朱 峰，張 艷，李 軍，賈安奎，艾 芳，劉 沛，張會清△

（1.新鄉(xiāng)醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院泌尿外科，河南衛(wèi)輝 453100；2.新鄉(xiāng)醫(yī)學院第三附屬醫(yī)院泌尿外科，河南新鄉(xiāng) 453001；3.新鄉(xiāng)醫(yī)學院生理學教研室，河南新鄉(xiāng) 453001）

膀胱腫瘤是泌尿外科最常見的腫瘤，高復發(fā)率是其特征之一［1］，故術后監(jiān)測為其有效治療、改善預后和提高長期生存率的重要環(huán)節(jié)。目前，膀胱鏡檢查及尿細胞學檢查仍是長期隨訪的金標準［2］。尿細胞學檢查雖為無創(chuàng)且特異度較好，但敏感度較低，尤其是對低分級分期的腫瘤。膀胱鏡檢查目前診斷效能最佳，但其缺點為侵入性檢查，具有一定痛苦，患者長期依從性差。因此，尋找非侵入性、特異度和敏感度均佳的膀胱腫瘤標志物，對腫瘤復發(fā)監(jiān)測具有重要的臨床價值。作者通過聯合檢測尿核基質蛋白22（nuclear matrix protein 22，NMP22）和細胞角蛋白20（cytokeratin 20，CK20），探討二者在膀胱腫瘤復發(fā)監(jiān)測中的臨床應用價值，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 在排除合并泌尿系感染、結石、異物、腸道代膀胱、其他泌尿系腫瘤及近2周內曾行泌尿系器械操作和膀胱灌注患者［3］后，將新鄉(xiāng)醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院2007年9月至2009年8月常規(guī)復查的膀胱尿路上皮癌術后復查患者112例納入研究，以膀胱鏡檢及病理學檢查為金標準，分成復發(fā)組和未復發(fā)組。（1）復發(fā)組：46例，男38例，女8例，年齡21～91歲，平均61.8歲。確診為復發(fā)后均行手術治療，術后經病理科核實為膀胱尿路上皮癌。病理分級按照WHO標準：G124例，G215例，G37例；臨床分期按國際抗癌聯盟TNM標準：Tis～T131例，T2～T415例。（2）未復發(fā)組：66例，男54例，女12例，年齡23～81歲，平均60.4歲。（3）另將健康志愿者40名作為健康對照組納入研究。

1.2 試劑與儀器

1.2.1 主要試劑 NMP22試劑盒（R＆D），總RNA提取試劑盒及PCR試劑盒（TransGen），RNA later保存液（Ambion）。采用Primer Premer軟件自行設計引物，引物序列如下：CK20外引物，正向引物：5′－TCT TTG ATG ACC TAA CCC TAC－3′；反向引物：5′－TTT CTT CCA CCT CTT TGA CT－3′，產物大小732bp；內引物，正向引物：5′－TCC CAG AGC CTT GAG ATA GA－3′；反向引物：5′－GAC TTC AGA TGA CAC GAC CTT－3′，產物大小375bp；β－actin引物，正向引物：5′－CTG GGA CGA CAT GGA GAA AA－3′；反向引物：5′－AAG GAA GGC TGG AAG AGT GC－3′，產物大小564bp。

1.2.2 主要儀器 全波長掃描酶標儀（美國Thermo Scientific Multiskan Spectrum型），高速低溫離心機（美國Thermo Scientific CL31R型），PCR儀（美國 Applied Biosystems），電泳儀（中國北京市六一儀器廠DYY－6C型）。

1.3 方法

1.3.1 標本收集與保存 收集膀胱鏡檢前復查患者和健康志愿者清潔中段晨尿約200mL，分為2份。5mL離心（1000 r／min，10min），取上清液1mL置于1.5mL EP管中，迅速置入－80℃冰箱中保存，用酶聯免疫吸附實驗（ELISA）法檢測NMP22；其余尿液低溫離心（4℃，3000r／min，20min）得到尿脫落細胞，RNA later保存液懸起后轉入2mL凍存管，置室溫1h后保存于－20℃冰箱中（仍保持液態(tài)），用于檢測CK20 mRNA的表達。

