謝仁卓瑪, 張立成

(1.青海省海南州畜牧獸醫(yī)工作站,813000；2.青海省動物檢疫站，810007)

豬氣喘病，又稱豬支原體肺炎，豬地方性肺炎，是由豬肺炎支原體（Mycolasma hyopneumoniaw，Mhp）引起的一種豬慢性、接觸性呼吸道傳染病，具有氣喘和咳嗽、患病豬只生長緩慢和發(fā)育不良等特點(diǎn)。Mhp經(jīng)常與圓環(huán)病毒等其他肺部病原體混合感染，易造成更大的經(jīng)濟(jì)損失。本研究從發(fā)病豬病料中分離、鑒定獲得了1株豬肺炎支原體，為該病病原研究提供了基礎(chǔ)。從豬喘氣病病例中分離得到1株病原菌，對病原菌進(jìn)行分離培養(yǎng)、姬姆薩染色、致病性及攻毒再分離等鑒定，確定分離到的病原菌為豬肺炎支原體，并命名為Bz1株。

1 材料與方法

1.1病料的采集和處理 病料采集于某豬場疑似患有豬喘氣病的豬肺部，用研磨法對肺部組織進(jìn)行處理。取1 g病變與健康肺臟交界處的組織剪碎，按1:1比例加入生理鹽水，用研缽充分研磨，并用0.45μm的濾膜過濾，收集濾液。操作應(yīng)在無菌條件下進(jìn)行。

1.2培養(yǎng)用培養(yǎng)基 采用的是KM2豬肺炎霉形體培養(yǎng)基。液體培養(yǎng)基配方：乳清蛋白水解物10.0 g，新鮮酵母浸出物20.0 g，Eagles氏液1000.0 mL，Dulbecco磷酸緩沖液600.0 mL；健康豬血清400.0 mL，0.4%酚紅3.5 mL，1%的醋酸鉈25.0 mL，青霉素40萬IU，pH為7.4～7.6。加入1%瓊脂粉即可制成固體培養(yǎng)基。

1.3菌株分離 將1.1收集的濾液，按1:5的比例加入KM2培養(yǎng)基中，37℃靜置培養(yǎng)3 d～7 d，觀察其培養(yǎng)基顏色變化和透明度情況。當(dāng)培養(yǎng)基顏色呈現(xiàn)透亮的黃色時，劃線接種固體培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)7 d～10 d，觀察菌落生長情況。

1.4染色并鏡檢 本研究用姬姆薩染色法進(jìn)行染色。姬姆薩染料0.6 g溶解于50 mL甘油中，55℃水浴2 h，再加50 mL靜置1d以上，濾膜過濾后即得姬姆薩染液原液，染色前每60 mL蒸餾水中加一滴原液，制成姬姆薩染色液。培養(yǎng)物制成涂片，自然干燥，用甲醇固定3min（或用火焰固定），再用磷酸鹽緩沖液（pH7.2）稀釋20倍的姬姆薩染液染色3h水洗，丙酮浸染，然后鏡檢。

1.5菌株的致病性試驗(yàn) 將經(jīng)培養(yǎng)試驗(yàn)和姬姆薩染色鑒定呈陽性的豬肺炎支原體新鮮培養(yǎng)物5 mL直接氣管注射3頭健康豬，同時設(shè)2頭健康豬作為陰性對照。攻毒后按常規(guī)飼養(yǎng)，飼料中無抗生素。攻毒后28 d內(nèi)逐日觀察，攻毒后28 d剖檢試驗(yàn)豬。

1.6攻毒豬病變肺中支原體的再分離 用1.3的方法從攻毒豬病變肺中進(jìn)行豬肺炎支原體的再分離，并用1.4和1.5的方法進(jìn)行鑒定。

2 結(jié)果

2.1菌體分離及培養(yǎng)結(jié)果 分離菌株培養(yǎng)3d后，培養(yǎng)液開始呈現(xiàn)黃色并保持透亮，肉眼觀察可見細(xì)小的懸浮物出現(xiàn)。固體培養(yǎng)基上可觀察到圓形凸起、表面粗糙、邊緣整齊的菌落。

2.2染色及鏡檢結(jié)果 取培養(yǎng)物涂片，經(jīng)姬姆薩染色染色，可觀察到球狀、環(huán)狀、橢圓形或兩極型、單個或聚集的菌體，無雜菌污染。

2.3致病性試驗(yàn)攻毒豬出現(xiàn)咳嗽、喘氣等臨床癥狀，攻毒28 d后剖檢攻毒豬，肺部出現(xiàn)典型豬支原體肺炎病變。

2.4攻毒豬病變肺中支原體的再分離 將攻毒豬肺按1.3的方法再分離豬肺炎支原體，傳代培養(yǎng)后顯示pH值下降，涂片染色鏡檢發(fā)現(xiàn)具有支原體特征的菌體。

3 討論

豬喘氣病病原菌豬肺炎支原體的分離鑒定工作非常困難，由于其營養(yǎng)要求高且生長緩慢，往往被豬鼻支原體、絮狀支原體、滑液支原體掩蓋。本研究采用KM2培養(yǎng)基進(jìn)行分離和培育，該培養(yǎng)基營養(yǎng)成分豐富、檢出率高、方便實(shí)用。本研究采用研磨法對病料進(jìn)行處理，可以使豬肺炎支原體更多的暴露在培養(yǎng)基中，與剪碎法、灌洗法、勻漿法相比，雖然研磨法對豬肺炎支原體生長影響比較大，但是檢出率高，因此選用研磨法處理豬肺炎支原體病料是首選方法。本研究分離到的該病原菌，經(jīng)培養(yǎng)特征、形態(tài)觀察、鏡檢、致病性、攻毒再分離等試驗(yàn)，確定分離株為豬肺炎支原體，命名為豬肺炎支原體Bz1株。本研究也充分驗(yàn)證了科赫法則的理論，即一種病原微生物必然存在于患病動物體內(nèi)；此病原微生物可從患病動物分離得到純培養(yǎng)物；將分離出的純培養(yǎng)物人工接種敏感動物時，必定出現(xiàn)該疾病所特有的癥狀；從人工接種的動物可以再次分離出性狀與原有病原微生物相同的純培養(yǎng)物。豬肺炎支原體是豬呼吸道疾病綜合癥的一種原發(fā)性病原，能引起豬地方流行性肺炎。分離獲得該病的具有致病力毒株將對該病的發(fā)病模型建立提供基本材料。

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