曲向陽,孫英軍,張洪亮,周 磊,劉媛媛,任夫波,賴清華,夏 天,周明明,楊漢春

（1.中國農業(yè)大學動物醫(yī)學院,北京 海淀 100193;2.環(huán)山集團股份有限公司養(yǎng)豬事業(yè)部,山東 青島 266000;3.中國農業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所,黑龍江 哈爾濱 150069）

豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS）是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）引起的以母豬繁殖障礙、保育育肥豬呼吸道癥狀與高死亡率為主要特征的病毒性傳染病。1987年美國最早報道此病[1],1996年郭寶清等從流產胎兒中分離到PRRSV,證實我國存在PRRSV感染[2]。2006年,我國暴發(fā)以高熱、高發(fā)病率與高死亡率為特征的“高熱病”,童光志等從全國12個省市的豬場分離到以NSP2缺失90個核苷酸為特征的PRRSV變異株[3]。2012年以來國內陸續(xù)分離到與美國NADC30毒株同源性很高的毒株[4],統(tǒng)稱為類NADC30毒株（NADC30-like）,NADC30-like重組毒株和變異株的不斷出現(xiàn)[5-6],給該病的防控帶來了巨大的挑戰(zhàn)。

PRRSV基因組全長約15 kb,至少包括10個開放閱讀框,其中 ORF1a、ORF1b編碼非結構蛋白,ORF2a-ORF7編碼結構蛋白。ORF5基因編碼的GP5蛋白是PRRSV中變異性最大的結構蛋白,常作為流行病學調查與遺傳演化分析的研究對象。本研究對2014-2017年山東部分地區(qū)96個規(guī)模化豬場的236份PRRS疑似樣品進行檢測,并對陽性樣品進行ORF5基因測序及遺傳進化分析,以期闡述山東省規(guī)?；i場PRRS的流行及病毒變異趨勢,為PRRS防控提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 病料采集與處理 2014-2017年間從山東部分規(guī)?；i場（主要分布區(qū)域:煙臺、威海、青島、濰坊、臨沂、淄博、日照、濱州等）采集236份疑似PRRSV感染病豬的肺臟、淋巴結、脾臟等病料,將組織研磨均勻,取一部分提取RNA,其余樣品在-80℃保存。

1.2 主要試劑 RNeasy plus Mini Kit,購自Qiagen公司;AMV反轉錄酶、dNTPs、LA Taq DNA聚合酶和pMD18-T,載體等,購自TaKaRa公司;Gel Extraction Kit,購自OMEGA公司;TG1感受態(tài)由本實驗室制備。

1.3 引物設計 根據GenBank中的登錄的PRRSV NADC30（JN654459）的基因序列,針對ORF5序列利用Oligo6.0設計一對引物用于PRRSV的檢測和測序。引物序列由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

1.4 PRRSV的ORF5基因擴增與測序 取300 μL研磨后的組織上清液,提取總RNA,經下游引物PRRSV-ORF5-R反轉錄獲得cDNA。PCR反應程序為:94℃ 2 min;94℃ 30 s、55℃ 30 s、72℃ 1 min,共35個循環(huán),72℃ 10 min。對PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳,用Gel Extraction Kit對目的片段進行回收,純化后的PCR產物克隆到pMD18-T載體中。重組克隆由上海生工生物工程技術服務有限公司進行測序。

表1 ORF5引物序列

1.5 PRRSV遺傳演化分析 利用MEGA5.1軟件的Cluster W對GenBank中11株代表性PRRSV和檢測到的122株PRRSV的ORF5核苷酸序列比對,并利用Neighbor-joining Method對其進行了遺傳演化分析,bootstrap數(shù)為100。

