于 斌 葛邦國 和法濤 吳茂玉* 劉光鵬

（1.棗莊學院生命科學學院，山東棗莊277160；

2.中華全國供銷總社濟南果品研究院，山東濟南250014）

1 苦瓜降血糖活性成分提取方法

1.1 皂苷的提取

1.1.1 傳統(tǒng)浸提法

水和乙醇常作為天然產(chǎn)物的浸提劑，在提取分離植物活性成分方面多有報道[1,2]。將鮮苦瓜切碎、晾干、粉碎成苦瓜粉，乙醇回流浸提即可得到皂苷提取液，為進一步分離皂苷可以將乙醇回收，然后用石油醚、正丁醇萃取，再經(jīng)甲醇、丙酮除雜后，即得苦瓜粗皂苷樣品[3]。乙醇溶液浸提苦瓜皂苷已被很多研究人員所采用[4，5]，這種方法直接從苦瓜中提取皂苷，使用了較多的有機溶劑，程序較為復雜?？喙显碥找部稍诳喙匣钚晕镔|(zhì)的綜合利用中提取。以水作為溶劑，在一定溫度下，將苦瓜粉加熱、回流，使有效物質(zhì)得到充分浸提，再用乙醇沉淀多糖類物質(zhì)，過濾分離，沉淀和濾液經(jīng)精制、純化后分別為苦瓜多糖和苦瓜皂苷[6]，這種方法可有效利用原料、提高產(chǎn)出和效率，具有進一步推廣的價值。

1.1.2 超聲/微波輔助提取法

在眾多的提取技術(shù)中，超聲波輔助提取作為一種輔助提取技術(shù)應用較為廣泛?？喙霞毎诔暡óa(chǎn)生的強烈振動度以及強烈的空化效應下被破壞，有利于有機溶劑在其細胞中的滲透，從而提高苦瓜皂苷的提取率。李健等[1]選擇超聲時間、超聲溫度和超聲功率為試驗因素，以總皂苷提取量為考察指標，通過單因素和正交試驗對超聲波輔助提取苦瓜皂苷的工藝條件進行了優(yōu)化，其所得結(jié)果為超聲時間40min、超聲溫度50℃、超聲功率450W。陳志強等[7]利用響應面法對超聲提取苦瓜皂苷的工藝條件進行了優(yōu)化，他發(fā)現(xiàn)，最佳工藝條件為：超聲時間41min，超聲溫度62℃，超聲功率402W。兩種提取條件差異不大，可見超聲輔助提取可以有效的推廣。

隨著近年來提取工藝的不斷進步和創(chuàng)新，微波輔助提取技術(shù)成為最為廣泛應用的提取技術(shù)之一。該技術(shù)是通過微波輻射使苦瓜植物細胞內(nèi)的極性物質(zhì)（主要是水分子）吸收微波能，從而產(chǎn)生較多熱量，迅速提高苦瓜植物細胞內(nèi)的溫度。細胞內(nèi)的液態(tài)水在較高溫度下被氣化，較高的壓力將細胞膜和細胞壁沖破，再繼續(xù)加熱，使得細胞內(nèi)部和細胞壁進一步失水，細胞收縮，表面出現(xiàn)裂紋，便于有機溶劑滲透入苦瓜細胞，使其更容易地從中提取出苦瓜皂苷，從而大大提高了苦瓜皂苷的浸提效率。高文等[8]應用微波輔助技術(shù)提取苦瓜皂苷，得到的微波提取最佳工藝參數(shù)為微波功率750W，提取時間10min。實驗結(jié)果表明，微波提取法能夠大大提高苦瓜植物細胞中苦瓜皂苷的提取率。李健[9]通過試驗也得出了類似的結(jié)論。將微波提取技術(shù)作為一種輔助手段在苦瓜皂苷的提取中進行應用，不但能夠提高浸提效率，而且還能夠減少投資、節(jié)省時間、節(jié)省能源、減少環(huán)境污染等。因此，在現(xiàn)在的提取工藝中，常將微波與有機溶劑相結(jié)合應用，可以有效地提高苦瓜皂苷的提取效率。

