劉 旭，吳旭穎，王 宇，唐光毅，田玉書(shū)，吳金峰，張文明，楊志偉

(北京華阜康生物科技股份有限公司，北京 102200)

KK小鼠是由近藤恭司教授于1957年采用日本本土小鼠通過(guò)近交獲得的。西村正彥[1-2]教授在1967年將基因Ay導(dǎo)入KK小鼠體內(nèi)獲得KKAy小鼠，因?yàn)轶w毛呈黃色，也稱(chēng)為yellow KK。Ay突變基因?yàn)槊?，表現(xiàn)為黃色，不僅可以影響小鼠的毛色還可以引起代謝紊亂，與肥胖和糖尿病的發(fā)生有關(guān)。KKAy小鼠與正常小鼠相比表現(xiàn)為過(guò)量飲食、中度肥胖、高血糖、胰島素抵抗等代謝異常綜合征，接近于人類(lèi)Ⅱ型糖尿病早期病變的特征，是一種廣泛應(yīng)用于Ⅱ型糖尿病和肥胖研究的自發(fā)型動(dòng)物模型[3]。KK/Upj-Ay/J小鼠是KK自發(fā)糖尿病小鼠的突變同源近交系，于1998年從Jackson Laboratory引進(jìn)到國(guó)內(nèi)。經(jīng)過(guò)多代的繁育，飼養(yǎng)環(huán)境、營(yíng)養(yǎng)水平已經(jīng)發(fā)生了改變，有必要對(duì)該品系小鼠的相關(guān)生物學(xué)特征進(jìn)行驗(yàn)證和探討。因此我們對(duì)本公司5、10周齡KK/Upj-Ay/J小鼠的主要臟器重量、血液生理生化等指標(biāo)進(jìn)行了測(cè)定，為利用該品系進(jìn)行Ⅱ型糖尿病及肥胖癥研究提供一些基礎(chǔ)的生物學(xué)資料。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物來(lái)源

取SPF級(jí)KK/Upj-Ay/J小鼠5、10周齡各24只，雌雄各半，共計(jì)48只，均由北京華阜康生物科技股份有限公司提供，生產(chǎn)許可證號(hào)為：SCXK(京)2009-0004。該動(dòng)物實(shí)驗(yàn)于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所解剖實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)為：SYXK(京)2013-0019。

1.2 飼養(yǎng)管理及環(huán)境

實(shí)驗(yàn)KK/Upj-Ay/J小鼠均飼養(yǎng)在北京華阜康生物科技股份有限公司SPF車(chē)間的隔離環(huán)境(隔離器)內(nèi)，隔離環(huán)境的潔凈度為5級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，溫度控制在24±2℃，相對(duì)濕度50%±10%，換氣次數(shù)每小時(shí)為20次，明暗照明周期為12 h:12 h，動(dòng)物自由采食與飲水。

實(shí)驗(yàn)用料為北京華阜康生物科技股份有限公司生產(chǎn)的60Co輻射滅菌的鼠繁殖料1035(SCXK(京)2009-0008)。主要營(yíng)養(yǎng)指標(biāo)為：粗蛋白23.82%、粗脂肪5.16%、粗灰分7.19%、粗纖維4.62%、水分8.81%、鈣1.25%、磷0.97%、賴(lài)氨酸1.55%、蛋氨酸+胱氨酸0.91%。飲用水為酸化過(guò)濾自來(lái)水(ph=2.7～3.0)并經(jīng)121℃ 30 min高壓蒸汽滅菌。使用的籠具、水瓶、墊料等物品均經(jīng)過(guò)132℃ 30 min高壓蒸汽滅菌，每周更換一次墊料，進(jìn)出隔離器的物品均進(jìn)行消毒處理，嚴(yán)格遵守隔離系統(tǒng)操作規(guī)程。

1.3 儀器及試劑

法國(guó)ABX Pentra DX 120血細(xì)胞分析儀和配套試劑、日立7100全自動(dòng)生化分析儀和配套試劑、美國(guó)貝克曼Allegra 64R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 體重和臟器重量的測(cè)定

