馮育芳, 邢 進, 付 瑞，鞏 薇，賀爭鳴，岳秉飛

(中國食品藥品檢定研究院實驗動物資源研究所，北京 100050)

樹鼩(tree shrew, Tupaia belangeri)，樹鼩科樹鼩屬的動物，其許多分子和細胞結(jié)構近似于人類，且對多種人類重要病毒易感，可作為重要人類病毒的動物模型[1]；同時其在腫瘤學、內(nèi)分泌學、神經(jīng)生物學、生殖生物學、免疫學等方面的作用也得到科研人員的肯定，因此，樹鼩作為一種新型的實驗動物資源正越來越受到重視[2, 3]。而微生物背景規(guī)范化檢測是樹鼩實驗動物化的必備條件之一[2, 3]。

巴爾通體(Bartonella)是巴爾通體病的病原體，已證實能感染多種溫血動物( 犬、嚙齒動物) 和冷血動物( 爬行類、兩棲類) 脊椎動物[4-6]。而且有研究報道云南鼠群中存在巴爾通體感染[8]。巴爾通體還可以通過白蛉、跳蚤、蜱、虱及恙螨等昆蟲媒介傳播給人，可引起人類卡瑞恩病、戰(zhàn)壕熱、貓抓病、心內(nèi)膜炎、菌血癥等疾病，是一種廣泛存在的人獸共患病原[5]。國內(nèi)外部分動物已要求檢測該菌。

1 材料和方法

1.1 菌株

伊麗莎白巴爾通體(B.elizabethae, 49227)，漢賽巴爾通體(B.henselae, 49882)和拉漢姆巴爾通體(B.grahamii, Birtles, 700132)購自ATCC，均為我國主要流行的巴爾通體菌株。用于特異性檢測菌株分別為：肺鏈(31210)，肺鏈(36001)，乙鏈(32310)，小鼠放線(49577)，支敗(19395)，支敗(58401)，嗜肺(12555)，嗜肺(35149)，多殺(43137)，鼠棒(65013)，李斯特(54004)，支原體(MP)和支原體(15531)，均由本實驗室保存鑒定。

1.2 引物設計

使用primer 5軟件在巴爾通體保守序列區(qū)共設計3對引物，分別為引物對1、引物對2和引物對3，詳細信息見表1；Oligo 6驗證可用，并委托Takara公司合成。

1.3 樣本采集及DNA提取

無菌采集樹鼩EDTA抗凝血，吸取300 μL用于提取DNA；對照菌株純培養(yǎng)后直接提取DNA，DNA提取使用Qiagen的Dneasy Blood & Tissue Kit (Cat. No.69504)，詳細操作根據(jù)產(chǎn)品說明書。

1.4 PCR擴增體系

PCR反應體系為50 μL，包括：10×buffer 5 μL, dNTP 4 μL, DEPC水 29.75 μL，引物各2.5 μL，Hs Taq酶2.5 μL，DNA 5 μL。通過實驗對PCR反應條件進行優(yōu)化，PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖電泳檢測，并送Takara公司進行序列測定。

1.5 特異性測定

將該理論擴增序列以及雙向引物與GenBank上的序列進行blast比對，確定是否為特異性片段。另取本室保存的菌種(肺鏈(31210)，肺鏈(36001)，乙鏈(32310)，小鼠放線(49577)，支敗(19395)，支敗(58401)，嗜肺(12555)，嗜肺(35149)，多殺(43137)，鼠棒(65013)，李斯特(54004)，支原體(MP)和支原體(15531))按上述方法提取DNA，進行PCR擴增，檢測不同細菌種間PCR擴增的特異性。

1.6 敏感性測定

對照菌株純培養(yǎng)后，按上述方法直接提取DNA，將提取的DNA倍比稀釋為20 μg/mL、2 μg/mL、2.0×10-1μg/mL、2.0×10-2μg/mL、2.0×10-3μg/mL、2.0×10-4μg/mL、2.0×10-5μg/mL、2.0×10-6μg/mL、2.0×10-7μg/mL、2.0×10-8μg/mL、2.0×10-9μg/mL、2.0×10-10μg/mL，用上述PCR方法進行測定，以確定其檢測閾值。

2 結(jié)果

2.1 檢測體系建立

為測試引物擴增效果及優(yōu)化反應條件，將購自ATCC的巴爾通體(49227，49882和700132)作為陽性對照模板，通過實驗對巴爾通體檢測的引物進行篩選，結(jié)果見圖1，引物對1特異性不好，出現(xiàn)了雜帶；引物對3敏感性差，擴增結(jié)果與目的片段長短不符合；而引物對2條帶清晰，無雜帶，與目的片段長短相符，測序結(jié)果證實為巴爾通體序列，最后確定引物對2為本實驗較為合適的檢測引物。

后通過溫度梯度實驗對PCR反應條件進行優(yōu)化，最后確定最適反應條件為94℃ 5 min；94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 1 min，重復35個循環(huán)；72℃ 7 min(圖1)。

表1 引物名稱、序列及擴增片段

圖1 PCR擴增結(jié)果

圖2 特異性試驗

2.2 特異性測定

圖2為特異性測定結(jié)果，1～13分別為肺鏈(31210)、肺鏈(36001)、乙鏈(32310)、小鼠放線(49577)、支敗(19395)、支敗(58401)、嗜肺(12555)、嗜肺(35149)、多殺(43137)、鼠棒(65013)、李斯特(54004)、支原體(MP)和支原體(15531)，P為陽性對照，漢賽巴爾通體(49882)，N為陰性對照。結(jié)果表明，只有陽性對照出現(xiàn)陽性條帶，即該PCR方法的特異性較高。