1.3.2 NMP22檢測 采用ELISA法定量檢測尿NMP22，實驗步驟完全按照試劑盒說明書進行，建立標準曲線（圖1）計算出對應的NMP22含量，以6U／L為診斷腫瘤復發(fā)的臨界值。

1.3.3 CK20mRNA檢測 將RNA later保存液低溫離心后，留取沉淀，提取總RNA。用紫外分光光度計測定總RNA深度和純度，OD260／OD280在1.6～2.0之間，并用0.8%瓊脂糖凝膠檢測其完整性，清楚地顯示出3條28、18、5s的條帶。取總RNA 8μL，按試劑盒中說明配成20μL體系。短暫離心后放PCR儀上42℃孵育30min，85℃加熱5min得cDNA。取2μL cDNA進行后續(xù)巢式PCR反應，第一次PCR反應體系為50μL；引物為CK20外引物；反應條件為94℃預變性2min；94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸2min，共20個循環(huán)；72℃總延伸6min。第二次PCR及內參PCR的反應體系及反應條件基本同第一次，引物分別為CK20內引物、β－actin引物，共30個循環(huán)。取5μL擴增產物在2%瓊脂糖凝膠中電泳，電壓4～10V／cm，電泳20～30min，在紫外線投射儀下觀察電泳條帶并照相。

1.4 結果判斷 尿NMP22臨界值為6U／L，小于6U／L為陰性表達，反之為陽性表達。尿脫落細胞RNA檢測以內參βactin電泳出現564bp條帶證明上皮細胞的存在和RNA的穩(wěn)定性；以同時出現375bp條帶和564bp內參電泳條帶為CK20mRNA陽性，僅出現564bp內參電泳條帶為CK20mRNA陰性，兩條帶均不出現者視為RNA降解，棄去不用。聯合檢測CK20mRNA與NMP22時一項或兩項為陽性時計為陽性，兩項同時陰性時計為陰性。

1.5 統計學處理 采用SPSS13.0軟件進行統計學處理，率的比較采用χ2檢驗或Fisher精確概率法檢驗分析。NMP22、CK20單獨、聯合二者檢測與病理診斷進行一致性檢驗（Kappa值），同時考查其敏感度、特異度、陽性預測率、陰性預測率和Youden指數。檢驗水準α＝0.05，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 NMP22和CK20mRNA在復發(fā)組、未復發(fā)組及健康對照組中的表達 健康對照組尿中NMP22和CK20mRNA表達均為陰性，復發(fā)組尿中NMP22和CK20mRNA的陽性表達率分別為78.3%（36／46）、80.4%（37／46），未復發(fā)組 NMP22和CK20mRNA的陽性表達率均為6.1%（4／62），復發(fā)組陽性表達率明顯高于未復發(fā)組，差異有統計學意義（P＜0.05）；未復發(fā)組與健康對照組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。

2.2 NMP22和CK20mRNA在復發(fā)膀胱腫瘤尿液中的表達與臨床病理特征之間的關系 NMP22的表達與病理學分級和臨床分期有關（P＜0.05），而與年齡、性別、腫瘤直徑、腫瘤數目無關（P＞0.05）。CK20mRNA的表達與腫瘤數目有關（P＜0.05），而與年齡、性別、腫瘤直徑、病理學分級和臨床分期無關（P＞0.05），見表1。

2.3 NMP22、CK20mRNA單獨檢測與聯合檢測在膀胱腫瘤復發(fā)中的意義 NMP22監(jiān)測膀胱腫瘤復發(fā)的敏感度、特異度、陽性預測值、陰性預測值和Youden指數與臨床診斷一致性檢驗的Kappa值為0.75（P＜0.05）；CK20mRNA監(jiān)測膀胱腫瘤復發(fā)的敏感度、特異度、陽性預測值、陰性預測值和Youden指數與臨床診斷一致性檢驗的Kappa值為0.77（P＜0.05）；聯合CK20與NMP22監(jiān)測膀胱腫瘤復發(fā)的敏感度、特異度、陽性預測值、陰性預測值和Youden指數與臨床診斷一致性檢驗的Kappa值為0.88（P＜0.05）。NMP22、CK20mRNA單獨檢測與聯合檢測靈敏度比較，差異有統計學意義（P＜0.05），見表2。

