楊 睿,張素輝,徐登峰,許國洋,付利芝

（1.重慶市畜牧科學(xué)院,重慶 榮昌 402460）

化膿隱秘桿菌（Arcanobacterium pyogenes）屬于隱秘桿菌屬成員,是一種條件性致病菌。該菌主要寄生在牛、羊及野生反芻動物的上呼吸道、消化道等黏膜處,常與大腸桿菌、連球菌等混合感染,導(dǎo)致家畜發(fā)生肺炎、關(guān)節(jié)炎、皮下膿腫、流產(chǎn)、死胎等現(xiàn)象,同時也可能引起人感染致病,給人類健康帶來了重大的威脅[1-2]。

近年來,三峽庫區(qū)養(yǎng)羊業(yè)的發(fā)展迅速,從外地大量引進優(yōu)良羊種;由于庫區(qū)95%的面積由丘陵和山脈組成[3],養(yǎng)殖生產(chǎn)條件良莠不齊,外加冬季陰冷潮濕,夏季高溫高濕,使得各類疾病一直散發(fā)流行。由于養(yǎng)殖條件艱苦一些在外界少有暴發(fā)的疾病,也在庫區(qū)陸續(xù)發(fā)現(xiàn)。此研究針對三峽庫區(qū)主要的山羊養(yǎng)殖區(qū)縣對化膿隱秘桿菌的流行情況進行調(diào)查。

1 材料及方法

1.1 病料的采集 2014年3月至2016年12月間在三峽庫區(qū)各地采集肺炎和淋巴結(jié)化膿病料。

1.2 細菌的分離鑒定

1.2.1 細菌學(xué)檢查 在無菌環(huán)境下將病料接種在含10%小牛血清TSA瓊脂培養(yǎng)基上,細菌純化后進行革蘭染色,并鏡檢。

1.2.2 PCR檢測 挑取純單個菌落至10%小牛血清TSA液體培養(yǎng)基中培養(yǎng),37℃,120 r/min,培養(yǎng)24 h,采用OMEGA Bacterial DNA Kit試劑盒提取細菌基因組,引物為自行設(shè)計的特異性引物[4],進行PCR。

1.2.3 致病性試驗 對鑒定為陽性的病原進行致病性試驗,選取健康的昆明系小鼠進行腹腔注射,攻毒組（n=5）每只小鼠注射0.1 mL,濃度為1×109CFU/mL-1的菌液,健康組（n=5）每只小鼠注射0.1 mL的營養(yǎng)肉湯,觀察接種后小鼠的癥狀。

2 結(jié)果

2.1 病料的采集 從三峽庫區(qū)的巫山、云陽、忠縣、石柱、豐都、武隆地區(qū)共采集病料72份。其中肺炎病料57份,淋巴結(jié)化膿病料14份。

2.2 病原菌的分離鑒定 通過純化培養(yǎng)、鏡檢和特異性PCR,共分離到5株化膿隱秘桿菌,其中從肺炎病料中分離到化膿隱秘桿菌3株,分離率為5.26%（3/57）,從淋巴結(jié)化膿病料中分離到化膿隱秘桿菌2株,分離率為14.28% （2/14）。見圖1。

圖1 細菌分離株革蘭染色結(jié)果（1 000×）

2.3 PCR檢測結(jié)果 使用化膿隱秘干菌特異性引物對分離菌株進行PCR擴增,均能擴增出1 378 bp的片段（圖2）,測序后在GenBank上進行比對,與化膿隱秘桿菌（FN39498）的相似性大于99%。

圖2 PCR擴增結(jié)果

2.4 致病性試驗的結(jié)果 組1和組2的攻毒菌來自淋巴結(jié)化膿病料,組3、組4和組5的攻毒菌來自肺炎病料,組6為健康對照組。接種細菌的小鼠在24 h后出現(xiàn)精神萎靡,反應(yīng)遲鈍等癥狀,并在4 d后開始出現(xiàn)死亡,2周后組1與組3的死亡率最低,均為20%,組2的死亡率最高為80%,健康對照組中的小鼠均正常（表1）。

表1 分離菌對小鼠的攻毒結(jié)果

3 討論

化膿隱秘桿菌是一種條件性致病菌,在外界條件發(fā)生變化時容易引起動物發(fā)病。但是以往關(guān)于化膿隱秘桿菌引起疾病的報道主要集中在牛上[5],多呈零星的散發(fā)狀態(tài),關(guān)于山羊化膿隱秘桿菌的研究較少。然而三峽庫區(qū)是一個高溫高濕地區(qū),整體經(jīng)濟情況落后,養(yǎng)殖條件艱苦,為各種疫病的流行創(chuàng)造了天然的條件。在此項研究中,我們重點研究了化膿隱秘桿菌在三峽庫區(qū)的自然感染情況。從2014年3月至2016年12月,共收集到山羊肺炎病料57份,淋巴結(jié)化膿病料14份,通過分離鑒定共收集到5株有毒力的化膿隱秘桿菌,其中從肺炎病料中分離到3株,分離率為5.26%（3/57）,從淋巴結(jié)化膿病料中分離到化膿隱秘桿菌2株,分離率為14.28% （2/14）。這個比列遠遠高于預(yù)想,而且由于庫區(qū)的養(yǎng)殖條件和氣候條件,實際情況或許更為嚴重。因此對三峽庫區(qū)動物疫病的監(jiān)測不應(yīng)該只局限于當(dāng)前主要的流行疾病,各地獸醫(yī)主管部門也應(yīng)該對一些易發(fā)的條件性疫病進行監(jiān)測。