1.6 PRRSV ORF5核苷酸序列及推導氨基酸序列分析 利用DNAStar 7.1軟件包中的MegAlign分析ORF5基因核苷酸同源性及推導氨基酸序列的同源性。分析代表性毒株GP5推導氨基酸的遺傳變異。

2 結果

2.1 PRRSV RT-PCR檢測結果 對2014-2017年豬場疑似PRRSV的236份樣品進行檢測,共122份PRRSV陽性,RT-PCR結果見圖1,總體陽性率51.7%。2014年共檢測123份,58份陽性,陽性率47.2%;2015年共檢測14份,3份陽性,陽性率21.4%;2016年共檢測54份,23份陽性。陽性率42.6%;2017年共檢測45份,38份陽性,陽性率84.4%。各年度PRRSV陽性率差異與樣品的選擇有關。

圖1 部分病料樣品ORF5片段的RT-PCR檢測結果

2.2 ORF5基因的遺傳演化分析 利用MEGA5.1軟件對GenBank中的11株PRRSV代表性毒株和所檢測的122株PRRSV進行遺傳演化分析,結果顯示,本研究所有PRRSV毒株均為美洲型,全部屬于Lineage 1、3、5 和8 （圖2）。 本研究中,以VR-2332為代表的 Lineage 5毒株 44株（占 36.1%）,以HuN4為代表的Lineage 8毒株19株（占15.6%）,以QYYZ為代表的Lineage 3毒株2株（占1.6%）,以NADC30為代表的Lineage 1毒株57株（46.7%）。表明山東省 PRRSV存在4個 Lineage的毒株,其中以 Lineage 1、Lineage 5和 Lineage8的毒株為主要流行毒株（表2）。此外,2014年檢測到的Lineage 1的一個分支與美國Minnesota 14同源性最高,且在進化樹中處于同一分支,預示這類毒株可能由美國引入,這16份樣品均來自于同一個養(yǎng)豬體系,在小區(qū)域內流行,但并沒有在我國廣泛流行,本研究是首次報道我國存在這類PRRSV毒株。

表2 2014-2017年山東地區(qū)不同PRRSV毒株的檢出率

2.3 ORF5基因核苷酸序列及其推導氨基酸序列分析 將所測序的ORF5基因序列與VR-2332、HuN4、QYYZ、Minnesota 14 及 NADC30 進行序列比對,所檢測PRRSV ORF5核苷酸序列同源性與氨基酸同源性分別是:78.9% ～99.7%,73.7% ～99.5%（表3）。Lineage 1中的分離株與NADC30和Minnesota 14的核苷酸和氨基酸同源性最高,分別為84%～96.2%,84.3% ～94.3%和85.2% ～97.4%,78.9% ～96.9%。Lineage 3中的分離株與QYYZ的核苷酸和氨基酸同源性最高,分別為97.2% ～97.7%,98.0%～98.5%。Lineage 5中的分離株與VR-2332的核苷酸和氨基酸同源性最高,分別為97.6%～99.0%,95.9% ～99.4%。Lineage 8中的分離株與HuN4的核苷酸和氨基酸同源性最高,分別為96.8% ～99.7%和96.0% ～99.5%。

將部分分離株ORF5基因的推導氨基酸序列比對顯示:信號肽區(qū) Lineage 1 10Y;Lineage 3 6S,14F,24S,25I;Lineage 5 16S;Lineage 8 9C,13R,23Y是各群獨有的特征（圖3）。胞外域Lineage 1 47I;Lineage 3 30S,32N,33G,38Y,39S,59N;Lineage 5 29A,92A;Lineage 8 35N,39I,94A為各群獨有的氨基酸（圖3）。跨膜域Lineage 1 124A;Lineage 3 66C,98A,101F,102H,117F,128V;Lineage 5 66S,101F,102V,121T,127F為各群獨有的氨基酸（圖 3）。胞內域Lineage 3 151K,152I,170G,191K,192I,196R,199H,200P;Lineage 5 137A,164R,185V,189I,200P;Lineage 8 161V,189L,200L為各群獨有的氨基酸（圖3）。