2.3 敏感性測定

為測定該PCR方法的敏感性，選取漢賽巴爾通體(49882)培養(yǎng)液DNA提取物，使用無RNA酶水做11個稀釋度，1～11為10倍系列稀釋結(jié)果，從圖3可見本實驗方法最高可檢測2.0×10-5μg/mL，靈敏度較好。

圖3 敏感性試驗

2.4 初步應用

從云南采集60份樹鼩血樣，提取DNA，并用優(yōu)化后的PCR方法擴增特異性片段，以檢測是否存在巴爾通體的感染。在這些樣品中，共檢出15個陽性標本(圖4)；陽性樣本送Takara公司進行測序，測序結(jié)果進行blast比對，顯示這些樣本均為巴爾通體陽性，充分驗證了本檢測方法的靈敏性和特異性。

圖4 樹鼩樣本巴爾通體檢測結(jié)果

3 討論

樹鼩作為近年來最有潛力的實驗動物之一，正在進行系統(tǒng)的實驗動物化工作[1-3]。云南是我國樹鼩資源最豐富的地區(qū)，也是樹鼩應用研究最發(fā)達的地區(qū)[2]。同時，云南也是我國最早進行巴爾通體系統(tǒng)研究的省份，為了解巴爾通體在云南省的流行情況，1999年10月云南省地方病防治所與美國疾病預防控制中心蟲媒傳染病部聯(lián)合在云南省的鼠群中開展調(diào)查，證實巴爾通體在云南人群和動物中普遍存在和廣泛流行[8-10]。為了解巴爾通體在云南樹鼩種群中的分布情況，本研究首先建立了一個巴爾通體PCR檢測方法，并進行了特異性和敏感性測試，結(jié)果證明該方法的可行性。

之前，大部分動物巴爾通體的調(diào)查研究使用的是培養(yǎng)方法[10]，該方法為細菌檢測的經(jīng)典方法，但操作繁瑣，靈敏性低，時效性差；近來，隨著分子生物學技術的普及，也有部分實驗使用了PCR方法[11, 12]，但由于巴爾通體的高度流行及基因型別的多樣性，有必要建立針對樹鼩種群的PCR檢測方法。

本實驗首次在云南來源樹鼩中檢出巴爾通體，提示樹鼩也存在巴爾通體的感染，而且相對其他動物，如姬鼠屬(Apodemus) (62.2%, 28/45)，家鼠屬(Rattus) (41.5%, 27/65), 絨鼠屬 (Eothenomys) (18.8%, 3/16)[6], 樹鼩巴爾通體屬于中等程度流行(25%, 15/60)，應該引起實驗動物科技界足夠的重視。

參考文獻：

[1] 黃曉燕, 徐娟, 孫曉梅，等. 樹鼩在人類疾病動物模型中應用研究進展[J]. 實驗動物科學 ISTIC. 2013, 30(2).頁碼

[2] 沈培清, 鄭紅, 劉汝文，等.中國樹鼩實驗動物化研究進展和展望[J]. 動物學研究. 2011, 32(1): 109-114.

[3] 角建林, 劉汝文, 陳麗玲，等. 樹鼩資源的開發(fā)利用與標準化研究——我國實驗動物資源建設發(fā)展戰(zhàn)略探討[J]. 中國比較醫(yī)學雜志. 2009, 19(7): 73-78.

[4] Tahar Kernif, Meriem Aissi, Salah-Eddine, et al. Molecular Evidence of Bartonella Infection in Demestic Dogs from Algeria, North Africa, by Polymerase Chain Reaction(PCR)[J]. Am.J Trop. Med. Hyg, 83(2), 2010, pp. 298-300.

[5] Jensen WA, Fall MZ, Rooney J, et al. Rapid identification and differentiation of bartonella species using a single-step PCR assay. J Clin Microbiol, May 2000, p. 1717-1722.

[6] 白文順, 夏春香, 楊亮宇，等.巴爾通體病研究進展[J]. 動物醫(yī)學進展，2006, 27(7): 20-23.

[7] 葉曦, 姚美琳, 李國偉. 巴爾通體的流行病學[J]. 中國病原生物學雜志， 2008, 3(6): 467-470.

[8] 白瑛. 首次證實巴爾通體在我國云南鼠群中流行[J]. 中國人獸共患病雜志，2002, 18(3): 5-9.

[9] 楊發(fā)蓮, 白鶴鳴, 楊慧，等.云南放牧人群漢賽巴爾通體感染的血清學調(diào)查[J]. 中國熱帶醫(yī)學， 2008, 8(6): 1011-1012.

[10] 栗冬梅, 俞東征, 劉起勇，等.云南省不同環(huán)境鼠形動物巴爾通體感染情況的研究[J]. 中華流行病學雜志，2005, 25(11): 934-937.

[11] 陳武, 蘇力, 彭仕明. 華南虎源血巴爾通體的 PCR 檢測[J]. 野生動物， 2010, 31(006): 301-304.

[12] 姚美琳, 羅煒, 李國偉，等.巴爾通體實時熒光定量 PCR 檢測方法的建立[J]. 中國熱帶醫(yī)學， 2009, 9(10): 1963-1965.