影響到免疫功能正常動物的健康，但是會引起免疫缺陷動物嚴(yán)重的肺炎，并可能導(dǎo)致死亡[2，3]。PP是實驗動物檢測國家標(biāo)準(zhǔn)[4]中SPF級動物必須要排除的病原菌之一。國家標(biāo)準(zhǔn)中對PP的檢測方法進(jìn)行了說明[5]。但是在實際的檢測工作中，巴斯德桿菌所屬的巴斯德菌科中，放線桿菌屬、嗜血桿菌屬以及巴斯德菌屬的很多菌株都會給鑒別造成困難，經(jīng)常會遇到難以鑒別的情況。本研究通過對PP的分離株的生化結(jié)果進(jìn)行分析，通過16S rDNA的測序?qū)Y(jié)果進(jìn)行驗證，改進(jìn)國家標(biāo)準(zhǔn)中的PP的生化鑒定項目，提高對PP檢測的準(zhǔn)確性。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌種：嗜肺巴斯德桿菌Heyl型ATCC12555和Jawetz型ATCC35149，購自美國ATCC。采用國家標(biāo)準(zhǔn)分離鑒定的306株P(guān)P分離株，小鼠258株，大鼠39株，豚鼠3株，沙鼠6株。

1.1.2 試劑：OXIOD哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基；BD革蘭氏陰性菌生化鑒定板，梅里埃氧化酶試劑；PP診斷血清由本實驗室制備。Qiagen DNA提取試劑盒；PCR和瓊脂糖電泳相關(guān)試劑購自寶生物工程(大連)公司。

1.1.3 主要儀器：上海安亭WGP-600隔水式恒溫培養(yǎng)箱，BD Phoenix100全自動細(xì)菌鑒定儀， ABI Verit PCR儀。

1. 2 方法

1.2.1 菌株鑒定：所有菌株接種于5%脫纖維羊血的哥倫比亞血瓊脂平皿，置37℃培養(yǎng)48 h。觀察菌落的大小、顏色、溶血特性等表型特征。

1.2.2 生化鑒定：所有菌株在血瓊脂平皿上37℃培養(yǎng)16 h，培養(yǎng)物用BD的革蘭氏陰性細(xì)菌鑒定板進(jìn)行生化鑒定，其生化項目與國家標(biāo)準(zhǔn)中的生化項目、菌落顏色、溶血特性合并組成表型譜，共53個特征數(shù)據(jù)，應(yīng)用Bionumerics 3.0軟件進(jìn)行聚類分析。

1.2.3 DNA測序：受試菌株基因組DNA用Qiagen提取試劑盒提取。參考Weiburg[6]的方法，對16S rDNA進(jìn)行擴(kuò)增，產(chǎn)物送上海生工測序，測序結(jié)果在NCBI中進(jìn)行Blast比對，取得16S rDNA鑒定結(jié)果。

1.2.4 生物型區(qū)分：Jawetz和Heyl型的鑒別參考Benga等[7]設(shè)計的多重PCR方法，針對巴斯德菌屬16S-23S間隔區(qū)，分別設(shè)計巴斯德菌屬，Jawetz型和Heyl型的特異性引物，見表1。對生化鑒定和測序結(jié)果為陽性的菌株進(jìn)行多重PCR，反應(yīng)體系為20 μL，其中10× buffer(含Mg2+)2 μL，dNTP(2.5 mM)1.6 μL，TaqHS酶(5 U/μL)0.2 μL，PastF、PastR和HeylR(均10 μmol/L)各0.5 μL，JawR(10 μmol/L)0.4 μL，菌株模板DNA 2 μL，ddH2O 12.3 μL。PCR擴(kuò)增條件為：95℃預(yù)變性5 min；94℃變性1 min, 58℃退火30 s, 72℃延伸30 s，30個循環(huán)；最后72℃ 延伸4 min。

表1 巴斯德菌屬，Jawetz型和Heyl型特異性引物

2 結(jié)果

2.1 菌株鑒定

2.1.1 生化和菌落特征鑒定:所有306菌株分離株按照國家標(biāo)準(zhǔn)鑒定符合PP陽性條件。其中輕微a溶血菌株有70株，用棉簽刮取菌落，顏色灰白色的有35株，黃色的有189株。使用BD自動細(xì)菌鑒定系統(tǒng)進(jìn)行再次鑒定，有164株鑒定為PP。

2.1.2 16 S rDNA測序鑒定:經(jīng)16S rDNA的測序，與NCBI上BLAST比對后又確定有63株為PP。結(jié)合菌落形態(tài)、生化反應(yīng)以及16S rDNA測序結(jié)果綜合分析，排除BD細(xì)菌鑒定儀鑒定結(jié)果中2株假陽性。在306株可疑PP分離株中共確定真陽性菌株227株。不同動物分離株生化和測序鑒定結(jié)果真陽性比例見表2。

