張洪川，徐艷梅，周 璞，孫建國(guó)，陳正堂

（第三軍醫(yī)大學(xué)附屬新橋醫(yī)院全軍腫瘤研究所，重慶 400037）

在世界范圍內(nèi)，肺癌為惡性腫瘤死亡的首要原因，非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）占所有肺癌的80%［1］。肺癌的病死率高主要原因是診斷時(shí)大部分肺癌已經(jīng)是晚期［2］，臨床診斷的時(shí)候，高達(dá)75%的肺癌已經(jīng)局部晚期和（或）遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移［3］。遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是晚期NSCLC治療失敗最常見(jiàn)的原因之一，大部分患者是死于轉(zhuǎn)移灶引起的相關(guān)并發(fā)癥。因此，找到一種簡(jiǎn)便、可靠的方法去監(jiān)測(cè)轉(zhuǎn)移是非常重要的。microRNA（miRNA）的發(fā)現(xiàn)打開(kāi)了分子標(biāo)志物的一個(gè)新領(lǐng)域。2008年首次發(fā)現(xiàn)外周血中富含大量的穩(wěn)定miRNA，這使在血漿中尋找腫瘤生物信號(hào)成為可能。miRNA可以以一個(gè)被保護(hù)的狀態(tài)存在于血漿中，因此可以直接從血漿中檢測(cè)到。Roth等［4］研究報(bào)道，肺癌患者血漿microRNA－141（miR－141）和 miR－155明顯高于良性患者，高水平miR－10b預(yù)示著淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移。這些數(shù)據(jù)顯示，某些血漿miRNA能夠預(yù)測(cè)肺癌的發(fā)展和預(yù)后。已有報(bào)道血尿中miR－125a－3p在健康人與系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）、乳腺癌等之間存在差異表達(dá)，然而在肺癌患者外周血中的表達(dá)情況還不清楚。用3種常用的生物信息學(xué)軟件TargetScan、PicTar和miRanda預(yù)測(cè)miR－125a－3p的靶基因，發(fā)現(xiàn)胰島素樣生長(zhǎng)因子2（insulin－like growthfactors 2，IGF2）在3種軟件中都能夠被預(yù)測(cè)到，而且，miR－125a－3p在IGF2的3′非編碼區(qū)（3′UTRs）有2個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，因此，IGF2 可能為miR－125a－3p的靶基因［5］。IGF2是一種重要的促胚胎細(xì)胞生長(zhǎng)因子，也是一種促有絲分裂肽，具有促進(jìn)細(xì)胞有絲分裂、胚胎形成、產(chǎn)后生長(zhǎng)發(fā)育等作用，生理?xiàng)l件下對(duì)胚胎的正常生長(zhǎng)發(fā)育有重要作用，病理?xiàng)l件下能刺激腫瘤細(xì)胞的增殖。目前，IGF2被認(rèn)為是多種腫瘤重要的自分泌生長(zhǎng)因子，其過(guò)度表達(dá)已被證實(shí)具有促進(jìn)細(xì)胞增殖及惡性轉(zhuǎn)化的作用［6］。本研究主要檢測(cè)血漿中 miR－125a－3p、IGF－2的表達(dá)水平，探討其在NSCLC侵襲轉(zhuǎn)移中的價(jià)值，研究二者表達(dá)之間的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集93例血漿標(biāo)本其中20例健康成人（健康對(duì)照組），男12例，女8例；年齡27～75歲，中位年齡59歲。73例NSCLC患者，均為初診患者，經(jīng)病理科診斷為NSCLC后入組，根據(jù)影像學(xué)資料進(jìn)行TNM分期。Ⅰ／Ⅱ期組33例，男18例，女15例；年齡36～78歲，中位年齡62歲；鱗癌15例，腺癌18例；其中，Ⅰ期19例，Ⅱ期14例。Ⅲ／Ⅳ期組40例，男21例，女19例；年齡37～82歲，中位年齡60歲；鱗癌14例，腺癌26例；其中，Ⅲ期13例，Ⅳ期27例。分期根據(jù)腫瘤分期系統(tǒng)（2009）。所有的血液標(biāo)本采用5mL乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝管收集，均在患者做手術(shù)和治療前收集。在2h內(nèi)將收集的血液標(biāo)本在4℃離心機(jī)中3000r／min離心15min。收集上清液立即儲(chǔ)存于－80℃保存。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì) 在http：∥www.mirbase.org網(wǎng)站查找人－miR－125a－3p、線蟲－miR－39序列并設(shè)計(jì)引物，引物合成由廣州銳博生物科技有限公司完成。