實(shí)驗(yàn)前禁食12 h，禁水1 h，用電子天平稱(chēng)取5、10周齡小鼠體重，眼眶采血后脫頸椎處死，立即剖取脾臟、肝臟、腎臟、心臟、肺臟、腦、胸腺，并用濾紙吸干組織表面的水分，稱(chēng)取重量。

1.4.2 血生理指標(biāo)測(cè)定

從小鼠眼眶后靜脈叢采血，取0.2 mL血液到EDTA2k抗凝管內(nèi)，進(jìn)行血生理測(cè)定。12項(xiàng)血生理指標(biāo)為：血紅蛋白(HGB)、紅細(xì)胞(RBC)計(jì)數(shù)、白細(xì)胞(WBC)計(jì)數(shù)、淋巴細(xì)胞(LYM)、血小板(PLT)、平均血小板體積(MPV)、血小板壓積(PCT)、紅細(xì)胞壓積(HCT)、平均紅細(xì)胞體積(MCV)、紅細(xì)胞平均血紅蛋白(MCH)、平均血紅蛋白濃度(MCHC)、紅細(xì)胞體積分布寬度(RDW)。

1.4.3 血生化指標(biāo)測(cè)定

將剩余的全血取0.8 mL到離心管內(nèi)，3000 r/min，離心10 min后取血清，進(jìn)行血生化測(cè)定。15項(xiàng)血清生化指標(biāo)為：總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、球蛋白(GLOB)、白蛋白/球蛋白(A/G)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、堿性磷酸酶(ALP)、血糖(GLU)、總膽固醇(CHO)、甘油三酯(TG)、總膽紅素(TBIL)、尿素氮(UN)、肌酐(CREA)、無(wú)機(jī)璘(P)、血鈣(Ca)。

1.5 結(jié)果處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS19.0進(jìn)行單因素方差分析，顯著水平為P< 0.05。

2 結(jié)果

2.1 KK/Upj-Ay/J小鼠臟器重量的測(cè)定結(jié)果

由表1可見(jiàn)，5周齡KK/Upj-Ay/J小鼠雌雄相比臟器重量沒(méi)有顯著性差異；10周齡KK/Upj-Ay/J雄鼠的雙腎、肝臟、心臟和胸腺重量高于雌鼠(P< 0.05)。10周齡雌鼠的體重、脾臟、雙腎、肝臟、心臟、肺臟和腦重量高于5周齡雌鼠(P< 0.05)； 10周齡雄鼠的體重、脾臟、雙腎、肝臟、心臟和肺臟重量高于5周齡雄鼠(P<0.05)。

2 KK/Upj-Ay/J小鼠血生理的測(cè)定結(jié)果

由表2可見(jiàn)，5周齡KK/Upj-Ay/J雄鼠的RLT高于雌鼠(P< 0.05)；10周齡KK/Upj-Ay/J雌鼠的WBC、HGB、MCV、MCH和LYM高于雄鼠(P< 0.05)。10周齡雌鼠的WBC、RBC、HGB、HCT和LYM高于5周齡雌鼠(P< 0.05)；10周齡雄鼠的RBC、MCV、MCH、RLT和LYM高于5周齡雄鼠(P< 0.05)。

表1 KK/Upj-Ay/J小鼠主要臟器重量(單位：g)

表2 KK/Upj-Ay/J小鼠血生理指標(biāo)

表3 KK/Upj-Ay/J小鼠血生化指標(biāo)