表2 分離自不同動物嗜肺巴斯德桿菌生化鑒定和16S rDNA測序鑒定結(jié)果

227株真陽性菌株主要生化項目陽性率，見表3。其中國家標(biāo)準(zhǔn)中要求的幾項生化試驗：氧化酶、過氧化氫酶、硫化氫、硝酸鹽均為陽性，動力和明膠液化均為陰性，尿素陽性率95.2%，靛基質(zhì)陽性率5.3%。其中靛基質(zhì)為陽性的菌株以Jawetz生物型居多，占52.6%(10/19)，Heyl生物型只有21.1%(4/19)。在國家標(biāo)準(zhǔn)外的生化試驗：ONPG全部為陽性；麥芽糖、鼠李糖、山梨醇和七葉苷全部為陰性；另外磷酸鹽和醋酸鹽試驗陽性率分別為98.2%和1.3%。

在之前分離的306株菌株中，鑒定出與PP相似的菌株有產(chǎn)氣巴斯德桿菌(Pasteurellaaerogenes)22株、林氏放線桿菌(Actinobacilluslignieresii)15株和小鼠放線桿菌(Actinobacillusmuris)10株。

表3 227株嗜肺巴斯德桿菌主要生化反應(yīng)陽性率

1、17：100bp DNA marker；2～6：Jawetz型，分別為PP、PP、PP、PP、PP；7～11：Heyl型，分別為PP、PP、PP、PP、PP；12～16：其他(非Jawetz和Heyl型)，分別為PP、PP、PP、PP、PP；18：ATCC12555；19：ATCC35149；20：空白對照。

2.2 生物型和表型聚類分析

16S-23S rRNA間隔區(qū)PCR結(jié)果顯示，227株P(guān)P分離株中， Heyl型有184株，Jawetz型有24株，不能區(qū)分的有19株，見表4、圖1。根據(jù)表型特征聚類分析結(jié)果，在北京地區(qū)實驗動物中，Heyl生物型的污染占絕大多數(shù)，分離自16個來源，其以菌苔微黃為特征，并多伴有輕微的a溶血。其中有個分離源同時存在Jawetz型菌株的污染。

PP077和PP277的表型特征與標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC12555(Heyl型)的完全相同，先后分離自兩個不同的單位。結(jié)果中未發(fā)現(xiàn)與標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC35149(Jawetz型)表型相同的菌株，24株Jawetz型分離株與ATCC35149標(biāo)準(zhǔn)株的相似性僅有65%～74%。

表4 227株嗜肺巴斯德桿菌生物型

經(jīng)Bionumerics 3.0軟件分析，227株P(guān)P的表型特征共有140種，其中184株Heyl型有106種，24株Jawetz型有23種，19株不能確定生物型的菌株表型均不相同，但有8種與Heyl型相符，如圖2。

圖2 嗜肺巴斯德桿菌表型特征與生物型的分布

3 討論

本研究中，有4株分離株沒能復(fù)蘇成功，未能鑒定，其余菌株均獲得53項表型特征鑒定結(jié)果。結(jié)合生化反應(yīng)、表型特征、PCR和16S rDNA測序，最終確定PP的真陽性菌株比例74.2%。對受試菌株表型特征的聚類分析發(fā)現(xiàn)北京地區(qū)實驗動物中的PP表型豐富多樣，增加了常規(guī)分離鑒定的難度。

國家標(biāo)準(zhǔn)中的PP靛基質(zhì)給出的參考是陰陽性均有可能，本研究發(fā)現(xiàn)在北京地區(qū)分離到的菌株中，靛基質(zhì)陽性率僅為5.3%，以Jawetz生物型居多。提示在檢測中，當(dāng)其他生化項目相符時，靛基質(zhì)陽性、菌苔為灰白色的菌株應(yīng)考慮為PP的Jawetz生物型菌株。

由于目前國家標(biāo)準(zhǔn)中對PP的鑒定程序中的生化項目有限，血清凝集反應(yīng)也會存在假陽性，當(dāng)遇到菌落形態(tài)等表型特征與PP常接近的菌株時，容易造成與PP的混淆，造成假陽性的出現(xiàn)。因此有必要在檢測標(biāo)準(zhǔn)中增加生化鑒定項目，并引入分子生物學(xué)鑒定方法對檢測結(jié)果實施驗證。

16S rDNA的測序比對結(jié)果為Pasteurellaceaegen. sp. Forsyth A3的有33株，占比例較高，根據(jù)16S rDNA的聚類結(jié)果，其序列與PP標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC35149的相似性為30%左右，與ATCC12555的相似性為97%左右。序列的相似性表明這些菌株很可能是Heyl型嗜肺巴斯德桿菌的野生型菌株。此類菌株應(yīng)如何確定歸屬有待從微進(jìn)化角度進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)：

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[7] Benga L, Benten WP, Engelhardt E, et L. Development of a multiplex PCR assay based on the 16S-23S rRNA internal transcribed spacer for the detection and identification of rodentPasteurellaceae[J]. J Microbiol Methods. 2013, 95(2):256-261.