1.2.2 總RNA的提取 應(yīng)用Ambion mirVana PARIS試劑盒（Foster City，CA）提取600μL血漿樣品中的總RNA，首先加入600μL的10%十二烷基硫酸鈉（SDS）混勻在4℃條件下孵育1h對(duì)血漿樣品進(jìn)行預(yù)處理，為了控制樣本間提取效率的差異，在樣品加入變性液后加入25fmol人工合成的cel－miR－39進(jìn)行校正。隨后的總RNA提取步驟按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。最后用30μL無(wú)酶水洗脫離心柱得到總RNA。應(yīng)用分光光度計(jì)對(duì)RNA的純度和濃度進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.3 cDNA合成 取10μL總RNA使用PrimeScript RT reagent Kit Perfect Real time試劑盒（RR037A）進(jìn)行cDNA的合成。20μL反應(yīng)體系如下：10.0μL總RNA，5×PrimeScript Buffer（for real time）4.0μL，人－miR－125a－3PRT－prime 0.5 μL，線蟲－miR－39RT－prime 0.5μL，無(wú) RNA酶水4.0μL，PrimeScript Enzyme MixⅠ1μL。反應(yīng)條件為：42℃15min，85℃5s，之后保存于4℃。

1.2.4 實(shí)時(shí)定量－PCR（qRT－PCR）反應(yīng) 采用 Applied Biosystems（ABI7500高通量實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)），按照用戶手冊(cè)進(jìn)行操作。采用20μL的反應(yīng)體系，具體操作參照SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ的使用說(shuō)明。最終確定的反應(yīng)體系為20μL，包括cDNA 合成步驟的產(chǎn)物2.0μL，SYBR?Premix Ex Taq TMⅡ10.0μL，ROX Reference DyeⅡ0.4μL，正向、反向引物各0.8μL（10μmol／L），無(wú)RNA酶水6μL。反應(yīng)過(guò)程具體為：95℃預(yù)變性30s；95℃變性5s，60℃退火及延伸34s，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)；結(jié)束后通過(guò)95℃15s，60℃1min，85℃15s，60℃15s制作溶解曲線。每管設(shè)3個(gè)復(fù)孔，冰上避光操作。反應(yīng)結(jié)束后，系統(tǒng)自動(dòng)得出熔解曲線。各個(gè)組之間的 miR－125a－3p表達(dá)量用2－△△Ct表示。

1.2.5 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA） 優(yōu)爾生公司SEA051Hu 96T測(cè)定血漿IGF－2水平，嚴(yán)格按操作說(shuō)明書進(jìn)行。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。標(biāo)準(zhǔn)化對(duì)于miRNA的準(zhǔn)確定量是必不可少的，評(píng)估所有的miR－125a－3p的表達(dá)通過(guò)線蟲 miR－39來(lái)標(biāo)準(zhǔn)化，應(yīng)用2－△△Ct方法。根據(jù)Q－Q圖、偏峰度計(jì)算推斷數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布，數(shù)據(jù)均采用非參數(shù)檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)以中位數(shù)（25%百分位數(shù)至75%百分位數(shù)）表示。miR－125a－3p、IGF－2在2個(gè)獨(dú)立樣本組間表達(dá)差異使用 Mann－Whitney U 檢驗(yàn)，在3個(gè)獨(dú)立樣本組間使用Kruskall－Wallis檢驗(yàn)，應(yīng)用Spearman相關(guān)分析法分析 miR－125a－3p與IGF－2的相關(guān)性。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

從20例健康對(duì)照組、33例Ⅰ／Ⅱ期、40例Ⅲ／Ⅳ期NSCLC患者血漿中檢測(cè)了 miR－125a－3p、IGF－2的表達(dá)水平，本實(shí)驗(yàn)中得到的溶解曲線（圖1）表明qRT－PCR產(chǎn)物均具有特異性。

圖1 部分樣本的溶解曲線

表1 血漿miR－125a－3p水平與NSCLC臨床病理特征的關(guān)系

表2 血漿IGF－2水平與NSCLC臨床病理特征的關(guān)系

續(xù)表2 血漿IGF－2水平與NSCLC臨床病理特征的關(guān)系

2.1 血漿 miR－125a－3p、IGF－2的表達(dá)與 NSCLC臨床病理特征的關(guān)系 NSCLC血漿miR－125a－3p的表達(dá)與臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀況差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），與年齡、性別、分化程度、病理類型差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。NSCLC血漿IGF－2與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀況有關(guān)（P＜0.05），與年齡、性別、分化程度、病理類型、臨床分期無(wú)關(guān)（P＞0.05），見(jiàn)表1、2。

2.2 比較健康對(duì)照組、Ⅰ／Ⅱ期患者、Ⅲ／Ⅳ期患者血漿中miR－125a－3p水平 Kruskall－Wallis檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)3組存在差異（χ2＝13.449，P＝0.001），見(jiàn)圖2。進(jìn)一步比較兩兩之間的差異，發(fā)現(xiàn)健康對(duì)照組1.276（0.742～2.396）ng／mL較Ⅰ／Ⅱ期組1.231（0.756～1.957）ng／mL表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝0.776）。Ⅲ／Ⅳ期組0.666（0.407～1.098）ng／mL較健康對(duì)照組1.276（0.742～2.396）ng／mL低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝0.005）。Ⅲ／Ⅳ期組0.666（0.407～1.098）ng／mL較Ⅰ／Ⅱ期患者組1.231（0.756～1.957）ng／mL低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝0.001）。