2.3 KK/Upj-Ay/J小鼠血生化的測(cè)定結(jié)果

由表3可見(jiàn)，5周齡KK/Upj-Ay/J雄鼠的CHO、Ca和P高于雌鼠，A/G值則低于雌鼠(P< 0.05)；10周齡KK/Upj-Ay/J雄鼠的GLOB、ALT和P高于雌鼠，ALB、A/G、CHO和CREA則低于雌鼠(P< 0.05)。10周齡雌鼠的ALB、A/G、CHO、TPIL和Ca高于5周齡雌鼠，GLOB、ALT、ALP、TG和P則低于5周齡雌鼠(P< 0.05)；10周齡雄鼠的GLU和TBIL高于5周齡雄鼠，CHO、TG和P則低于5周齡雄鼠(P< 0.05)。

3 討論

KK/Upj-Ay/J小鼠是KK自發(fā)糖尿病小鼠的突變同源近交系，基因型為Ay/a雜合子，毛色表現(xiàn)為黃色，眼為黑色；小鼠在8周齡左右出現(xiàn)高血糖，高胰島素和葡萄糖耐受不良等癥狀，出生后幾個(gè)月由于變得肥胖而不育。是一種廣泛應(yīng)用于肥胖和2型糖尿病研究的試驗(yàn)動(dòng)物模型。截止目前國(guó)內(nèi)外使用KKAy小鼠進(jìn)行Ⅱ型糖尿病和降血糖的研究很多，但對(duì)于KK/Upj-Ay/J小鼠的主要臟器，血生理生化等基本生物學(xué)特征的研究不多，而這些指標(biāo)又是利用該品系小鼠進(jìn)行科學(xué)研究的重要參考數(shù)據(jù)。

本研究選取5周齡青年小鼠和10周齡壯年小鼠進(jìn)行對(duì)比研究，避開(kāi)6～8周逐漸性成熟的不穩(wěn)定時(shí)期[4]。通過(guò)對(duì)5、10周齡的KK/Upj-Ay/J小鼠的主要臟器重量、12項(xiàng)血生理和15項(xiàng)血生化指標(biāo)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果表明：不同周齡和性別的KK/Upj-Ay/J小鼠在臟器重量和血生理生化上有差異性。可見(jiàn)周齡和性別對(duì)臟器和血生理生化是有一定影響的。

KK糖尿病小鼠是自發(fā)突變糖尿病模型，呈多基因遺傳性，KKAy源于KK鼠，因此KKAy小鼠的糖尿病遺傳背景也為多基因遺傳性疾病。研究表明，在普通飼養(yǎng)條件下只有約40%～50%的KKAy小鼠在8周齡左右出現(xiàn)高血糖、肥胖等糖尿病癥狀，但在飼喂高能量飲食的條件下有75%左右的KKAy小鼠發(fā)展為糖尿病[5]。例如飼喂KK/Upj-Ay/J小鼠KK鼠專(zhuān)用飼料，可以使KK鼠保持典型的模型特征(高血糖、高胰島素血癥、胰島素拮抗、過(guò)量飲食和肥胖等)[6]。這說(shuō)明遺傳因素控制著KK/Upj-Ay/J小鼠Ⅱ型糖尿病的發(fā)病，決定了該品系對(duì)Ⅱ型糖尿病的易感性，但飲食作為一個(gè)重要的環(huán)境因素在發(fā)病過(guò)程中也起著重要的作用[7-8]。通過(guò)把本研究的體重和血糖與其他研究比較分析發(fā)現(xiàn)，在10周齡時(shí)我們的KKAy小鼠體重略低[1,9-10]，這可能是由于飼喂飲食的能量值不同及未做禁食處理有關(guān)。相近周齡的空腹血糖值較相關(guān)報(bào)道略高[11]，根據(jù)空腹血糖≥7.0 mmol/L即判定為糖尿病發(fā)病的一般判定標(biāo)準(zhǔn)[7]，KK/Upj-Ay/J小鼠在10周齡時(shí)基本上出現(xiàn)糖尿病的癥狀。因此，本研究表明KK/Upj-Ay/J小鼠在10周齡左右出現(xiàn)高血糖癥狀，可以做為Ⅱ型糖尿病及肥胖癥的研究模型，配合高能量飲食飼喂可獲得更好的研究效果。

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