1.1.3 酶提取法

酶法在植物活性成分提取方面應用較多，植物中含有纖維素及淀粉，將活性成分包裹起來，這對活性成分的釋出產(chǎn)生很大的干擾作用，用酶降解纖維素及淀粉有利于活性成分的釋出。復合酶法、纖維素酶法、淀粉酶法、糖化酶法都可以用于植物活性成分的提取[10]。這類方法是將未成熟的新鮮苦瓜，洗凈去籽并制成勻漿，然后加入適量的蒸餾水進行稀釋，用檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液調(diào)pH值，加入酶適量，于恒溫水浴鍋中加熱，使活性物質(zhì)充分浸提[11]。酶提取法選用酶液（一般是果膠酶和纖維素酶為主體的復合酶）來分解構(gòu)成細胞壁和細胞質(zhì)間的果膠質(zhì)、纖維素和半纖維素，使其疏松、膨脹、崩潰，從而增大了有效成分的擴散面積，減小了傳質(zhì)阻力，提高了有效成分的得率。影響因素有加酶量、料水比、提取溫度、pH值等。酶解提取條件溫和，減少了活性物質(zhì)的損失和溶劑消耗。

1.1.4 超臨界提取法

超臨界提取是在超臨界狀態(tài)下，將超臨界流體與待分離的物質(zhì)接觸，使其有選擇性地把極性大小、沸點高低和分子量大小不同的成分依次萃取出來。張中偉[12]利用超臨界CO2提取苦瓜總皂苷，他發(fā)現(xiàn)該法的最佳工藝條件為萃取壓力25.5MPa、溫度42.5℃、夾帶劑用量180mL。超臨界CO2法具有工藝簡單、萃取溶劑無毒、能耗低、易回收、所得產(chǎn)品具有純度高的優(yōu)點，彌補了傳統(tǒng)工藝溫度高、受熱時間長而使某些皂苷含量降低甚至損失殆盡的缺陷。然而該法生產(chǎn)成本高、所需設(shè)備復雜、不易清洗和修理，所以其推廣應用范圍仍然受到一定制約。

1.1.5 其他潛在提取方法

除了以上提及的苦瓜皂苷提取方法，還有一些用于其他種類皂苷的提取方法也可用于苦瓜皂苷的提取。半仿生提取法即模擬口服給藥及藥物經(jīng)胃腸逆轉(zhuǎn)運的原理，將原料先用一定pH值的酸性水提取，再以一定pH值的堿水提取，提取液分別過濾、濃縮，制成相關(guān)產(chǎn)品。宋宏新等[13]采用半仿生-α-淀粉酶酶解提取三七皂苷，相對乙醇回流法、酶解法、發(fā)現(xiàn)半仿生-α-淀粉酶酶解提取三七皂苷的方法經(jīng)濟有效，但還未見用在苦瓜皂苷的提取中。

1.2 苦瓜黃酮的提取工藝

1.2.1 傳統(tǒng)浸提法

利用黃酮類化合物與混入的雜質(zhì)極性不同，選用不同溶劑萃取，可達到精制純化的目的。這是目前國內(nèi)外使用最廣泛的方法，很容易實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。甲醇、乙醇和丙酮是最常用的黃酮類化合物提取溶劑，但由于甲醇、丙酮等有毒，因此一般采取乙醇為提取劑。郭育東等[14]以乙醇為溶劑回流提取苦瓜總黃酮，研究表明在乙醇濃度80%，提取時間2h，提取溫度70℃，料液比1:12的條件下總黃酮的提取率最高，可達1.51%。李淑玲[15]選取非離子型表面活性劑用于協(xié)同提取苦瓜中的總黃酮，她發(fā)現(xiàn)Tween-80對苦瓜中總黃酮的提取具有較好的協(xié)同作用，且居各影響因素首位。這主要是由于表面活性劑改變了苦瓜粉的表面張力，從而使得其更易于被浸潤，使得黃酮成分有效提出。