表1 尿CK20mRNA、NMP22在復發(fā)膀胱腫瘤中的表達與臨床病理特征之間的關系

表2 NMP22、CK20mRNA單獨監(jiān)測與聯合監(jiān)測膀胱腫瘤復發(fā)的敏感度、特異度、陽性預測值、陰性預測值和Youden指數（%）

3 討 論

3.1 NMP22檢測在膀胱腫瘤復發(fā)監(jiān)測中的價值 人上皮細胞中發(fā)現的NMP22屬于核基質蛋白家族中的一種，于1980年由Lydersen等［4］首次發(fā)現并命名，其主要功能為協調細胞增殖核有絲分裂期間遺傳物質正確、均等地分配到子代細胞。NMP22多分布于細胞有絲分裂較為活躍的組織，而惡變時細胞有絲分裂極度活躍。國外研究發(fā)現，NMP22檢測在膀胱腫瘤的檢測中具有高效、快捷等優(yōu)點，且具有較高的敏感及特異度［5－6］；Kehinde等［7］認為 NMP22監(jiān)測可作為膀胱腫瘤或高度懷疑膀胱腫瘤患者早期監(jiān)測的金標準。研究發(fā)現，NMP22在膀胱復發(fā)腫瘤中的檢測相對于尿脫落細胞學檢測具有較高的敏感度及特異度，且對于膀胱腫瘤復發(fā)的預測具有明顯優(yōu)勢［8］。Smrkolj等［9］研究認為，NMP22的檢測相對尿細胞學檢測具有較高的敏感度，但特異度稍低，不能作為替代膀胱腫瘤患者術后的膀胱鏡檢查。Shariat等［10］研究認為，NMP22監(jiān)測不能替代膀胱鏡檢查，但可以幫助判斷哪些患者需要行膀胱鏡檢查，有效地減少膀胱鏡檢查次數。另有研究表明，膀胱腫瘤術后隨訪膀胱鏡檢查陰性而尿NMP22檢測陽性的患者，有高復發(fā)風險，應加強術后監(jiān)測隨訪［11］。本研究表明，NMP22在復發(fā)組中的表達率明顯高于未復發(fā)組及健康對照組（P＜0.05）；在復發(fā)膀胱腫瘤尿液中，NMP22表達率與性別、年齡、腫瘤直徑、腫瘤數目無關（P＞0.05），與腫瘤細胞的分化和進展程度有密切關系。從低級別、非浸潤性腫瘤到高級別、浸潤性腫瘤的發(fā)展中，NMP22的表達逐漸增強。

3.2 CK20mRNA檢測在膀胱腫瘤復發(fā)監(jiān)測中的價值 CK由角蛋白基因編碼、分布于外胚層起源細胞中，是上皮細胞發(fā)生、分化、成熟過程中逐漸形成的，是所有哺乳類動物細胞骨架的中間絲之一，參與構成細胞骨架。CK20由Keesee等［12］于1990年發(fā)現，含424個氨基酸，相對分子質量為48.5×103，等電點為5.66，屬酸性CK。CK20的分布特點和表達方式，使其應用于膀胱腫瘤的病理分型、組織來源鑒別和轉移的監(jiān)測［13］。本研究顯示，CK20mRNA在監(jiān)測腫瘤復發(fā)中有較高的敏感度和特異度，可以作為膀胱腫瘤復發(fā)的指標，而且其敏感度在低級別非浸潤性復發(fā)腫瘤與高級別浸潤性復發(fā)之間差異無統計學意義（P＞0.05），有利于復發(fā)腫瘤的早期檢出，CK20mRNA陽性還提示復發(fā)腫瘤為多發(fā)的可能性，在膀胱鏡檢查中應注意觀察，減少漏診概率，這與Eissa等［14－15］研究結論一致。

3.3 聯合檢測NMP22與CK20mRNA在膀胱腫瘤復發(fā)監(jiān)測中的價值 隨著新型膀胱腫瘤瘤標志物的不斷出現，幾種腫瘤標志物的合理聯合應用成為診斷膀胱腫瘤的有效工具［16］。本課題考慮到CK20mRNA位于完整脫落細胞內，可通過尿液離心獲得尿脫落細胞，而NMP22是脫落細胞凋亡后細胞核裂解釋放于尿液中的可溶性蛋白，可直接檢測尿液。這樣既檢測了完整的脫落細胞，又檢測了凋亡的脫落細胞，二者聯合應用具有互補性。本研究顯示，聯合檢測NMP22與CK20mRNA在未明顯降低特異度的基礎上，大大提高了診斷的敏感度。其特異度與尿細胞學檢測相差較小，而敏感度卻遠高于尿細胞學檢測，因而聯合檢測較單一指標的檢測對膀胱腫瘤復發(fā)監(jiān)測具有更高的診斷價值。其次，NMP22檢測方法簡單，可以在一般實驗室里進行，而RT－PCR檢測也是實驗室常用的方法。因此，作者認為，聯合檢測NMP22與CK20mRNA因其無創(chuàng)且敏感度、特異度較高，可用于膀胱腫瘤復發(fā)監(jiān)測，陰性患者繼續(xù)觀察，陽性患者再行膀胱鏡檢查，減輕患者痛苦。但聯合檢測NMP22與CK20mRNA仍不能完全替代膀胱鏡檢查，需要進一步研究以尋求更為理想的膀胱腫瘤標志物。

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