圖2 山東地區(qū)PRRSV ORF5遺傳進化樹分析

表3 與參考毒株的核苷酸及氨基酸相似性 （%）

圖3 ORF5基因推導的氨基酸序列比對分析

3 討論

1996年,我國首次分離到 PRSSV,并命名為CH-1a株。2006年,我國首次出現(xiàn)HP-PRRSV,隨后蔓延至全國各地,給我國養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的經濟損失。在隨后的幾年里,我國先后報道了QYYZ-Like毒株,NADC30-Like毒株等各種新出現(xiàn)的PRRSV[7]。為研究山東省PRRSV的流行狀況,在2014-2017年我們對山東省部分規(guī)?；i場的PRRSV進行了跟蹤檢測,對陽性樣品進行ORF5的測序與遺傳演化分析,分析了山東省存在的PRRSV ORF5基因遺傳變異。

PRRSV分為2個基因型,基因1型（歐洲型）和基因2型（美洲型）。我國主要流行PRRSV為美洲型。ORF5遺傳演化分析表明:山東省流行的PRRSVs主要為4個Lineages,分別是以類NADC30為代表的Lineage 1,以QYYZ為代表的Lineage 3,以VR-2332為代表的Lineage 5和以HuN4為代表的Lineage 8。其中Lineage 5與Lineage 1分別占比36.1%與46.7%,為主要流行毒株。2014-2017年間,Lineage 8（HP-PRRSV）的檢出率在逐年下降,而Lineage 1（類NADC30）檢出率在顯著升高,Lineage 5的檢出率較穩(wěn)定。2017年所檢測到的38份陽性樣品中,有23份為Lineage 1（類NADC30毒株）,占比60.5%,14份為 Lineage 5（類 VR-2332毒株）,占比36.8%,說明類NADC30毒株流行越來越廣泛。目前商品化的疫苗對NADC30毒株的交叉保護性不佳[8],故對該毒株需要給予特別關注。類VR-2332 PRRSV高檢出率可能與經典株PRRSV MLV疫苗的廣泛應用有關。Lineage 3是2012年新出現(xiàn)的毒株,主要流行于我國南方各豬場,且廣泛存在（21.3%,32/150）[9],該類毒株（GM2 和QYYZ）為弱毒疫苗與野毒重組的新型重組毒株[10]。近年來,隨著南方的集團化養(yǎng)豬企業(yè)在北方各省建場及后備母豬引種,該類毒株開始在北方出現(xiàn),但尚未成為主流毒株,其致病性與HP-PRRSV類似,但在未免疫豬場該毒株會造成較大損失。此外,本研究在2014年檢測到Lineage 1的Minnesota 14分支毒株可能由美國引入,該類毒株可能不適應本地環(huán)境,尚沒有在我國廣泛流行,但是并不代表這類毒株會在中國消失殆盡,一旦這類毒株發(fā)生變異,有可能再次在中國出現(xiàn)和流行,引起新的疫情,因此有必要加大對這類毒株的監(jiān)測。

ORF5基因是研究PRRSV遺傳演化的重要靶向目標之一。本研究中測得的122條ORF5基因與參考毒株 VR-2332、HuN4、QYYZ、Minnesota 14 和NADC30的序列比對發(fā)現(xiàn),ORF5基因遺傳變異較大,尤其是Lineage 1的毒株。各亞群ORF5基因推導氨基酸比對發(fā)現(xiàn),各亞群PRRSV毒株在ORF5基因的進化上具有保守性,在ORF5的信號肽區(qū)、胞外域、跨膜域和胞內域各亞群毒株具有各自獨特的氨基酸特征[11]。

本研究對2014-2017年山東省部分規(guī)?；疨RRSV ORF5基因進行了詳細的分析,闡釋了山東省近年來流行的4個Lineage的PRRSVs,并分析了各亞群PRRSV ORF5基因的分子特征,豐富了山東省PRRSV的流行病學數(shù)據,為區(qū)域化PRRS的防控與凈化提供了科學依據。