1.2.2 超臨界萃取法

由于超臨界CO2萃取技術(shù)具有操作條件溫和、分離容易、提取速度快、提取物純度高、活性成分和熱敏成分不易被破壞等優(yōu)點，己成功地應用于多種天然產(chǎn)物有效成分的提取[16，17]。謝建華[18]利用利用響應面法優(yōu)化超臨界CO2萃取苦瓜總黃酮的工藝參數(shù)，采用無水乙醇為夾帶劑（4mL/g），萃取壓力33.14MPa、萃取溫度46℃、萃取時間53.2min。此條件下，苦瓜總黃酮提取率達到84.13%，且具有很好的抗氧化性。超臨界技術(shù)還用于苦瓜葉中黃酮的提取，具體提取條件如下：以用量為1:1（V:m）的95%乙醇浸潤1h，夾帶劑體積與原料質(zhì)量比2:1，CO2流量22L/h、萃取壓力28MPa、萃取溫度44℃，萃取時間150min[19]。二者萃取條件的差異可能由原料不同所致。

1.2.3 超聲波/微波輔助提取法

微波提取技術(shù)因其有提取時間短、溶劑用量少及提取效率高等優(yōu)點受到關(guān)注。李星彩[20]在萃取苦瓜中黃酮類化合物的過程中利用功率400W微波輔助萃取苦瓜黃酮，該方法萃取時間短、成本低、產(chǎn)品易分離。類似的方法也被用于苦瓜葉中黃酮類物質(zhì)的提取，李憲平[21]研究苦瓜葉的微波法提取總黃酮，僅微波照射2.5min就能顯著提高黃酮的提取率。李廣利[22]比較了乙醇提取和微波提取苦瓜葉中黃酮的工藝差別，乙醇提取時間4h，而微波提取時間僅為3min，從時間及成本等方面考慮微波法值得推廣采用。不同微波萃取條件不同，這主要與所采用的設(shè)備、有機溶劑使用濃度等因素有關(guān)。

近年來，超聲技術(shù)已應用于提取植物中的生物堿、苷類、生物活性物質(zhì)等研究。其原理主要是利用超聲波在液體中的空化作用加速植物有效成份的浸出提取。郭青枝[23]研究苦瓜黃酮的超聲波提取工藝，最佳條件為超聲波功率80W，提取時間20min，提取液為體積分數(shù)90%的乙醇溶液，料液比1:30(g:mL)。并與傳統(tǒng)提取法進行了比較，結(jié)果表明，超聲波提取苦瓜黃酮優(yōu)于傳統(tǒng)提取法，具有省時、高效的優(yōu)點。其他關(guān)于苦瓜黃酮的超聲波提取研究較少，可以借鑒大豆異黃酮[24]、銀杏葉黃酮[25]的提取方法。

1.2.4 其他潛在方法

由于黃酮苷類物質(zhì)易溶于水，所以對黃酮苷類物質(zhì)含量較高的原料，可以采取熱水提取法。在提取過程中要考慮加水量、浸泡時間、煎煮時間及煎煮次數(shù)等因素[26]。此工藝成本低、安全，適合工業(yè)化大生產(chǎn)，但由于水具有較大極性，易把糖類、蛋白質(zhì)等溶于水的成分提取出來，給進一步分離帶來許多麻煩。但是因為消耗溶劑的成本比其他浸提方法低，設(shè)備簡單，仍為一種可取的浸提方法。2-苯基色原酮作為黃酮類物質(zhì)（多羥基化合物）的母核，當其在堿性條件下，苯基色原酮1、2碳之間的C-O鍵打開成查耳酮型結(jié)構(gòu)，此物能夠溶于水；當在酸性條件下時，查耳酮即可恢復原來的閉環(huán)結(jié)構(gòu)，所以可用堿水提取。堿液提取時，所用堿的濃度不宜過高，以免在強堿條件下加熱破壞黃酮類化合物的母核。常用的堿性溶液是NaOH、Ca(OH)2水溶液。堿性水中的NaOH浸出能力較高，但是雜質(zhì)較多，不利于純化；石灰水有利于純化但浸出效果不如氫氧化鈉好。這些方法都可以用于苦瓜黃酮的提取，但由于提取物中成分較為復雜，因此要根據(jù)實驗目的綜合考慮[27,28]。