圖2 miR－125a－3p的表對(duì)表達(dá)水平

2.3 比較血漿中IGF－2水平在健康對(duì)照組、Ⅰ／Ⅱ期組、Ⅳ期組之間的差異 Kruskall－Wallis檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)3組間存在差異（χ2＝7.147，P＝0.028）。進(jìn)一步比較兩兩之間的差異，Ⅰ／Ⅱ期組IGF－2水平969.680（837.558～1066.264）ng／mL、Ⅲ／Ⅳ期組1014.501（813.720～1172.469）ng／mL較健康對(duì)照組779.191（696.856～906.369）ng／mL高（P＝0.036、P＝0.011）。Ⅰ／Ⅱ期組與Ⅲ／Ⅳ期組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝0.451）。

2.4 血漿 miR－125a－3p與IGF－2相關(guān)性分析 血漿中 miR－125a－3p表達(dá)與IGF－2表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r＝－0.280，P＝0.007）。

3 討 論

miRNA在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因表達(dá)。原發(fā)腫瘤通過(guò)播散侵襲進(jìn)入周圍組織，以及轉(zhuǎn)移灶的生長(zhǎng)都需要一系列協(xié)調(diào)事件，包括原發(fā)腫瘤灶腫瘤細(xì)胞的分裂，進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)和遠(yuǎn)處病灶細(xì)胞的增殖。侵襲轉(zhuǎn)移需要的一系列步驟涉及許多基因表達(dá)的改變［7］。關(guān)于miRNA已有研究證實(shí)有幾個(gè)miRNA具有促進(jìn)或抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的潛能。如miRNA－183可以抑制肺癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力，可能為一種腫瘤轉(zhuǎn)移抑制因子［8］。miR－221、miR－222通過(guò)活化AKT通路促進(jìn)細(xì)胞的遷移［9］。目前，對(duì) miR－125a的研究主要集中在 miR－125a－5p，大量的研究表明miR－125a－5p在肺癌中低表達(dá)，并且可抑制細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的作用，現(xiàn)有報(bào)道表明mir－125a的另一成熟體miR－125a－3p在腫瘤中的作用也不容忽視［10］。已有研究證實(shí) miR－125a－5p、miR－125a－3p都與 NSCLC侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。miR－125a－3p的表達(dá)與臨床分期及淋巴轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)，miR－125a－3p在分期越晚、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的肺癌組織越低。在肺癌細(xì)胞株中的體外研究揭示 miR－125a－3p可抑制細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移［8］。miR－125a－3p在胃癌組織比正常組織表達(dá)低，與轉(zhuǎn)移、預(yù)后密切相關(guān)。有淋巴轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的胃癌組織較沒(méi)有轉(zhuǎn)移的胃癌組織miR－125a－3p表達(dá)更低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。體外研究證實(shí)miR－125a－3p具有抑制胃癌侵襲轉(zhuǎn)移的作用［10］。最近的報(bào)道顯示，miR－125－3p通過(guò)靶向Fyn減少細(xì)胞擴(kuò)增和遷移。miR－125a－3p過(guò)表達(dá)降低了FAK、paxillin和Akt的活性，阻斷了細(xì)胞周期，破壞了細(xì)胞的生存和遷移能力［11］。miR－125a－3p在高轉(zhuǎn)移人肺大細(xì)胞癌細(xì)胞株L9981中的表達(dá)水平明顯低于在低轉(zhuǎn)移人肺大細(xì)胞癌細(xì)胞株NL9980，提示miR－125a－3p可能具有抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的作用［12］。總之，越來(lái)越多的證據(jù)表明miR－125a－3p具有抑制腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的能力。

本文對(duì)miR－125a－3p及其潛在的靶基因產(chǎn)物IGF－2的表達(dá)進(jìn)行探索。miR－125a－3p在NSCLC外周血中的表達(dá)健康對(duì)照組與Ⅰ／Ⅱ期組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），表明miR－125a－3p不能作為NSCLC的早期篩查指標(biāo)；但在TMN分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況中發(fā)現(xiàn)了統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，這可能與miR－125a－3p的功能相關(guān)，miR－125a－3p主要抑制細(xì)胞的遷移能力，抑制腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移，過(guò)表達(dá)miR－125a－3p可以抑制細(xì)胞的侵襲遷移能力，低表達(dá)的miR－125a－3p可能作為肺癌侵襲轉(zhuǎn)移的一個(gè)潛在標(biāo)志物。有研究已證實(shí)IGF－2高表達(dá)與前列腺癌、直腸癌等多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，IGF－2在NSCLC組織中高表達(dá)，而且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)［13］。血清IGF－2在NSCLC及小細(xì)胞肺癌中較健康對(duì)照組高表達(dá)［14］。本研究發(fā)現(xiàn)IGF－2在NSCLC患者血漿中高表達(dá)，而且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀況相關(guān)。miR－125a－3p可能負(fù)調(diào)控IGF－2的表達(dá)，具體機(jī)制還不明確，本研究發(fā)現(xiàn)了這一相關(guān)性，需后期的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)去進(jìn)一步驗(yàn)證。

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