1.3 苦瓜多糖的提取

1.3.1 傳統(tǒng)浸提法

苦瓜多糖的傳統(tǒng)做法是溶劑浸提法，因其操作簡單，成本低廉，受到廣泛的采用。其關(guān)鍵流程多糖的水提醇沉，該法利用多糖溶于水不溶于體積分數(shù)60%以上乙醇的性質(zhì)，先用熱水浸提苦瓜中的多糖，經(jīng)濃縮后用60%（v/v）乙醇沉淀得多糖。關(guān)于苦瓜多糖浸提的研究報道基本上是圍繞著溫度、時間、pH值和料液比等因素進行條件優(yōu)化。黃婧等[29]建立了提取苦瓜多糖的的數(shù)學模型，確定了最優(yōu)提取條件。她認為影響苦瓜粗多糖提取率的因素大小的順序為溫度、pH值、水料比和提取時間。劉金福等[30]進行了類似的研究，發(fā)現(xiàn)料水比1:20，浸提溫度100℃，浸提時間1h時提取率較高。

綜合各種文獻的情況，提取過程中還需注意的是原料的預處理形式與方法，這對于苦瓜多糖的提取也是較為重要的，應在進一步的研究中予以考慮。

1.3.2 超聲波與微波輔助提取法

超聲波的振動能與微波的加熱能也可用于提取大分子物質(zhì)。李宏睿[31]與單斌[32]分別采用正交實驗設(shè)計和響應面法實驗設(shè)計優(yōu)化了超聲波輔助提取苦瓜多糖，二者提取時間差異較大，這可能與采用的處理溫度有關(guān)，一般溫度較高時間較短，另外所采用的儀器也可能是導致差異的原因之一。相對于超聲波提取方法，微波提取苦瓜多糖的研究較少，袁媛[33]研究了微波輔助水提醇沉法萃取苦瓜多糖，確定萃取工藝為料液比為1:20，浸提時間為25min；微波功率為600W。這與傳統(tǒng)浸提法、熱回流法等相比所用時間短、萃取效率高。多糖的提取也可以采用超聲波-微波協(xié)同提取的工藝，這樣可以兼具兩種方法的優(yōu)點[34，35]。

1.3.3 酶提取法

提取多糖常用的酶有纖維素酶、蛋白酶、果膠酶和混合酶，其作用原理是使細胞壁和細胞間質(zhì)中纖維素和果膠降解，從而有利于多糖的溶出[36]。吳笳笛[37]在苦瓜水溶性多糖的提取及脫蛋白實驗過程中分別加入纖維素酶和中性蛋白酶，通過正交優(yōu)化實驗確定其最佳水解條件分別為：纖維素酶用量5%，提取溫度50℃，pH值6.0；中性蛋白酶用量10%，水解時間48h，pH值7.0。通過雙酶法與常規(guī)法的比較表明，雙酶法提取水溶性苦瓜多糖，不僅使提取的工藝條件更為溫和，并且多糖的產(chǎn)率及含量均有顯著提高。酶法也可與其他方法聯(lián)合使用，以提高多糖的提取效率。張利芳[38]確定了纖維素酶協(xié)同超聲波法提取苦瓜多糖的最佳工藝條件，通過建立二次回歸模型，認為纖維素酶協(xié)同超聲波法是提高苦瓜多糖得率的有效途徑。

1.3.4 其他潛在方法

采用超濾膜技術(shù)對多糖進行分級和濃縮，收率高、對多糖生物活性的破壞小，又沒有傳統(tǒng)有機溶劑法的試劑殘留問題，目前該方法普遍成為活性多糖研究的重要手段[39]。陳靈等[40]采用截留相對分子質(zhì)量為20000的中空纖維超濾膜，分離和濃縮靈芝多糖，可將發(fā)酵液中多糖濃縮近10倍。超濾技術(shù)還用于其他植物多糖的提取[41,42]，因此也可用于苦瓜多糖的提取。多糖提取過程中小分子糖是影響多糖純度的主要因素之一，因此可以利用酵母菌發(fā)酵的方法去除單糖及雙糖等寡糖，而多糖含量基本保持不變的原理，使多糖的純度大幅提高，達到分離多糖的目的[43]。

2 苦瓜降血糖成分的評價

2.1 細胞反應方面的苦瓜降糖活性評價

胰島素是體內(nèi)主要的降血糖激素，由胰島β細胞分泌，主要作用于肝臟、骨骼肌和脂肪組織，調(diào)控糖、脂肪、蛋白質(zhì)三大營養(yǎng)物質(zhì)的代謝和貯存。苦瓜活性成分通過保護胰島β細胞，改善胰島素抵抗，從而達到降糖作用。

苦瓜活性物質(zhì)對STZ損傷的胰島β細胞株（HIT-T15）有明顯的修護作用。修復效果與藥物作用成份和藥物濃度都有關(guān)系?？喙显碥諏σ葝uβ細胞保護作用最明顯，苦瓜皂苷與多糖的混合物次之，多糖最低[44]。苦瓜傷流液對胰島 β 細胞株（HIT-T15）也有保護作用，其降糖機制與修復受損胰島細胞、刺激胰島素分泌相關(guān)[45]。苦瓜莖皂苷對STZ損傷的胰島廇細胞株（RIN-m5F）有明顯的修護作用[46]?？喙霞捌溆行С煞帜芊乐够蚰孓D(zhuǎn)四氧嘧啶對胰腺β細胞造成的自由基損傷，阻止胰島功能下降，從而對糖尿病起到防治作用?？喙系拇朔N作用與其抗氧化活性相關(guān)，但又不只是依靠抗氧化活性[47]。何新益[48]以SMC-7721肝癌細胞為模型細胞，發(fā)現(xiàn)苦瓜水提物對PPARδ和PPARγ受體有激活作用。

2.2 酶反應方面的苦瓜降糖活性評價

人類日常的飲食攝取以淀粉為主，其次為蔗糖，淀粉水解首先在胰α-淀粉酶作用下分解為寡糖，寡糖通過小腸上皮細胞刷狀緣處α-葡萄糖苷酶作用于α-1,4糖苷鍵水解形成葡萄糖。α-葡萄糖苷酶抑制劑是一類口服降糖藥物，它能夠延緩腸道碳水化合物吸收，減緩葡萄糖的生成及吸收，緩解高胰島素血癥，降低餐后高血糖，從而減少高血糖對胰腺的刺激，提高胰島素的敏感性，保護胰腺，改善并預防糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生和發(fā)展，以及治療因碳水化合物代謝紊亂而引起的疾病。

王琪等[6]建立了超聲-微波法連續(xù)提取苦瓜皂苷和多糖的工藝，他發(fā)現(xiàn)苦瓜皂苷和多糖對α-糖苷酶均具有不同程度的抑制作用，且分別呈現(xiàn)顯著量效關(guān)系，其IC50值分別為1.03mg/mL和10.73 mg/mL，苦瓜皂苷的抑制活性相當于陽性對照阿卡波糖的1/3。田力東[49]比較35個苦瓜品種的果肉和籽粒中皂苷含量及其對α-葡萄糖苷酶活性抑制作用的差異。不同品種的苦瓜果肉和籽中皂苷含量及其對α-葡萄糖苷酶抑制能力差異較大。35個苦瓜品種可以分為4大類群，各類群中苦瓜果肉和籽粒中的皂苷含量與其對α-葡萄糖苷酶抑制作用的相關(guān)性不顯著，其原因既可能在于不同品種皂苷組成成分不同，也可能在于不同組織部位中皂苷組分存在差異。陳林[50]發(fā)現(xiàn)不同方法制備的苦瓜根提取物對α-葡萄糖苷酶的抑制活性是不同的，其中利用水提取的抑制作用是最強的。

2.3 動物實驗的苦瓜降糖活性評價

在研究苦瓜降血糖活性的過程中，利用高血糖動物模型是必要的。常用的高血糖動物模型主要有4種，即自發(fā)性遺傳動物模型、化學物質(zhì)誘導動物模型、轉(zhuǎn)基因動物模型和胰腺部分切除動物模型。目前自發(fā)性遺傳性動物模型多被國外作為對高血糖的研究采用的動物模型[51]，但自發(fā)性遺傳性動物模型對動物的品系、種屬及飼養(yǎng)與繁殖條件的要求嚴格，另外該模型價格昂貴且能提供給實驗所需的數(shù)量有限，因此在實際應用上受到了一定的限制。具備來源廣泛，誘發(fā)簡便的化學性高血糖動物模型成為當前應用較廣泛的模型。

李原[52]研究苦瓜水提取物與苦瓜渣對實驗性糖尿病小鼠空腹血糖、糖耐量、血液各項生化指標的影響，發(fā)現(xiàn)兩者均能降低實驗性糖尿病小鼠的血糖值，且水提取物效果較好。苦瓜醇提取物對II型糖尿病小鼠的降血糖作用，苦瓜醇提取物可降低II型糖尿病小鼠的血糖，改善糖耐量，但也可導致血清白蛋白降低，臨床上應用時應加注意[53]?？喙隙嗵菍μ悄虿⌒∈笥忻黠@的降血糖作用，影響胰島素分泌，使胰島素抵抗指數(shù)顯著升高，胰島素敏感指標顯著降低[54]。董英[55]比較了苦瓜水提多糖和苦瓜堿提多糖對糖尿病小鼠的降糖效果，大分子量苦瓜多糖的降糖效果較好，其機制可能是通過減弱STZ對胰島β細胞的損傷或改善受損β細胞的功能，從而起到調(diào)節(jié)血糖的作用。李健[1]通過研究得出苦瓜總皂苷對高血糖模型的小鼠具有顯著降低血糖作用以及抗氧化能力的恢復作用，且高劑量組在降血糖作用和恢復抗氧化能力的效果較好。柴瑞華[56]認為苦瓜總皂苷對患有腎上腺素性高血糖小鼠和四氧嘧啶性糖尿病家兔具有較好的降血糖效果，但對血糖正常小鼠及四氧嘧啶性糖尿病家兔的胰島素無明顯影響。苗明三[57]認為苦瓜總皂苷對小鼠腎上腺素所致高血糖模型、四氧嘧啶性糖尿病模型、胰島素抵抗模型、大鼠鏈脲佐菌素糖尿病模型均有較好的療效。盛清凱[58]用苦瓜降糖多肽-P將患有高血糖的小鼠進行注射，模型鼠的血糖和血清胰島素均降低，胰島素敏感指數(shù)及肝糖原、肌糖原含量增加，總膽固醇、高密度脂蛋白及甘油三酯下降?？喙隙嚯?P對患有Ⅱ型糖尿病模型大鼠的血糖血脂具有降低作用。

3 結(jié)束語與展望

我國對苦瓜的研究起步較晚，加之苦瓜降血糖活性成分種類繁多，結(jié)構(gòu)復雜，給相關(guān)研究帶來一定的難度和挑戰(zhàn)，提取分離方法會直接影響苦瓜活性的數(shù)量和質(zhì)量，各種方法有利有弊，需要不斷探索尋找更加高效、環(huán)保的方法，比較不同提取方法時不應局限于工藝參數(shù)和得率，還應涉及到多糖的純度、結(jié)構(gòu)和生物活性，兩種或多種方法的聯(lián)合使用往往能達到較好的提取效果?？喙辖笛浅煞值幕钚栽u價方法主要集中在酶、細胞和動物方面的方法，關(guān)于人體實驗的研究還應進一步加強，從而真正的將苦瓜應用于糖尿病的治療中。

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